Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.
Protocol
ועדת האתיקה UQAM אישרה הפרוטוקולים הללו, אשר נמצאים בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של סנט-לוק החולים של מונטריאול Universitaire Hospitalier מרכז (מונטריאול, קנדה). המשתתפים חתמו על טופס הסכמה מדעת.
הכנת בינוני 1. ובידוד של ראשי Villous Cytotrophoblasts
- הכן בינוני תרבות עבור cytotrophoblasts villous העיקרי האדם על ידי משלים בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 25 HEPES מ"מ, 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. מסנן המדיום מוכן באמצעות 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן סטריליים -20 ° C במקפיא aliquots של 50 מ"ל.
- לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל השליות טריות הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים 3.
- באמצעות צבת, להסיר את הקרום העובר מן הרקמה על ידי בעדינות לגרד אותו, תוך הקפדה שלא להסיר רקמות villous. תפסיק עם ההנותרים villi השליה בקוביות של כ -3 × 3 ס"מ באמצעות אזמל ומספריים. ביסודיות לשטוף עם מים המכילים 0.9% NaCl כדי להסיר דם אימהי.
- החזקת כל קוביה עם צבת, להסיר את הרקמה villous בקפידה מתוך כלי הנותרים ומספריים באמצעות רקמה סיבית.
- במשך 15 עד 30 מ"ג של רקמות villous, לעכל ארבע פעמים תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) טריפסין המכיל (מ -9.6 x 10 5 כדי 1.8 x 10 6 U; הריכוז הסופי 1.2 מ"ג / מ"ל) ו deoxyribonuclease אני (DNase אני) ( הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם רעד מתמשך.
הערה: השתמש 150 מ"ל בנפח כולל לעיכול הראשון, 100 מ"ל לעיכול השני ו -75 מ"ל לשני digestions הנותרים.
- אסוף את supernatant המכיל תאים מפוזרים צנטריפוגות ב 1,250 XG במשך 15 דקות ללא בלם. הסר את supernatant התאים resuspend ב 1 מ"ל של prewarmed DMEM המכיל1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- שכבת התאים המפוזרים על גבי 5% רציף - שיפוע סיליקה 70% polyvinylpyrrolidone מצופה (ראה לוח 1 עבור הכנת שיפוע) ו צנטריפוגות במשך 23 דקות ב 507 XG ללא בלם. הסר את שכבת הצפיפות בין 1,017 כדי 1,033 על ידי שאיפה לאסוף את השכבות בין 40% ו -50% השיפוע עם טפטפת חדשה. שטפו תאים נרחב עם 10 מ"ל של prewarmed DMEM המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
הערה: החלק שנאסף תואם צפיפויות בין 1.048 ו 1.062, אשר מטפחים trophoblasts. - ספירת התאים באמצעות hemocytometer. בקצרה, לערבב תאים ולהוסיף 10 μl בצינור microcentrifuge חדש. הוסף 10 μl של trypan כחול ומערבבים בעדינות שוב. צייר את ההשעיה התא למלא את תאי hemocytometer. ספירת התאים תחת מטרת 10X.
- מקום 1 x 10 6 ו -4.5 x 10 6 תאים לתוך צינורות נפרדים לשימוש בסעיפים 1.3 ו -2, בהתאמהly. זרעי התאים הנותרים בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים / גם במדיום DMEM בתוספת ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לכל היותר 4 ימים של ניסויים אחרים.
- באמצעות צבת, להסיר את הקרום העובר מן הרקמה על ידי בעדינות לגרד אותו, תוך הקפדה שלא להסיר רקמות villous. תפסיק עם ההנותרים villi השליה בקוביות של כ -3 × 3 ס"מ באמצעות אזמל ומספריים. ביסודיות לשטוף עם מים המכילים 0.9% NaCl כדי להסיר דם אימהי.
- הערכה הטוהרת cytotrophoblasts villous העיקרי המבודד
- ספין 1 x 10 6 של cytotrophoblasts טרי מבודדים צינורות microcentrifuge ב g 300 x. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של בופר פוספט prewarmed (PBS). תאים צנטריפוגה XG ב 300 ולהסיר PBS על ידי שאיפה.
- הוסף 1 מ"ל של מתנול קר לתאים דגירה ב -20 ° C במשך 20 דקות. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולהסיר מתנול על ידי שאיפה.
זהירות: השתמש מסכה מיכל, משקפי בטיחות וכפפות גומי בעת הטיפול מתנול. - הוסף 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר רעננותם תאים, צנטריפוגה XG ב 300 ולהסיר PBS על ידי שאיפה.
- דגירת תאי PBS המכילים FBS (1:50 [v / v] דילול) וכן FCRחסימת מגיב (1:10) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל מחייב ספציפי.
- שטפו פעמיים עם 500 μl של PBS בטמפרטורת החדר, תאים צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ולהסיר PBS על ידי שאיפה. תאים Resuspend ב 100 PBS μl בטמפרטורת החדר.
- דגירה תאים עם isothiocyanate והעמסת חד שבטיים העכבר (FITC) מצומדות אנטי אנושי cytokeratin-7 נוגדן שיבוט LP5K (1: 200) או נוגדן הלא ספציפית אלוטיפ בהתאמה PBS המכיל BSA 0.2% במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ב החושך. שטפו תאים PBS.
- לנתח את התאים על ידי זרימת cytometry 3. השתמש הכנות תא, מה שמראה על מינימום של 96% תאי CK-7-חיוביים על ידי cytometry זרימה עבור ניסויים נוספים.
2. Transfection siRNA של Cytotrophoblasts Villous הראשוני האדם
- Transfection של cytotrophoblasts villous העיקרי אנושי באמצעות מכשיר microporation
- כן 6 צלחות היטב המכילות2 מ"ל של מדיום בתוספת DMEM עבור הדגירה של תאים microporated.
- לאחר בידוד של cytotrophoblasts העיקרי (ראה סעיף 1.2), לקחת aliquot של התאים בתרחיף ולקבוע מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
- העבר 1.5 x 10 6 התאים לצינור microcentrifuge ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התאים עם 1 מ"ל PBS של Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant ו resuspend התאים בעדינות 100 μl של חיץ resuspension.
הערה: אל תשאיר את התא ההשעיה למשך יותר מ 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, על מנת למקסם את כדאיות התא ויעילות transfection. - להוסיף 300 ננוגרם של Syncytin-2 siRNA (או-מקושקשות שליטה siRNA) אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו לשאוב את התערובת תא-siRNA בעזרת פיפטה transfection 100 μl. לְהַכנִיספיפטה לתוך התחנה (ראה רשימה של חומרים) ובכפוף לתאים הדופק יחיד 1,300 V של 30 מילי-שניות.
- מיד להעביר את התאים 6 צלחות היטב (מוכן בשלב 2.1.1) המכיל 37 ° C טרום חימם בינוני בתוספת להימנע נזק לתאים.
- חזור על שלבי 2.1.5 ו 2.1.6 עבור הדגימות הנותרות.
- נער בעדינות את הצלחת למשך 30 שניות כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור humidified במשך 24 עד 48 שעות. רענן בינוני תרבות 24 שעות לאחר transfection.
- הערכה יעילה transfection על ידי ניתוח כתם מערבי (ראה צעדים 3 עד 6).
- Lipofection של siRNA ב cytotrophoblasts העיקרי האדם
- לאחר בידוד של cytotrophoblasts villous, זרע התאים בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים לכל היטב צלחות 6-היטב 2 מ"ל של מדיום תרבות דגירה במשך 18 שעות.
- לדלל 300 ng של Syncytin-2-הספציפי siRNA (או החזק את המקש מקושקשsiRNA) ו -5 μl של מגיב transfection השומנים מבוסס ב 1.5 מ"ל צינורות נפרדים בנפח כולל של 10 μl של המדיום antibiotic- ואת סרום ללא. דגירה במשך 5 דקות.
- מערבבים את ריאגנטים בדילול דגירה במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את מורכבות transfection. להוסיף 90 μl של המדיום antibiotic- ואת סרום ללא לתערובת כדי לנפח סופי של 100 μl.
- הסר בינוני תרבות מן 6 צלחות היטב (שלב 2.2.1). הוסף 2 מ"ל של מדיום חדש ותמהיל transfection 100 μl היטב כל אחד. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 24 עד 48 שעות. רענן בינוני תרבות 24 שעות לאחר transfection.
- הערכה יעילה transfection על ידי ניתוח כתם מערבי (ראה צעדים 3 עד 6).
3. הכנת Lysates מן התרבות התא כולו
- הסר את המדיה ולשטוף היטב כל (בצעדיו 2.1.8 ו 2.2.4) באמצעות DPBS מחומם מראש (Mg 2+, Ca 2 + חינם). לשאוב את DPBS ולהוסיף 500 μl של חומצה טריפסין 0.25% / ethylenediaminetetraacetic (EDTA). דגירה של 1-3 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. להפסיק את הטיפול טריפסין על ידי הוספת 500 μl של תקשורת צמיחה המכיל סרום.
הערה: נפח המדיה המתאימה השתמש בהתאם לסוג של הבקבוק / תבשיל: 1 מ"ל לכל 10 7 תאים / 100 מ"מ צלחת / 150 ס"מ 2 בקבוק; 0.5 מ"ל לכל 5 x 10 6 תאים / 60 מ"מ צלחת / 75 ס"מ 2 בקבוק. - העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, תאים גלולים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים בזהירות supernatant מבלי להפריע גלולה. מניחים את הצינור על הקרח. Resuspend גלולה ב 50-200 חיץ μl קר כקרח רדיו-Immunoprecipitation Assay (Ripa) (ראו טבלה 2 עבור הרכב חיץ) המכיל טרי להוסיףפרוטאז ed ומעכבי phosphatase בריכוז סופי 1x. בקצרה, מערבולת הצינור ולהשאיר על קרח למשך 30 דקות.
- ספין על XG 16,000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. בזהירות במקום צינור על הקרח. בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לצינור microcentrifuge מראש מקורר טרי כל זמן על קרח. וזורק את הכדור.
4. הכנת תמציות גרעיני תאים בתרבית
- עבור כל טוב (שלב 1.2.5), לשטוף cytotrophoblasts תרבותי פעמיים עם 1 מ"ל של טרום חימם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + חינם). לשאוב DPBS ולהוסיף 500 μl של 0.25% טריפסין / EDTA. דגירה של 1-3 דק 'ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור ולהפסיק טיפול טריפסין על ידי הוספת 500 μl של תקשורת צמיחה המכיל סרום.
- העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, תאים גלולים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. שוטפים את התאים עם DPBS (Mg 2+, Ca 2 + ללא) ותאי גלולה על ידי צנטריפוגהב XG 300 במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מוציא בזהירות את כל supernatant מבלי לשבש את הגלולה במקום הצינור על קרח.
- חלץ חלבון גרעיני פי הוראות היצרן. קביעת ריכוז חלבון של כל דגימה באמצעות assay כימות חלבון (ברדפורד או assay חומצה bicinchoninic (BCA)).
לדוגמא 5. הכנה אלקטרופורזה
- קביעת ריכוז חלבון לכל תמצית התא באמצעות assay כימות חלבון (למשל, ברדפורד 8 או BCA 9).
- על פי הוראות יצרן (אם נוגדנים יוכל לשמש בתנאי צמצום denaturation), להוסיף נפח שווה של חיץ מדגם 2x Laemmli (טבלה 2) 20-30 מיקרוגרם של חלבון כולל.
- מרתיחים lysates התא ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. Aliquot 50-100 μl של lysate להימנע מחזורי הקפאה / פשרה חזרו ולאחסן את הצינורות הנותרים ב -20 ° C לשימוש עתידי. בעוד דגימות חימום, להכין 1 ליטר של 1x הפעלת המאגר (טבלה 2).
- ספין הדגימות ב XG 16,000 במשך כמה שניות ומניחים אותם על קרח.
- טען כמות החלבון שווה לבאר כל ג'ל 12% SDS-PAGE (ראה טבלה 2 עבור רכב ג'ל), יחד עם סמן משקל מולקולרי. הרץ את הג'ל על 1 עד 2 שעות ב -100 V.
6. העברת חלבון מן הג'ל אל ממברנה
- הפעל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול 1 דקות ולשטוף עם פתרון מתנול חיץ העברת 1x / 10%. על פי הוראות היצרן, להעביר למשך 30 דקות עד 1 שעה תלוי בגודל החלבון.
הערה: יעילות העברה ניתן להעריך באמצעות מכתים Ponceau האדום לפני צעד החסימה.
7. נוגדן מכתים
- חסום את הממברנה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C באמצעות פתרון חסימת 5%.
- דגירה הממברנה עם נוגדנים נגד Syncytin-2 (4 מיקרוגרם / מ"ל; 1: 5,000) 6 או עם אנטי glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; 0.4 מיקרוגרם / מ"ל; 1: 500) בתמיסה חסימת 5% לילה בשעה 4 ° C (אנטי-Syncytin-2) או במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים שנאגרו מלוח טריס Tween (TBST; ראה טבלה 2 עבור רכב חיץ) במשך 5 דקות.
- דגירה הממברנה עם peroxidase חזרת המתאים (HRP), מצומדות ארנבת אנטי או נוגדן אנטי עכבר (1: 10,000) ב 5% חיץ חסימת TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים TBST במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף ב TBS. לזהות אותות באמצעות המצע הסופג מבוסס chemiluminescence.
8. Radiolabeling של גדילי יחיד oligonucleotide
- תגובת זירחון
- בתוך צינור microcentrifuge, להוסיף 50 ng של oligonucleotide קדימה יחד עם חיץ קינאז polynucleotide T4 1x, 1 UPolynucleotide T4 קינאז ו -20 μCi (γ- 32 P) ATP ולעשות את הווליום תגובה 20 μl עם מים nuclease חינם.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ 'EDTA. הפוך את הווליום עד 50 μl עם מים nuclease חינם.
- הסרת נוקלאוטידים מאוגדים מ oligonucleotides
- הכן עמודה G-25 equilibrated עם חיץ TE (טבלה 2) הבאים הוראות היצרן. מניחים את הטור ב צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge DNase ללא טריים.
- לאט לאט להוסיף 50 μl של חללית (משלב 8.1.2) על השרף, נזהר שלא להפריע מיטת השרף. ספין עבור 2 דקות ב 350 XG כדי לאסוף את דגימת מטוהרים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. לשטוף את העמודה G-25 עם 36 μl של מים ספין nuclease ללא במשך 2 דקות ב 350 XG כדי לאסוף אותו בצינור microcentrifuge.
- הכלאה עם ol גדיל משליםigonucleotide
- מעבירים את החללית רדיואקטיבי (86 μl) לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ולהוסיף 200 ננוגרם של oligonucleotide הפוכה 1x של חיץ חישול (טבלה 2). מחממים 5 דקות ב 95 ° C ולהשאיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר לקירור.
- הכן שאינם רדיואקטיביים oligonucleotides פעמיים תקועים על ידי הוספת 50 ננוגרם של תווית קדימה הפוכה oligonucleotides ו 1x של חיץ חישול צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם מים nuclease חינם. חום ולשמור בטמפרטורת החדר כמתואר בשלב 8.3.1.
הכנת 9. של ג'ל ללא denaturing polyacrylamide עבור Emsa
- כן ג'ל 4% ילידים (10 x 12 סנטימטרים) עם מסרק-שטח 1.5 מ"מ (ראה טבלה 2 עבור רכב ג'ל). יש לנקות את כל לוחות הזכוכית באמצעות מים מזוקקים.
הערה: זה קריטי, כי הצלחות להיות חופשיות לחלוטין של חומר ניקוי יוני, כמו SDS. - מיד pהפתרון שלנו acrylamide ב בין הצלחות ולאפשר פילמור כדי להמשיך (כ -30 דקות).
- להרכיב את מנגנון אלקטרופורזה ולמלא את המיכל עם TBE 0.5x. טרום להפעיל את הג'ל למשך 30 דקות עד 1 שעה ב 150 V לפני הטעינה המדגם.
תגובת 10. DNA Binding
- בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, להוסיף 10 מיקרוגרם של תמצית גרעיני (שלב 4.3) במאגר עקידת Shift 1x ג'ל (טבלה 2) ולעשות את הווליום הסופי עד 10 μl עם מים nuclease חינם. כביקורת, להכין צינור ללא תמצית גרעינית. עבור תגובת התחרות, להוסיף 1 μl של oligonucleotide שאינו ספציפי או ספציפי פעמים התקועות הקר (שלב 8.3.2).
- הוסף 1 μl של החללית רדיואקטיבי משלב 8.3.1 לתגובה כל. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הוסף 1 μl של חיץ טעינת ג'ל 10x לכל תגובה ולטעון כל דגימה על הג'ל מוכן בסעיף 9.
- הרץ את הג'ל על 1 1/2 עד שעה 2 ב 15לאחר ההגירה 0 V., לעטוף את הג'ל ואת הכוס על בניילון עמדה קלטת חשיפה להלן פוספור מסך. השאר קלטת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- הסר את המסך מתוך הקלטת החשיפה וכנס במכשיר ההדמיה זרחן לסריקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השליות טריות מן הריונות טווח שמשו לבודד cytotrophoblasts villous העיקרי אדם לנהל את מערך הניסויים שהוצגו באזור הפרוטוקול. בעקבות הבידוד שלהם, אנחנו ראשונים נתחו את טוהר cytotrophoblasts באמצעות השימוש בסמן cytokeratin-7 (איור 1). הכנות תא ובכך הוכתמו באמצעות נוגדן אנטי cytokeratin-7 חד שבטי. איור 1 מייצג תוצאות מניסוי טיפוסי הבא טיהור cytotrophoblasts villous העיקרי, ונותח על ידי זרימת תקן cytometry. בעקבות צעד שיפוע הצפיפות,> 97 תאי% (במקרה זה, 99%) הם מוכתמים חיוביים עבור cytokeratin-7 בניסויים רגילים, ובכך מפגין רמה גבוהה מאוד של יעילות בטיהור סוג תא זה.
לאחר בידודם, cytotrophoblasts העיקרי אדם יכול להשתמש בהם ישירות על transfection. שני פרוטוקולים שונים הוערכו, כלומר, microporation ו transfection שומנים מבוססים. פרוטוקולי שניהם נבדקו עם siRNA הספציפי Syncytin-2 mRNA ולעומת siRNA מקושקשת (שליטה שלילית). יעילות Transfection הוערכה הבא על ידי ניתוח כתם מערבי. תוצאות אשרו כי Syncytin-2 ביטוי הושתק משמעותי תמציות המופקות cytotrophoblast על microporation (איור 2). מצד השני, אין השתקה משמעותית צוינה כאשר siRNAs היה transfected ידי הגיב transfection שומנים מבוססים.
גם ערכנו ניסויים Emsa על cytotrophoblasts טרי מבודד. בדיקה רדיואקטיבי שמקורם מאזור האמרגן Syncytin-2 היה מסונתז. החללית מסונתז (המכונה WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') הוכח בעבר לאגד גורמי תעתוק הקשורות CREB 7. בנוכחות extr הגרעיני מעשים מ -24 ו -48 שעות cytotrophoblasts villous תרבותי, החללית Syncytin-2-derived-האמרגן הראו נוכחות של שני מתחמי חלבון דנ"א. תוספת של 100x oligonucleotide הקר WT התחרתה על ההיווצרות של המתחם, בעוד אין תחרות דומה עם עודף של oligonucleotide הקשור קר (עכבר העצבי קרסט Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') נצפתה, המאשרת את הספציפיות של שני האותות ( איור 3).
איור 1. הערכה של טוהר cytotrophoblasts villous הראשוני באמצעות cytometry זרימה. מבודדת טרי הכנות של cytotrophoblasts villous היו permeabilized ראשון ולאחר מכן שכותרתו עם נוגדנים לשלוט אלוטיפ (קו אדום) או חד שבטיים נוגדנים ספציפיים עבור cytokeratin-7 (קו שחור). תאים נותחו על ידי cytometry הזרימה. les / ftp_upload / 53,995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. השוואה של יעילות transfection siRNA בין transfection שומנים מבוססים ו microporation. Cytotrophoblasts villous המבודד טרי היה transfected עם 300 ננוגרם של Syncytin-2-ספציפי siRNA לעומת siRNA שליטה מקושקש באמצעות מגיב השומנים מבוססים או microporation. (א) ניתוח כתם המערבי בוצעו על תמציות הסלולר מכל מצב transfection באמצעות אנטי Syncytin-2 ונוגדנים אנטי GAPDH. (ב) Syncytin-2 רמות חלבון מן הניתוחים כתמים מערביים כומתו במונחים של עוצמת הלהקה הבאה נורמליזציה עם מקביל אותות GAPDH (ברי שגיאה מוגדרים SD, *** p <0.001). 5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מתחמי חלבון דנ"א זוהו באמצעות ניתוח Emsa. תמציות גרעיניות cytotrophoblasts villous העיקרי בתרבית למשך 24 או 48 שעות הודגרו עם בדיקת WT מתאימה לאזור אמרגן של Syncytin-2 עם או בלי עודף (100x) של ספציפי או ספציפי oligonucleotides קר. מתחמי DNA חלבון הופרדו על הגירה על ג'ל הילידים. אותות ספציפיים בדיקות חינם מסומנים בצד ימין של ג'ל. חללית WT וטופחה על ידי בהעדר התמצית הגרעינית גם שמשה כביקורת שלילית. CT NE = תמציות גרעיניות cytotrophoblast. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| % של סופי Percoll | נפח של Percoll (90%) (מ"ל) | נפח של HBSS (מ"ל) |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
טבלה 1. 5% -70% הגדרת שיפוע סיליקה מצופים polyvinylpyrrolidone.
| בַּלָם | הרכב | תגובות / תיאור |
| 1x PBS | 0.9 מ"מ CaCl 2, 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH 2 4 PO, 0.5 מ"מ MgCl 2, 136.9 מ"מ NaCl ו -0.8 מ"מ Na 2 HPO 4 | |
| מאגר ריפה | 150 מ"מ NaCl, 1.0% NP-40 או 0.1% טריטון X-100, deoxycholate נתרן 0.5%, 0.1% SDS (סולפט dodecyl נתרן), 50 mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| חיץ מדגם Laemmli | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% גליצרול, 0.004% bromophenol כחול, 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8 | |
| 10x הפעלת המאגר | 25 מ"מ טריס בסיס, 190 גליצין מ"מ, 0.1% SDS | |
| חיץ העברת 10x | 25 מ"מ טריס בסיס, 192 מ"מ גליצין | |
| חיץ 1x TBST | 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0.05% Tween 20 ב- pH 7 | מערבבים היטב ולסנן. אי מסנן יכול להוביל "תצפית" של הממברנה. |
| חסימת חיץ | חלב 5% או BSA (אלבומין בסרום שור) הוסיף TBST חיץ 1x | |
| TE הצפה | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA | |
| חיץ חישול | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ MgCl 2, 0.2 EDTA מ"מ, 1 מ"מ DTT | |
| Shift 5x ג'ל חיץ מחייב | 20% glycerol, 5 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ EDTA, 2.5 מ"מ DTT, 250 מ"מ NaCl, 50 מ"מ טריס- HCl (pH 7.5) ו -0.25 מ"ג / מ"ל פולי (DI-DC). | |
| חיץ טוען | 250 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2% bromophenol כחול 40% גליצרול | |
| 5x TBE | ממיסים 54 גרם של טריס הבסיס ו -27.5 גרם של חומצת בור במים 1 ליטר deionized, הכולל 20 מ"ל 0.5 M EDTA, pH 8 | |
| 4% ג'ל הילידים | חיץ 5x TBE | 6.0 מ"ל |
| 29: 1 acrylamide / bisacrylamide (30% w / v) | 10 מ"ל | |
| 40% acrylamide (w / v) | 0.75 מ"ל | |
| 100% גליצרול | 1.5 מ"ל | |
| מים מזוקקים | 41.5 מ"ל | |
| אמוניום persulfate 25% | 250 מ"ל | |
| TEMED | 75 מ"ל | |
| 4% Stacהמלך ג'ל (6 מ"ל) עבור SDS-PAGE | DDH 2 O | 4.1 מ"ל |
| 30% Acrylamide | 1.0 מ"ל | |
| 1.0 M טריס | 0.75 מ"ל | |
| 10% SDS | 60 μl | |
| 10% APS | 60 μl | |
| TEMED | 6 μl | |
| 12% ג'ל מפרידים (10 מ"ל) עבור SDS-PAGE | DDH 2 O | 3.3 מ"ל |
| 30% Acrylamide | 4.0 מ"ל | |
| 1.5 M טריס | 2.5 מ"ל | |
| 10% SDS | 100 μl | |
| 10% APS | 100μl | |
| TEMED | 4 μl |
רכב של מאגרי טבלה 2..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים על תפקוד השליה אנוש ופיתוח שופרו במידה רבה על ידי פרוטוקולים שמטרתן ייעול בידוד של אוכלוסיות תאי השליה שונות. אחת של אוכלוסיית תא שליה מיטב למד נשאר cytotrophoblasts villous, החקר אשר תועלת רבה פרוטוקולי אופטימיזציה המתירים בידוד יעיל ואמין. זו אפשרה עוד מספר ניסויים, כגון מחקרים transfection ומקדם. באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל 3, אוכלוסיות טהורות של cytotrophoblasts villous העיקרי ניתן להשיג. CK-7 הוא חלבון סיבי ביניים, המתבטאת cytotrophoblasts. נוגדנים חד-שבטיים כנגד חלבון זה משמשים כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיית trophoblast זה לאחר בידודם מן 10 השליה. תכשירים המוגדרים להיות טהור כאשר 96% של תאים הם חיוביים עבור CK-7. תאים יכולים לאחר מכן להשתמש בהם ישירות על transfection. פרוטוקולי transfectionמעורבים גישות שומנים מבוססות משמשים רחב להעביר חומצות גרעין לתוך תאים ראשוניים 11,12. עם זאת, רעילות של ניסוח שומנים בחלק התאים הופכות חסרון. Microporation היא טכנולוגיה electroporation באמצעות קצה פיפטה כמרחב electroporation, אשר מפיק חום מינימלי, פירוק יון המתכת, וריאציה pH היווצרות תחמוצת; כל מה שיכול להיות מזיק לתאים. בהתבסס על הנתונים המוצגים במסמך זה, microporation מייצג גישה יעילה יותר עבור משלוח siRNA מאשר פרוטוקול transfection השומנים מבוסס, כמו להישפט על ידי כתם המערבי מנתח. שימוש בגישה Emsa, בדיקה שנועדה נגד האזור הנבחר של האמרגן Syncytin-2 כי ידוע להיקשר גורמים חשובים לפעילותה 7 נבדק. החללית הודגר עם תמצית גרעינית מן cytotrophoblasts המבודד. כמוצג באיור 3, אותות ספציפיים התקבלו.
הפרוטוקולים השונים המתוארים כאן hתרוויח מזה בצורה מיטבית בשנים האחרונות. עם זאת, כל מה שהם מסתמכים על הכנות באיכות גבוהה cytotrophoblast, אשר תלויות על מספר מסוים של צעדים קריטיים. לא בראש ובראשונה, לאחר לידה, שליות צריכות להישמר פתרון חיץ יש לבודד מהם התאים יותר מ -5 שעות לאחר שקוע בפתרון. טיפולים טריפסין ו DNase גם בעל חשיבות רבה, ויש לבצעה בזהירות על מנת למקסם את איכות הכנה cytotrophoblast. קרצוף נרחב של villi שלית הפחתת הזמן הדרוש בידודם הם שיפורים נוספים, אשר יכול לשדרג את היעילות מאוד של בידוד מספר סלולארי. התשואה של פרוטוקול זה עוד תלוי צנטריפוגה אופטימלי במהלך שלב שיפוע צפיפות, שאמורים להיות תחת פיקוח הדוק. אי לאזן את הצינורות כמו שצריך גם יוביל לעיוות של השיפוע קשה להפחית מספרים סלולריים.
פרוטוקול transfection לתארד בזאת נבדק במשך מספר שנים. למרות התנאים הדרושים microporation הם פשוט בדרך כלל, אופטימיזציה של transfection עבור התאים ראשוניים השונים בכל זאת נדרשת. זה כרוך גם אופטימיזציה של כמות חומצת גרעין transfected (siRNA או פלסמיד דנ"א). כך, הפרוטוקול המתואר כאן, אופטימיזציה של ריכוזי siRNAs שונים מומלץ לזהות siRNA מדחיק ביעילות. תוספת של נפח השעיה מתאים כדי התא גלול לפני microporation ו השעיה מלאה של התאים הם גורמים נוספים אשר משפיעים יעילה transfection.
ניסויי Emsa גם חייבו אופטימיזציה. בהתחשב בהטרוגניות קשורות תורם שליה ואת יעילות purities בידוד cytotrophoblast משתנית, ניסויי Emsa צורך לחזור עד 5 פעמים כדי לאשר את התוצאות. בנוסף, בעלי מספרים סלולריים גבוהים חשוב לוודא prote מספיקברמות בהכנות תמצית גרעיניות וזיהוי הבא של קומפלקסי החלבונים / DNA. יתר על כן, מאוד בדיקות oligonucleotide רדיואקטיבי צריכים להיות מוכנים, וצריך להיות מוכן טרי מן ATP רדיואקטיבי שנרכשו לאחרונה.
סדרת המגבלות חייבת להיות הדגישה בפרוטוקול שהוצג. הוא זקוק ראשון להדגיש כי cytometry זרימת ניתוחים אינם יכולים להעריך ההימצאות האפשרית של שברי syncytiotrophoblast בהכנות תא. פרוטוקולים אחרים הוצעו על מנת לפתור בעיה זו, כגון מיון באמצעות cytometry זרימה או שימוש חרוזים מגנטיים הנכנסים נוגדנים 13,14. יצוין כי למרות משברים אלו בדרך כלל לא לדבוק בארות תרבית תאים, ולעתים קרובות הם הוסרו בעקבות שלב כביסת תא. מגבלה נוספת לפרוטוקול המוצג הנה כי cytotrophoblasts villous הראשוני יש זמן הישרדות מוגבל מאוד בתרבות תא. לפיכך, ללא קשר לשיטה שנבחרה, transfection יציב של וילcytotrophoblasts Lous יישאר בלתי מושג. Emsa מנתח, כמתואר בפרוטוקול זה, גם יש מגבלות מסוימות. למרות ספציפי של האותות ניתן להעריך בקלות על ידי ניסויי תחרות עם oligonucleotides ללא תווית עודף, גורמי כבול ניתן לזהות רק באמצעות נוגדנים נגד גורמי שעתוק ספציפיים וכתוצאה מכך אותות supershifted. ניסויי Emsa יתר נותרים מוגבלים כפי שהוא לומד באינטראקציות חלבון דנ"א במבחנה. ניסויים עם הגדרות מייצגות בצורה טובות יותר, כגון assay שבב, ועוד האחרונים בפרוטוקולי vivo נדרשים נוסף כדי לאשר את תוצאת Emsa.
הפרוטוקולים המתוארים כאן לבידוד cytotrophoblast ויש transfection יישומים חשובים עבור מחקרים בם חולפת השתקה או ביטוי יתר של גנים ספציפיים על מנת להבין את תפקידם בתפקוד, התפשטות או בידול של סוג תא trophoblast ספציפי. בנוסף, transfection על, tגרסות agged של חלבונים הביעו תהיינה מתאימות מעקב תאיים ומנתח ידי טכניקות סטנדרטיות, כגון מיקרוסקופיה confocal cytometry זרימה. פרוטוקול Emsa יכול לשמש כדי לחקור הפרטים המורכבים הנוגעים לרגולציה האמרגן ואת גורמי שעתוק המעורבים. יתר על כן, גישה ניסויית זה תאפשר לחוקרים לזהות גורמים מעורבים בהתפתחות של מחלות מסוימות הקשורות למחסור placentation והרגולציה השונה של גנים מתבטאים cytotrophoblasts villous.
לסיכום, cytotrophoblasts העיקרי אדם יכול להיות מבודד בקלות השליות ו ניתנים פרוטוקולים סטנדרטיים, כגון transfection siRNA ו Emsa. למרות הנהלים transfection שונים, כגון 15 lipofection ו nucleofection 16 זמינים, microporation נראה שיטה יעילה מאוד עבור transfection siRNA של cytotrophoblasts villous מבודד, ומציע גישה עם דה תא מוגבלATH ועלות נמוכה יחסית. בהקשר של cytotrophoblasts villous, גישה זו צריכה לאפשר השתקה של גנים שונים לבין הערכת המשמעות שלהם פונקציות שונות או מאפיינים של סוג התא. בנוסף, transfection של וקטורי ביטוי אינו ריאלי גם באמצעות פרוטוקול זה יניב נתונים משלימים בגישה מבוססת siRNA. עם כל הכבוד Emsa, טכניקה זו מספקת שיטה מהירה יותר ופשוטה יותר של הערכת קומפלקסים חלבונים-DNA בהשוואה גישות חלופיות, כגון footprinting DNase אני, assay הפרעה מתילציה, immunoprecipitation הכרומטין קונפורמציה הכרומטין מנתח. לפיכך, בטכניקה נותרת יקרה אמרגן תקן מנתח או בדיקה של כל משפר / אזורים אחרים DNA המכיל מדכאים. ההפגנה שלנו של השימוש האמין שלה עבור cytotrophoblasts villous חשובה, כפי שהוא מוסיף מידע על הרגולציה של גנים, עם השפעות פוטנציאליות ברמה התפקודית. למרות שלהםלזמן מוגבל בתרבות, cytotrophoblasts villous העיקרי מתאים ללימודים סטנדרטיים צריך להיות וישים יותר אחרון וכן שיטות אינפורמטיבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) (# 298,527) (BB). CT נתמכה על ידי מלגת FARE מוסדית. AV נתמכה על ידי דוקטור NSERC גרהם בל מילגה. BB קיימה הקתדרה למחקר בקנדה ב Retrovirology האדם (Tier 2). הודות ביאטריקס Beisner לעזרה בתיקון הטקסט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
