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Cancer Research

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

doi: 10.3791/53990 Published: October 20, 2016

Abstract

Glioblastoma multiforme (Grad IV Gliom) ist eine sehr aggressive Krebs beim Menschen mit einem medianen Überleben von 1 Jahr nach der Diagnose. Trotz der erhöhten Verständnis der molekularen Ereignisse, die Anlass zu Glioblastomen geben, bleibt dieser Krebs immer noch sehr resistent gegen herkömmliche Behandlung. Die chirurgische Resektion von hochgradigen Hirntumoren ist selten vollständig aufgrund der stark infiltrative Art von Glioblastomzellen. Therapeutische Ansätze, die daher Glioblastomzellinvasion zu dämpfen ist eine attraktive Option. Unser Labor und andere haben gezeigt, dass Tumor-assoziierten Makrophagen und Mikroglia (resident Gehirn Makrophagen) gezeigt stark Glioblastom-Invasion zu stimulieren. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird , verwendet Glioblastom-Makrophagen / Mikroglia Interaktion zu modellieren mit in - vitro - Kultur - Assays. Dieser Ansatz kann die Entwicklung und / oder Entdeckung von Medikamenten erheblich erleichtern, die die Kommunikation mit den Makrophagen zu stören, dass diese bösartige behav ermöglichtIOR. Wir haben zwei robuste Kokultur Invasionsassays eingesetzt, wo eine Mikroglia / Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fache. Glioblastoma-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker markiert oder konstitutiv ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden ohne und mit Makrophagen / Mikroglia auf matrix-beschichteten Polycarbonat Kammer Einsätze überzogen oder in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Zellinvasion durch Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie Bild bewertet und nur invasive Zellen auf der Unterseite des Filter zählen. Unter Verwendung dieser Assays mehrere pharmakologische Inhibitoren (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib und Semapimod) identifiziert wurden, die Makrophagen blockieren / stimuliert Mikroglia Glioblastom-Invasion.

Introduction

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Glioblastoma multiforme ist eine aggressive menschliche Gehirn Krebs mit einer medianen Überlebenszeit von ca. 12 Monaten ab dem Zeitpunkt der Diagnose 1,2. Das Glioblastom ist eine der tödlichsten und klinisch herausfordernden Krebserkrankungen, wie es zu einer Standard-Chemotherapie und chirurgische Resektion resistent ist. Die diffuse Natur des Glioblastoms ermöglicht es Tumorzellen während der gesamten normalen Gehirn so dass die fortgeschrittenen Tumor praktisch unmöglich, chirurgisch reseziert vollständig zu verbreiten. Diese hochinvasive Aspekt ist ein Markenzeichen Merkmal von Glioblastomen und anderen fortgeschrittenen Astrozytome. Daher hat sich der Schwerpunkt von viel Forschung war auf dem molekularen Mechanismus der Glioblastomzellinvasion. Das Glioblastom Tumor - Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der Malignität Festlegung 3-6. Tumor - assoziierte Makrophagen / Mikroglia wurden für die Förderung von Glioblastom - Invasion 7,8 verantwortlich sein gezeigt. Die meisten dieser Studien gemessen jedoch die Wirkung von Makrophagen / Mikroglia VerwendungAssays, die physisch von den Glioblastomzellen zu trennen. Unser Labor hat sich vorgenommen, verbesserte Tests zu erzeugen, die es uns erlauben, zu untersuchen, wie Glioblastom-Invasion auf Makrophagen / Mikroglia in Co-Kulturen abhängig ist und es uns ermöglichen, die dem Bild mit der physischen Interaktion zwischen ihnen während Invasion.

Klassische Assays Zellinvasion sind die "Standard" Boyden-Kammer-Chemotaxis und Chemoinvasion Formate zu messen. Hier werden die Zellen untersucht werden sollen, werden in einer Kunststoffkammer plattiert, die ein Polycarbonat-Filter auf der Unterseite enthält, die Poren einer bestimmten Größe (in der Regel zwischen 0,4 und 8 um im Durchmesser) aufweist. Der Prozess der Zellinvasion beinhaltet eine physikalische Barriere, in der Regel von extrazellulärem Matrix-Protein zusammengesetzt ist. In der Chemoinvasion Assay verwendet die bevorzugte Matrix ist Matrigel (nachstehend als "Matrix"), eine extrazelluläre Matrixmischung Protein sezerniert von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) -Zellen der Maus Sarkom und besteht weitgehend aus colLag Typ IV und Laminin. Die Kammern werden dann in einer Gewebekulturvertiefung gelegt, die mit oder ohne Wachstumsfaktoren Zellkulturmedien enthält, die im Verdacht stehen, Invasion zu stimulieren. Zellen, die eine höhere invasive Kapazität haben wird bei einer höheren Frequenz durch die extrazelluläre Matrix beschichtete Filter einzudringen und an der Unterseite des Filters anhaften. Wir haben diesen Test modifiziert, um die Rolle der Mikroglia und Tumor-assoziierten Makrophagen auf Glioblastomzellinvasion zu beurteilen.

Wir konnten in diesem Papier beschrieben unter Verwendung von Co - Kultur - Assays zu bestimmen , der die Mikroglia die Invasion von zwei Glioblastomzelllinien stimulieren kann von 5 bis 10 - fach 9,10. Dies spiegelt wider, was in Tiermodellen von Glioblastom beobachtet wird. Ferner entwickelten wir eine dreidimensionale Invasionsassay, wo die Wechselwirkungen zwischen Glioblastom-Zellen und Makrophagen / Mikroglia mehr direkt untersucht werden können. Das Ausmaß der Glioblastomzellinvasion durch macropha stimuliertges / Mikroglia im 3D-Test ist vergleichbar, was die Matrix beschichtete Kammer Ansatz gesehen verwendet. Ähnliche Tests wurden bisher entwickelten während Invasion 11-13 Mammakarzinoms Interaktionen mit Makrophagen zu untersuchen. Beide Methoden in diesem Dokument beschrieben werden, sollten in der Fähigkeit unterstützen, den molekularen Mechanismus (e) von Makrophagen / Mikroglia-stimulierten Invasion von Glioblastomzellen zu sezieren.

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Protocol

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1. Fluoreszenzmarkierung von Zellen

HINWEIS: Label Glioblastomzelllinien und Mikroglia mit Fluoreszenzfarbstoffen 9. Alternativ erzeugen Zelllinien , die konstitutiv fluoreszierende Proteine wie GFP / RFP ausdrücken , wie in 14 beschrieben.

  1. 80% konfluent am Tag der Färbung - Plate Zellen auf einer 6-Well-Platte, so dass sie 70 sein. Für die Maus - Glioblastoma - Zelllinie GL261 und menschliche Glioblastomzelllinie U87, Platte 1 x 10 6 und 1,5 x 10 6 Zellen, die jeweils auf einer 6 cm - Schale 24 Stunden vor der Färbung.
  2. Bereiten fluoreszierende Zelle Fleck Farbstofflösung in DMSO und mit 5 uM Farbstoff zu Medien, entweder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) oder Makrophagen-Serum freiem Medium (MSFM), Vortex gut.
  3. Inkubiere die Zellen mit Farbstoff für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Entfernen Farbstoff enthaltenden Medien und fügen Sie frisches Medium (RPMI oder MSFM) zu den Zellen.
  5. Inkubiere Zellen für 30 min. Hinweis: Die Zellen sind jetztgebeizt und bereit, in Experiment verwendet werden.

2. Vorbeschichtete Matrix Kammer Cokultur Invasion Assay

  1. Differenzieren THP-1 - Zellen unter Verwendung von Phorbolmyristatacetat (PMA) 15.
    1. Platte 2 - 3 x 10 5 THP-1 - Zellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in einer 6 - Well - Kulturplatte. Unmittelbar nach 100 nM PMA bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden hinzufügen Ausplattieren und Inkubieren.
      HINWEIS: Nach 48 Stunden THP-1-Zellen, die eine Differenzierung erfolgreich durchlaufen haben, werden adhärenten sein und auf eine runde Morphologie auf den Boden des Bohrlochs unter verbreiten.
    2. Entfernen PMA durch einmal mit 1x PBS gewaschen und ersetzen mit frischem RPMI / 10% FBS. Warten Sie weitere 48 Stunden, bis die Zellen bereit sind, in Assays verwendet werden.
  2. Äquilibrieren Matrix vorbeschichtet Kammern indem sie in einer Vertiefung mit 500 ul Medium allein (kein Serum) Plazieren und Zugabe von 500 & mgr; l Medium allein nach oben. Inkubieren Kammern für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
    Tabelle der Materialien / Ausrüstung.
  3. Um sanft Zellen lösen (fluoreszenzmarkierte Glioblastomzelllinien und die Mikroglia / Makrophagen), entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS und Inkubation für 5 - 10 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% Rinderserumalbumin (BSA).
  5. Zentrifuge für 5 min bei 120 x g.
  6. Absaugen Überstand und Pellet in MSFM / 0,3% BSA Medien (GL261 - Zellen und Mikroglia) oder RPMI / 0,3% BSA (für U87 und THP-1 - Zellen) , so daß die Konzentration der Zellen ist gleich 1 x 10 6 Zellen / ml . Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen.
  7. In 500 ul Medium / 0,3% BSA pro Vertiefung von 24-Well-Platte.
  8. Entfernen Medien von Kammern, die für mindestens 2 Stunden (Schritt 2.2) equilibriert wurden. Platz chambers in gut 500 ul Medium / 0,3% BSA (Schritt 2.7) enthält.
  9. Wenn Inhibitoren verwendet werden, um ihre Wirkung auf die Makrophagen zu studieren / Mikroglia stimuliert Gliom Invasion, fügen Sie die entsprechende Konzentration sowohl an den unteren und oberen Abschnitte der Kammer.
    HINWEIS: Die Konzentrationen von CSF-1R eingesetzten Inhibitor vollständig kann 9 in Bezug finden Mikroglia stimuliert GL261 Glioblastom - Invasion zu verhindern.
  10. In Abhängigkeit von den verwendeten Zelllinien, fügen Sie Zellen in die obere Kammer, wie in den nächsten beiden Schritten beschrieben: Maus Glioblastom (2.10.1) und humanen Glioblastom (2.10.2).
    1. Mix 1,5 x 10 5 GL261 (Glioblastom) Zellen (150 & mgr; l) und 5 x 10 4 Maus Mikroglia (50 ul) (siehe Schritt 2.6 für Medien Details). Bringen Volumen auf 500 ul durch Zugabe von 300 & mgr; l MSFM / 0,3% BSA. Hinzufügen Zellmischung in die obere Kammer und inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden.
      HINWEIS: Murine Mikrogliazellen sind aus neugeborenen Mäusen isoliert, wie ich beschriebenn 1 6.

Mischungs 7,5 x 10 4 U87 (Glioblastom) Zellen (75 ul) und 2,5 x 10 & sup4 ; THP1 (Makrophagen) Zellen (25 ul). Bringen Volumen in 500 & mgr; l durch Zugabe von 400 & mgr; l RPMI / 0,3% BSA. Fügen Sie das Zellgemisch in die obere Kammer. Inkubiere Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Std.

  1. Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Bildanalyse.
    HINWEIS: Experiment kann in 1x PBS in diesem Moment und gespeichert für die Bildgebung pausiert. Fluoreszenzfarbstoff-Signale können für bis zu 2 Wochen nach der Fixierung nachgewiesen werden.

3. Invasion Assay "3D" Embedding Gliom und Makrophagen / Mikroglia in Matrix

  1. Thaw Matrix Mischung über Nacht bei 4 ° C. Führen Sie alle weiteren Manipulationen unter Verwendung von Matrix auf Eis in der Haube.
  2. Herstellung von 10 mg / ml Konzentration von Matrix in Medien (MSFM oder RPMI) mit 0,3% BSA auf Eis.
    HINWEIS: Auf Konzentration von Matrix ist typischerweise bei etwa 15 mg / ml.
  3. Zur Herstellung von Zellen (mit der Bezeichnung in Schritt 1) ​​für die Aufhängung in der Matrix, entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS zu den Zellen und inkubiere für 5 - 10 min in Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% BSA.
  5. Zentrifuge für 5 min bei 120 x g.
  6. Absaugen Überstand von Pellets. Pellet in Medium / 0,3% BSA , so dass die Konzentration der Zellen auf 1 × 10 6 Zellen / ml entspricht. Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen.
  7. Hinzufügen 1,5 x 10 5 GL261 - Zellen (in 150 & mgr; l) + 5 × 10 4 Mikroglia - Zellen (in 50 & mgr; l) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 2 x 10 5 GL261 - Zellen (200 ul) in einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die GL261-Zellen allein ohne Mikroglia dient als Kontrolle.
  8. Spin-Zellen in Mikrofuge für 5 min bei 120 x g.
  9. Die Zellen in 200 ul kalten Matrix auf dem Eis.
  10. Tafel 50 & mgr; l (50.000 Zellen) auf die Mitte des oberen Abteil von 8 um Porengröße Raumeinsatz.
  11. bei 37 ° C inkubieren 30 min für die Polymerisation stattfindet.
  12. Mit 200 & mgr; l serumfreiem Medium in die obere Kammer und 700 & mgr; l Serum, das Zellwachstumsmedium mit dem unteren gut.
  13. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden.
  14. Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 for Bildanalyse.

4. Imaging-Assays

  1. Entfernen Kammern von 3,7% Formaldehyd und waschen in gut frisch 500 ul 1x PBS enthält.
    HINWEIS: Verwenden Sie Kammern nicht trocknen lassen.
  2. Mit einem Wattestäbchen reinigen sanft die nicht-invasive Zellen aus dem oberen Teil des Filters (Seite die Innenseite der Kammer zugewandt ist) durch die Filteroberfläche kratzen. Beginnen Sie sanft und erhöhen den Druck nach. Tun Sie dies mindestens 3 mal pro Kammer.
  3. Legen Kammern entweder in einem Glasbodenschale oder lassen in einer 24-Well-Platte.
  4. Legen Sie Probe auf der Bühne eines Epifluoreszenz oder konfokalen Laser-Fluoreszenz - Mikroskop mit Kamera und Bildaufnahmesoftware 9,10.
  5. Nehmen Sie mehrere 10X oder 20X Bilder von repräsentativen Bereichen.
  6. Verwendung einer Bildanalysesoftware, wie ImageJ, zählen die Anzahl der Glioblastom - Zellen , die den Filter an der Unterseite 9,10 überschritten haben.
  7. Wenn die Abbildung der "3D. "Invasionstest (beschrieben in Abschnitt 3), eine Z - Stack Serie erzeugen ein fluoreszierendes Laser konfokalen Mikroskop 5-6 Verwendung Um das Bild der invasiven Zellpopulation an der Unterseite des Filters, folgen Sie dem Protokoll die Schritte 4,2-4,6 oben beschrieben.

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Representative Results

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Mit den Methoden, die hier skizziert haben wir gezeigt, dass Mikroglia und Makrophagen im Wesentlichen Glioblastomzellinvasion stimulieren kann. Zwei verschiedene Invasionsassays eingesetzt werden und sind in Abbildung 1 dargestellt. In 2 GL261 - Zellen , die konstitutiv das fluoreszierende Protein exprimieren mCherry ausplattiert wurden auf vorbeschichteten Kammern mit und ohne Mikroglia für 48 Stunden. GL261-Zellen wurden minimal invasive auf ihre eigenen aber, wenn die Kultur mit Mikroglia die invasive Kapazität um etwa das 10-fache erhöht.

Wir beobachten eine ähnliche Wirkung menschlichen Zelllinien. In 3 U87 - Zellen (gefärbt mit 5-Chlormethylfluorescein diacetat (CMFDA) grün) zeigt 5-6 - fach höhere Invasion , wenn sie mit differenzierten THP-1 - Zellen cokultiviert. THP-1 ist eine menschliche monozytische Zellinie (abgeleitet von einer akuten monozytischen Leukämiepatienten), die di sein kann,fferentiated in einem Makrophagen-ähnlichen Zustand mit Phorbolmyristatacetat (PMA) 15. Differentiated THP-1-Zellen, zeigen viele der Eigenschaften von menschlichen Makrophagen wie Zytokinsekretion und die Fähigkeit Phagozytose auszuführen.

Alternativ kann die Zellinvasion durch sie diese direkt in einem Raumeinsatz auf den Filter in Matrix und Beschichtung Einbettung gemessen werden. Laser konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um eine Reihe von Bildern zu erzeugen, die eine dreidimensionale Darstellung erzeugt (Z-stack). Ähnlich dem , was in der Matrix beschichteten Kammer - Assay beobachtet wird (gezeigt in den Figuren 2 - 3), der Co - Kultur von Mikroglia (mit CMPTX rot gefärbt) stimuliert GL261 - Zellen (CMFDA grün) einzufallen , wie durch die Anzahl von Zellen gemessen , die gekreuzt an der Unterseite des Filters (Abbildung 4). Dieses Format hat den Vorteil, von potentiellen Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Glio visualisieren zu können,blastoma Zellen und Mikroglia während Invasion. Tatsächlich scheinen Mikroglia mit den Glioma - Zellen in 3D - Matrix (Abbildung 5) aufgehängt eng assoziieren. Wenn nur Endpunktanalyse erforderlich ist, und ein Laser konfokale ist nicht zur Verwendung zur Verfügung, Zellkammern gereinigt werden können, wie für die Matrix beschichtet Kammern beschrieben. Dann wird die Anzahl der verbleibenden (invasiv) Zellen können aus einem Standard - Epifluoreszenz - Mikroskop erhalten wird durch Zählen mit Bildern bestimmt werden. Film 1 zeigt die dreidimensionale Anordnung eines solchen Assays.

Abbildung 1
Abb . 1: Schematische Darstellung von zwei unterschiedlichen Protokolle zur Untersuchung Mikroglia / Makrophagen-stimulierte Glioblastoma Zellinvasion Top - Panel zeigt vorbeschichtet Matrix Kammer Invasionstest (Abschnitt 2). Das untere Feld zeigt 3D-Matrix Invasionstest (Abschnitt 3). Abbildung angepasst aus9. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Mikroglia (MG) Enhance GL261 Glioblastoma Zellinvasion. (A) Repräsentative Bilder von GL261 Zellen eindringende (exprimierenden mCherry) in Abwesenheit (links; GL261 allein) oder das Vorhandensein von Mikroglia (rechts; GL261 + MG) wurden vereinigt und plattiert auf Matrix beschichteten Kammern, gefolgt von einer Inkubation für 48 h und dann Auswertung der Anzahl von Zellen, die den Filter passiert haben. Bilder mit 10X-Objektiv genommen. Maßstabsbalken = 400 & mgr; M. (B) Quantifizierung der Assay nur invasive GL261 Zellen zu zählen (rot). Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. (C) Quantifizierung der Mikroglia-stimulierte GL261 invasion in der Presence von pharmakologischen Inhibitoren Gefitinib (5 uM), JNJ-28312141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM). Die gezeigten Daten sind Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. THP1 Makrophagen Enhance U87 Glioblastomzell Invasion. (A) Repräsentative Bilder von eindringenden U87 - Zellen , gefärbt mit CMFDA grün überzogen auf Matrix beschichteten Kammern allein (links; U87) oder mit differenzierten THP1 Makrophagen (rechtes Bild; U87 + THP1), gefolgt von Inkubation für 24 h und dann Bewertung der die Anzahl der Zellen, die den Filter passiert haben. Bilder, die ein 10X-Objektiv verwendet wird. Maßstabsbalken = 400 & mgr; M. (B) Quantifizierung der Testzählung nurinvasive U87-Zellen (grün). Die gezeigten Daten sind Mittelwert ± SEM aus zehn unabhängigen Experimenten.

Abbildung 4
. Abbildung 4. 3D - Invasion Assay von GL261 und Mikroglia Cokultur (A) Bilder gezeigt Projektionen aus einer Z-Serie von Bildern von GL261 - Zellen (gefärbt mit CMFDA grün) allein in der Matrix eingebettet (links; GL261) oder mit murine Mikroglia ( mit CMPTX rot markiert; rechte Tafel; GL261 + MG). Die Z-Vorsprünge waren der Boden 4 Scheiben des Bildstapel, die den Boden der Kammer Filter umfasst und stellt somit invasive Zellen. Maßstabsbalken = 200 & mgr; M. (B) Quantifizierung von GL261 - Zellen (grün) , der auf der Unterseite des Filters zu sein , wie oben beschrieben. Die Gesamtzahl der eindringenden GL261-Zellen wurde bestimmt und normalisiert auf die von GL261-Zellen in Monokultur. Die gezeigten Daten stellen den Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten, in zweifacher Ausfertigung (Abbildung 10 angepasst) durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Bild von einer Scheibe innerhalb des 3D - Stapel von GL261 (grün) und Mikroglia (rot) Cokultur Eingebettet in Matrix. GL261 und Mikroglia Zell - Wechselwirkungen sind mit weißen Pfeilen markiert. Maßstabsbalken = 100 & mgr; M.

Abbildung 1
Film 1:. Glioblastoma und Mikroglia - Interaktion in 3D - Rotation um die X - Achse eines 3D - Projektion der gesamten Z - Serie von Bildern von GL261 genommen (grün) und Mikroglia (rot) Co - Kultur in ma eingebettetTrix. Scheiben sind in 5 & mgr; M - Schritten. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen.

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Discussion

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Die hoch invasive Art von hoher Astrozytomen und Glioblastomen machen diese Hirntumoren sehr tödlich. Es ist daher von größter Wichtigkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen der Glioblastom-Invasion zu verstehen. Es wurde viel über den Prozess der Glioblastom - Invasion bereits gelernt , 17. Unter Verwendung der Testformate in diesem Dokument detailliert, unser Labor hat in Maus und Mensch-Modelle gezeigt, die damit verbundenen Tumor Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fache. Diese Co-Kultur-Modell repliziert getreulich die Fähigkeit von Glioblastomzellen physisch mit Makrophagen / Mikroglia in Wechselwirkung treten, die für parakrine und juxtacrine Wechselwirkungen erlauben würde (über Ligand-Rezeptor-Systeme wie Notch-Delta und Ephrin-EPH), die in eine bidirektionale Kommunikation zwischen der potenziell beteiligt sind Tumorzellen und Makrophagen. Andere Assay-Formate, die die Wirkung von Makrophagen auf Gliom-Zellinvasion zu entdecken suchen haben typischerweise die Zellenphysikalisch getrennt , wie die Makrophagen auf dem Boden der Vertiefung ausplattiert und die Glioblastomzellen sind auf der Kammer 3,4. Folglich zeigen diese Studien eine bescheidene Zunahme der Makrophagen-stimulierte Gliom Invasion (2-fach). Diese Co-Kultur-Test verbessert diese Wirkung (von 5 bis 10-fach) wahrscheinlich die Bedeutung der juxtacrine Interaktionen während Makrophagen anzeigt / Mikroglia stimuliert Glioblastom-Invasion.

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen umfasst mehrere Schritte, die sorgfältig zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen durchgeführt werden müssen. Wenn das Experiment hier wie beschrieben durchgeführt und keine eindringenden Zellen zu sehen sind, können sich die Fluoreszenzfarbstoff abgelaufen, die zu sehr schwach oder gar nicht vorhanden Färbung führen. Für die Invasion Assays, welche die vorbeschichteten Kammern verwendet wird, ist es wichtig, frische Invasion Kammern zu verwenden, die nicht über das Verfallsdatum sind und haben die ganze Zeit eingefroren, bis die Durchführung des Experiments gehalten. Chambers, die gelassen wurdengeführt bei Raumtemperatur über 12 h wurde gefunden, dass die Matrix Barriere nicht zufrieden stellend war nicht mehr intakt und bei einer viel höheren Frequenz eingedrungen Zellen als normal. Für die 3D-Test, ist es absolut entscheidend, alle Pipetten und Röhrchen auf Eis zu halten. Wenn bei Raumtemperatur für eine beträchtliche Zeitdauer, wird die Matrix polymerisieren und nicht verwendet werden können, um die Zellen darin zu suspendieren. Es wird empfohlen, ein kleines Tablett mit Eis gefüllt ist in der Haube verwendet, um alle Materialien zu halten, die in Kontakt mit der Matrix kommen. Das Protokoll kann modifiziert werden, um eine höhere Zelldichte zu umfassen, was jedoch die Länge der Zeit beeinflussen können, die optimale Wirkung auf Gliom invasion sehen erforderlich. Es wäre interessant zu sehen, ob andere Zelltypen in der Co-Kultur-Test hinzugefügt werden können und welche möglichen Auswirkungen können sie auf Invasion haben. Schließlich erkennen wir , dass das Gehirn - Mikroumgebung ist einzigartig und schwierig in vitro zu replizieren. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass die Invasion chhier fehlt ambers die typischen Komponenten des normalen Gehirns verwendet , die Glioblastom - Zellen während der Invasion (dh dicht gepackten Neuronen und Astrozyten) begegnen werden. Obwohl mit diesem Vorbehalt, die stimulierende Wirkung von Makrophagen / Mikroglia in diesem Assay ist konsistent mit dem, was in vivo beobachtet wird , und kann verwendet werden , um vorherzusagen , welche Inhibitoren und / oder Proteine mit diesem Prozess stören können.

der Tumor-Mikroumgebung in Kultur nachahmt ist eine schwierige Aufgabe, da, wie viele verschiedene Zelltypen und Matrixproteine ​​in Tumoren in verschiedenen Stadien der Malignität vorhanden sind. Noch einigermaßen genaue in vitro - Modelle von Tumor Wechselwirkung mit Komponenten des Mikroumgebung würde erheblich die Entdeckung neuer therapeutischer Möglichkeiten erleichtern. Es ist nun ersichtlich, daß Zellen, wie Makrophagen eine entscheidende Rolle in mehreren Aspekten mit der Progression zur Malignität einschließlich Angiogenese, Invasion, Immunumgehung und Arzneimittelresistenz assoziiert spielen. Die COCulture Invasionstest beschrieben verwendet hier das Verhältnis von Tumorzellen zu Makrophagen , die bei Patienten mit hochgradigen Glioblastome (ca. 3: 1; 5) beobachtet wird. Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Makrophagen / Mikroglia Glioblastom invasion stimulieren auf CSF-1R und EGFR-Signalisierung als pharmakologische Hemmung dieser Wege unter Verwendung JNJ-28.312.141, PLX3397 (CSF-1R) und Gefitinib (EGFR) stark abhängig ist, schwächt die Zunahme in Invasion 9. Weiterhin ist die Matrix eingebettete Assay verwendet wurde, wurde gezeigt , dass Semapimod, ein kleines Molekül bekannt Makrophagen und Mikroglia zu zielen, können auch Mikroglia Glioblastom invasion 10 stimuliert blockieren. Die Ergebnisse aus diesen Co - Kultur - Experimente gab den Anstoß , diese Verbindungen unter Verwendung von in - vivo - Modellen zu validieren. In Übereinstimmung mit Daten aus den in vitro - Assays in diesem Papier beschrieben, Blockade von CSF-1R mit dem Inhibitor PLX3397 (die die Blut - Hirn - Schranke überquert) weitgehend blockiert dieFähigkeit von GL261 Gliom - Zellen in den Gehirnen von C57BL / 6 - Mäuse 9 einzudringen. In ähnlicher Weise lieferte Semapimod in das Gehirn Invasion zu hemmen , wurde gezeigt und in stark verlängert das Überleben von Mäusen beherbergen GL261 Tumoren 10 mit Standard - Strahlenbehandlung zu synergieren. Beide Ansätze können wirksam in der Klinik beweisen.

Es ist nun auch ersichtlich , dass die Makrophagen - Systems für die Progression verschiedener Krebsarten ziemlich wichtig ist 3-6, 11-13 zu Malignität. Es wurde in der Brust und Gehirn Krebsmodellen, die Tumor-assoziierten Makrophagen entscheidend sind für die Tumorzellinvasion und Metastasierung eindeutig festgelegt. Zusätzlich sind wahrscheinlich Makrophagen zum Vermitteln immune escape als Makrophagen sehr wichtig zu sein (und Zellen von verwandten lineage wie dendritische Zellen) Funktion als professionelle Antigen - präsentierende Zellen , die 18 in Reaktion auf eine Infektion adaptive Immunität orchestriert. Es ist nun klar, dass eine der normalen physiological Funktionen des adaptiven Immunsystems ist durch die Zerstörung anomalen Zellen unkontrollierte Vermehrung zu verhindern. Immunität gegen die Tumorzellen, wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass die hoch mutagenen Natur der Krebszelle neo-Antigene erzeugt, die als fremd durch das adaptive Immunsystem erkannt werden. Tatsächlich der Prozess der "Immunevasion" wird postuliert, ein wichtiger Teil der Bösartigkeit zu sein, wie Krebszellen des Immunsystems (insbesondere zytotoxische Lymphozyten, natürliche Killerzellen und Entzündungs ​​Makrophagen) zu verhindern, müssen von den Tumor zu zerstören. Es ist der Assay in diesem Papier wird erleichtert die Untersuchung von Glioblastom Wechselwirkung mit Makrophagen und möglicherweise ermöglichen die Expansion der Fragetypen beschrieben hoffte man über malignem Krebs ansprechen können in - vitro - Kultur - Assays verwendet wird .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix Corning/Fisher Scientific Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) Life Technologies 12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye Life Technologies/Molecular Probes C34552
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies/Molecular Probes C2925
GL261 cell line National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line American Tissue Type Culture Collection HTB-14
THP-1 cell line American Tissue Type Culture Collection ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml) Life Technologies/Gibco 11875-093
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. Corning CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS) Life Technologies Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisherscientific BP1600-100
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific 15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich P8139-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion
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Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).More

Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).

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