Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (Grad IV Gliom) ist eine sehr aggressive Krebs beim Menschen mit einem medianen Überleben von 1 Jahr nach der Diagnose. Trotz der erhöhten Verständnis der molekularen Ereignisse, die Anlass zu Glioblastomen geben, bleibt dieser Krebs immer noch sehr resistent gegen herkömmliche Behandlung. Die chirurgische Resektion von hochgradigen Hirntumoren ist selten vollständig aufgrund der stark infiltrative Art von Glioblastomzellen. Therapeutische Ansätze, die daher Glioblastomzellinvasion zu dämpfen ist eine attraktive Option. Unser Labor und andere haben gezeigt, dass Tumor-assoziierten Makrophagen und Mikroglia (resident Gehirn Makrophagen) gezeigt stark Glioblastom-Invasion zu stimulieren. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird , verwendet Glioblastom-Makrophagen / Mikroglia Interaktion zu modellieren mit in – vitro – Kultur – Assays. Dieser Ansatz kann die Entwicklung und / oder Entdeckung von Medikamenten erheblich erleichtern, die die Kommunikation mit den Makrophagen zu stören, dass diese bösartige behav ermöglichtIOR. Wir haben zwei robuste Kokultur Invasionsassays eingesetzt, wo eine Mikroglia / Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren – das 10-fache. Glioblastoma-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker markiert oder konstitutiv ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden ohne und mit Makrophagen / Mikroglia auf matrix-beschichteten Polycarbonat Kammer Einsätze überzogen oder in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Zellinvasion durch Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie Bild bewertet und nur invasive Zellen auf der Unterseite des Filter zählen. Unter Verwendung dieser Assays mehrere pharmakologische Inhibitoren (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib und Semapimod) identifiziert wurden, die Makrophagen blockieren / stimuliert Mikroglia Glioblastom-Invasion.
Introduction
Glioblastoma multiforme ist eine aggressive menschliche Gehirn Krebs mit einer medianen Überlebenszeit von ca. 12 Monaten ab dem Zeitpunkt der Diagnose 1,2. Das Glioblastom ist eine der tödlichsten und klinisch herausfordernden Krebserkrankungen, wie es zu einer Standard-Chemotherapie und chirurgische Resektion resistent ist. Die diffuse Natur des Glioblastoms ermöglicht es Tumorzellen während der gesamten normalen Gehirn so dass die fortgeschrittenen Tumor praktisch unmöglich, chirurgisch reseziert vollständig zu verbreiten. Diese hochinvasive Aspekt ist ein Markenzeichen Merkmal von Glioblastomen und anderen fortgeschrittenen Astrozytome. Daher hat sich der Schwerpunkt von viel Forschung war auf dem molekularen Mechanismus der Glioblastomzellinvasion. Das Glioblastom Tumor – Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der Malignität Festlegung 3-6. Tumor – assoziierte Makrophagen / Mikroglia wurden für die Förderung von Glioblastom – Invasion 7,8 verantwortlich sein gezeigt. Die meisten dieser Studien gemessen jedoch die Wirkung von Makrophagen / Mikroglia VerwendungAssays, die physisch von den Glioblastomzellen zu trennen. Unser Labor hat sich vorgenommen, verbesserte Tests zu erzeugen, die es uns erlauben, zu untersuchen, wie Glioblastom-Invasion auf Makrophagen / Mikroglia in Co-Kulturen abhängig ist und es uns ermöglichen, die dem Bild mit der physischen Interaktion zwischen ihnen während Invasion.
Klassische Assays Zellinvasion sind die "Standard" Boyden-Kammer-Chemotaxis und Chemoinvasion Formate zu messen. Hier werden die Zellen untersucht werden sollen, werden in einer Kunststoffkammer plattiert, die ein Polycarbonat-Filter auf der Unterseite enthält, die Poren einer bestimmten Größe (in der Regel zwischen 0,4 und 8 um im Durchmesser) aufweist. Der Prozess der Zellinvasion beinhaltet eine physikalische Barriere, in der Regel von extrazellulärem Matrix-Protein zusammengesetzt ist. In der Chemoinvasion Assay verwendet die bevorzugte Matrix ist Matrigel (nachstehend als "Matrix"), eine extrazelluläre Matrixmischung Protein sezerniert von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) -Zellen der Maus Sarkom und besteht weitgehend aus colLag Typ IV und Laminin. Die Kammern werden dann in einer Gewebekulturvertiefung gelegt, die mit oder ohne Wachstumsfaktoren Zellkulturmedien enthält, die im Verdacht stehen, Invasion zu stimulieren. Zellen, die eine höhere invasive Kapazität haben wird bei einer höheren Frequenz durch die extrazelluläre Matrix beschichtete Filter einzudringen und an der Unterseite des Filters anhaften. Wir haben diesen Test modifiziert, um die Rolle der Mikroglia und Tumor-assoziierten Makrophagen auf Glioblastomzellinvasion zu beurteilen.
Wir konnten in diesem Papier beschrieben unter Verwendung von Co – Kultur – Assays zu bestimmen , der die Mikroglia die Invasion von zwei Glioblastomzelllinien stimulieren kann von 5 bis 10 – fach 9,10. Dies spiegelt wider, was in Tiermodellen von Glioblastom beobachtet wird. Ferner entwickelten wir eine dreidimensionale Invasionsassay, wo die Wechselwirkungen zwischen Glioblastom-Zellen und Makrophagen / Mikroglia mehr direkt untersucht werden können. Das Ausmaß der Glioblastomzellinvasion durch macropha stimuliertges / Mikroglia im 3D-Test ist vergleichbar, was die Matrix beschichtete Kammer Ansatz gesehen verwendet. Ähnliche Tests wurden bisher entwickelten während Invasion 11-13 Mammakarzinoms Interaktionen mit Makrophagen zu untersuchen. Beide Methoden in diesem Dokument beschrieben werden, sollten in der Fähigkeit unterstützen, den molekularen Mechanismus (e) von Makrophagen / Mikroglia-stimulierten Invasion von Glioblastomzellen zu sezieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hoch invasive Art von hoher Astrozytomen und Glioblastomen machen diese Hirntumoren sehr tödlich. Es ist daher von größter Wichtigkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen der Glioblastom-Invasion zu verstehen. Es wurde viel über den Prozess der Glioblastom – Invasion bereits gelernt , 17. Unter Verwendung der Testformate in diesem Dokument detailliert, unser Labor hat in Maus und Mensch-Modelle gezeigt, die damit verbundenen Tumor Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren – das 10-fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
