Summary
이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.
Protocol
UQAM 윤리위원회는 센터 Hospitalier Universitaire 드 몬트리올의 세인트 루크 병원 (몬트리올, 캐나다)의 윤리위원회의 지침에 따라 이들 프로토콜을 승인했습니다. 참가자는 동의서에 서명했다.
1. 중간 준비 및 기본 산모 Cytotrophoblasts의 분리
- 25 mM의 HEPES, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)을 보완하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts에 대한 문화 매체를 준비합니다. A의 멸균 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 준비된 매체 필터 -20 50 ㎖의 분취에서 C 냉동고 °.
- 표준 프로토콜 3 다음 신선한 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts을 분리합니다.
- 융모 조직을 제거하지 않도록주의하면서 플라이어를 사용하여, 그것을 떨어져 긁는 부드럽게하여 조직에서 태아 막을 제거합니다. 잘라메스와 가위를 사용하는 방법에 대한 3 × 3cm의 큐브에 태반 융모 남아. 철저하게 산모의 혈액을 제거하기 위해 0.9 % NaCl을 함유하는 물에 씻는다.
- 펜치와 각각의 큐브를 잡고 조심스럽게 남아있는 혈관과 섬유 조직하여 가위에서 융모 조직을 제거합니다.
- 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase를 I) (, 융모 조직이 15 내지 30 mg의 내용 (최종 농도 1.2 ㎎ / ㎖에서 9.6 × 105 내지 1.8 × 106 U) 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 함유하는 트립신 4 회 다이제스트 연속 진탕 수욕에서 37 ° C에서 30 분 동안 최종 농도 200 μg의 / ㎖).
두 번째 소화 100ml로하고 나머지 두 digestions 75 ml의 첫 번째 소화 150 ml의 전체 볼륨을 사용합니다.
- 브레이크없이 15 분 동안 1,250 XG에 분산 세포와 원심 분리기를 포함하는 상층 액을 수집합니다. 데워진 함유 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포를 분리1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유.
- 브레이크 없음 507 XG에서 23 분 동안 70 %의 폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 실리카 경사 (구배 제조 표 1 참조) 및 원심 - 불연속 5 % 위에 분산 셀 층을 포함한다. 흡인 1.033로 1.017의 밀도 층을 제거하고 새 피펫으로 그라데이션 40 %와 50 % 사이의 계층을 수집합니다. 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함 데워진 DMEM 10 ml의 광범위 세포를 씻으십시오.
참고 : 수집 된 부분은 trophoblasts을 품고 1.048과 1.062 사이에 밀도에 해당한다. - 혈구 세포를 사용하여 계산. 간단히, 세포를 혼합하여 새로운 microcentrifuge 관에 10 μl를 추가합니다. 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 부드럽게 다시 섞는다. 세포 현탁액을 작성하고 혈구 챔버를 입력합니다. 10X 목표 아래에있는 세포를 계산합니다.
- 1 × 106 4.5 × 10 섹션 1.3 및 2에서 사용하기 위해 별도의 튜브에 6 셀, 각각의 장소LY. 다른 실험 4 일 최대 CO 2, 37 ℃ / 웰 첨가 DMEM 배지 및 배양에 1.5 × 106 세포의 밀도로 잔존 세포를 시드 및 5 %.
- 융모 조직을 제거하지 않도록주의하면서 플라이어를 사용하여, 그것을 떨어져 긁는 부드럽게하여 조직에서 태아 막을 제거합니다. 잘라메스와 가위를 사용하는 방법에 대한 3 × 3cm의 큐브에 태반 융모 남아. 철저하게 산모의 혈액을 제거하기 위해 0.9 % NaCl을 함유하는 물에 씻는다.
- 고립 된 차 융모 cytotrophoblasts의 순도 평가
- 스핀 300 X g에서의 microcentrifuge 튜브에서 갓 격리 cytotrophoblasts의 1 × 6. 뜨는을 취소하고 데워진 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 추가합니다. 원심 분리기 세포 300 XG에 흡인에 의해 PBS를 제거합니다.
- 세포에 차가운 메탄올 1 ML을 추가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 품어. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포와 열망에 의해 메탄올을 제거합니다.
주의 : 메탄올을 처리하는 동안 용기 마스크, 보안경과 고무 장갑을 사용합니다. - 300 XG에 세포를 원심 분리기를 재수 흡인에 의해 PBS를 제거하고 실온에서 1 ml의 PBS를 추가합니다.
- FBS (1시 50분 [V / V] 희석)과 FcRγ 쇄를 포함하는 PBS에서 세포를 품어실온에서 45 분 동안 시약 (1:10) 차단하는 비특이적 결합을 제거한다.
- 5 분 300 XG에 실온 PBS 500 μL, 원심 분리기 세포로 두 번 세척하고, 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 100 ㎕를 실온 PBS에 재현 탁 세포.
- 또는 실온에서 45 분 동안 0.2 % BSA를 함유하는 PBS에서 제어 이소 타입 정합 비특이적 항체 : 마우스 단일 클론 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)로 세포를 인큐베이션은 항 - 인간 사이토 케라틴 -7- 항체 클론 LP5K (200 1) π 공역 어두운. PBS로 세포를 씻으십시오.
- 유동 세포 계측법 (3)에 의해 세포를 분석한다. 상기 실험 유동 세포 계측법에 의해 96 % CK-7 양성 세포 최소 보여 세포 제제를 사용한다.
인간의 기본 산모 Cytotrophoblasts 2. siRNA를 형질
- microporation 장치를 사용하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts의 형질
- 포함 된 6 웰 플레이트를 준비microporated 세포 배양을위한 보충 DMEM 배지 2 ㎖.
- 주 cytotrophoblasts (1.2 절 참조)의 분리 후 정지 세포의 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
- 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 microcentrifuge 관과 펠렛 세포를 1.5 × 106 세포를 옮긴다. 1 ml의 둘 베코 PBS (DPBS) (의 Mg 2 +, 칼슘 -free)으로 세포를 세척하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛.
- 상층 액을 제거하고 재 부유 버퍼 100 ㎕에 부드럽게 세포를 재현 탁.
실온에서 이상 15-30 분 동안 세포 현탁액을 유지하는 피 세포 생존하고 형질 전환 효율을 극대화 참고. - 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 Syncytin-2의 siRNA (또는 제어 스크램블 된 siRNA)의 300 NG를 추가하고 100 ㎕를 형질 전환 피펫을 사용하여 세포의 siRNA 혼합물을 대기음. 끼워 넣다역에 피펫 (재료의 목록 참조) 30 밀리의 1300 V 단일 펄스로 세포를 대상으로 할 수 없다.
- 즉시 세포의 손상을 방지하기 위해 37 ℃의 예열 된 배지를 포함한다 (단계 2.1.1에서 제조 됨)을 6- 웰 플레이트에 세포를 옮긴다.
- 반복 나머지 샘플 2.1.5와 2.1.6 단계를 반복합니다.
- 조심스럽게 세포의 고른 분포를 보장하기 위해 30 초 동안 판 바위. 24 ~ 48 시간 동안 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다.
- 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조).
- 인간의 기본 cytotrophoblasts에서의 siRNA의 리포 펙
- 융모 cytotrophoblasts 단리 후, 배지 2 ml를 6- 웰 플레이트에서 웰 당 1.5 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드 및 18 시간 동안 배양한다.
- Syncytin-2 특이 적 siRNA를 300 ng의 희석 (또는 제어-스크램블siRNA의) 및 antibiotic- 및 무 혈청 배지 10 ㎕의 총 부피 1.5 ㎖의 별도의 튜브 지질 계 형질 감염 시약을 5 μL. 5 분 동안 품어.
- 희석 시약을 혼합하고 형질 감염 복합체를 형성하고, 실온에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 100 μL의 최종 볼륨 믹스에 antibiotic- 및 무 혈청 배지 90 μl를 추가합니다.
- 6 웰 플레이트 (단계 2.2.1)에서 배지를 제거합니다. 이 새로운 배지 ㎖의 각 웰에 100 ㎕를 형질 믹스를 추가합니다. 24 ~ 48 시간에 대한 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다.
- 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조).
전체 세포 배양에서 해물 3. 준비
- 용지를 제거하고 미리 예열 DPBS를 사용하여 (단계 2.1.8과 2.2.4에서) 각 웰 린스 (2 + 마그네슘 칼슘 무료). DPBS를 대기음 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션. 혈청을 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 중지.
참고 : 사용 적절한 미디어 볼륨 플라스크 / 요리의 종류에 따라 : 10 7 세포 / 100mm 요리 / 150cm 2 플라스크 당 1 ml의; 5 × 10 6 세포 / 60mm 접시 당 0.5 ㎖ / 75cm 2 플라스크. - 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 DPBS로 마그네슘 (Mg 2 +, 칼슘 -free)과 펠렛 세포를 세포를 세척 하였다.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 50 ~ 200 ㎕의 얼음처럼 차가운 라디오 - 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼 (완충 성분 표 2 참조) 갓 추가 함유하는 펠렛을 재현 탁배속 최종 농도에서 에드 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제. 간략하게, 튜브를 와동 30 분 동안 얼음에두고.
- 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에 스핀. 조심스럽게 얼음에 튜브를 배치합니다. 피펫을 사용하여 얼음에 보관 신선한 사전 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오.
배양 된 세포에서 핵 추출물 4. 준비
- 각 웰 (단계 1.2.5)의 경우, 미리 예열 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 무료) 1 ㎖로 두 번 배양 cytotrophoblasts을 씻는다. 기음 DPBS와 0.25 % 트립신 / EDTA 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션하고, 혈청 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 멈춘다.
- 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 원심 분리하여 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 - 무료) 및 펠릿 세포와 세포를 씻으실온에서 2 분 동안 300 XG에. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 모든 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 핵 단백질을 추출합니다. 단백질 정량 분석 (브래드 포드 또는 bicinchoninic 산 분석 (BCA))를 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 결정한다.
5. 샘플 준비 및 전기 영동
- 단백질 정량 분석하여 각 세포 추출물, 단백질 농도를 결정한다 (예를 들어, 브래드 포드 8 BCA 9).
- (항체 감소 및 변성 조건에서 사용할 수있는 경우) 제조업체의 지침에 따라, 총 단백질의 20 ~ 30 μg의에 배 램 믈리 샘플 버퍼 (표 2)의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 5 분 동안 100 ° C에서 삶아의 세포 용 해물. 반복 된 동결 / 해동 사이클을 피하고 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 나머지 튜브를 저장할 해물 나누어 50-100 μL. 샘플이 가열되는 동안, 버퍼 (표 2)를 실행 1 배 1 L를 준비합니다.
- 몇 초 동안 16,000 XG에서 샘플을 스핀과 얼음에 배치합니다.
- 분자량 마커와 함께 12 % SDS-PAGE 겔 (겔 조성은 표 2 참조)의 각 웰에 동일한 양의 단백질을로드. 100 V.에서 2 시간에 1 젤을 실행
6. 막 겔로부터 단백질 전송
- 1 분 동안 메탄올로 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 1X 전송 버퍼 / 10 % 메탄올 수용액으로 씻어. 제조업체의 지시에 따라, 단백질을 크기에 따라 1 시간 30 분 동안 옮긴다.
주 : 전사 효율이 차단 공정 전에 개양귀비 빛 레드 염색을 이용하여 평가 될 수있다.
7. 항체 염색
- (1) 상온에서 시간 또는 밤새 4 ℃에서 5 %의 블로킹 용액을 이용해 박막을 차단.
- 6 안티 - 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH; 0.4 μg의 / ㎖; 1 : 500)으로 5 %의 차단 용액 중에서 밤새 :; 항 Syncytin-2 항체 (5000 1-4 μg의 / ㎖)과 함께 막을 인큐베이션 39 ° C (항 Syncytin-2) 상온에서 45 분 동안. TBS 버퍼 트윈에 멤브레인을 세 번 세척 (TBST, 버퍼 컴포지션 표 2 참조) 5 분.
- 적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 공역 계 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 항체 (1 : 10,000) 5 % 실온에서 1 시간 동안 TBST 버퍼에서 차단된다. 5 분 동안 멤브레인을 TBST에 세 번 세척 한 후 TBS에 헹군다. 화학 발광 계 블롯 기판을 이용하여 신호를 검출한다.
단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 8. 방사성 표지
- 인산화 반응
- 미세 원심 분리 관에, 1 배속 U T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제 완충액 순방향 올리고 뉴클레오티드 (50)를 따라 추가 NGT4 폴리 뉴클레오티드 키나제 20 μCi를 (γ- 32 P) ATP와 클레아없는 물 20 μL의 반응 볼륨을 구성합니다.
- 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 0.5 M EDTA의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 클레아없는 물 50 μL에 볼륨을 확인합니다.
- 올리고 뉴클레오티드에서 비법 인 뉴클레오티드의 제거
- 제조업체의 지침에 따라 TE 버퍼 (표 2)으로 평형화 G-25 컬럼을 준비합니다. 신선한 DNase의 프리 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다.
- 천천히 지층을 방해하지 않도록주의, 수지를 통해 (단계 8.1.2에서) 프로브의 50 μl를 추가합니다. 350 XG에 2 분 동안 스핀은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 된 샘플을 수집합니다. microcentrifuge 관에를 수집하기 위해 350 XG에 2 분 동안 뉴 클레아없는 물과 스핀의 36 μL와 G-25 컬럼을 씻으십시오.
- 상보 가닥 올와 하이브리드igonucleotide
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 방사성 표지 된 프로브 (86 μL)를 전송하고 (200) 역 올리고 뉴클레오티드의 NG 및 어닐링 버퍼의 1 배 (표 2)를 추가합니다. 열 95 ° C에서 5 분, 냉각, 실온에서 밤새두고.
- 앞으로 레이블이없는 50 NG를 추가하여 비 방사성 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 올리고 뉴클레오티드 및 어닐링 버퍼의 1 배 역. 클레아없는 물 100 μL에 볼륨을 확인합니다. 열 단계 8.3.1에 기술 된 바와 같이 실온에서 보관하십시오.
EMSA에 대한 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 9. 준비
- 1.5 mm의 공간 빗 (겔 조성물 표 2 참조) 4 % 기본 겔 (10 × 12cm)를 준비합니다. 증류수를 사용하는 모든 유리 접시를 청소합니다.
참고 :이 판 SDS와 같은, 이온 성 세제를 완전히 무료 것이 중요합니다. - 즉시 페이지와 플레이트 사이에 우리의 아크릴 아미드 용액 중합 (약 30 분)를 진행 할 수 있습니다.
- 전기 영동 장치를 조립하고 0.5 배의 TBE와 탱크를 채우십시오. 샘플 로딩하기 전에 150 V에서 1 시간 30 분 동안 젤을 사전 실행합니다.
10. DNA 결합 반응
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 1 배 젤 시프트 바인딩 버퍼 (표 2) 핵 추출물 (단계 4.3)의 10 μg의 추가 및 뉴 클레아없는 물 10 μL에 최종 볼륨을 구성합니다. 대조군으로, 아니 핵 추출물 튜브를 준비합니다. 경쟁 반응에, 차가운 비 특정 또는 특정 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 (단계 8.3.2) 1 μl를 추가합니다.
- 각 반응 단계 8.3.1에서 방사성 프로브의 1 μl를 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 반응을 부화. 반응 당 10 배 겔 로딩 버퍼 1 μl를 추가하고 섹션 9에서 제조 된 겔의 각 샘플을로드합니다.
- 15에서 2 시간에 1 1/2의 젤을 실행마이그레이션 후 0 V.은 형광면 아래 노광 카세트 플라스틱 랩 위치 겔 유리 랩. 24 시간 동안 4 ° C에서 카세트를 남겨주세요.
- 노광 카세트 화면을 제거하고 스캐닝 형광 촬상 장치에 삽입한다.
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Representative Results
임신 기간에서 신선한 태반은 프로토콜 부분에 제시된 실험 세트를 수행하기 위해, 인간 융모 cytotrophoblasts 주를 분리 하였다. 이들 분리 후, 우리는 먼저 사이토 케라틴 -7- 마커 (도 1)의 사용을 통해 cytotrophoblasts의 순도를 분석 하였다. 세포 제제는 따라서 단일 클론 항 - 사이토 케라틴 -7- 항체를 이용하여 염색 하였다. 1 유동 세포 계측법 표준 분석 기본 융모 cytotrophoblasts 정제 다음 대표적인 실험 결과를 나타내는 도표. 밀도 구배 단계 후에, (이 경우에는 99 %)> 97 %의 세포를 적극적하여 이러한 세포 유형의 정제 효율이 매우 높은 수준을 보여주는 표준 실험 사이토 케라틴-7 염색.
그들의 분리 한 후, 인간의 기본 cytotrophoblasts 직접 TRA 사용할 수 있습니다nsfection. 두 개의 서로 다른 프로토콜 즉, microporation 및 지질 기반 형질 전환, 평가 하였다. 두 프로토콜은 Syncytin-2 mRNA의 특정 siRNA를 테스트 스크램블 된 siRNA (음성 대조군)에 비해 하였다. 형질 전환 효율은 다음 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가 하였다. 결과 Syncytin-2의 발현이 현저하게 microporation에 cytotrophoblast 유래 추출물 (그림 2) 침묵을 지켰습니다 것을 확인했다. siRNA는 상기 지질 계 형질 감염 시약 형질 때 한편, 유의 침묵은 언급되지 않았다.
우리는 또한 갓 격리 cytotrophoblasts에 EMSA 실험을 실시했다. Syncytin-2 프로모터 영역에서 유래 방사성 표지 된 프로브를 합성 하였다. (WT라고 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ')를 합성 프로브는 이전 CREB 관련된 전사 인자 (7)에 결합하는 것으로 나타났다. 핵 extr의 존재 24 및 48 시간 배양 융모 cytotrophoblasts에서 작용은 Syncytin -2- 프로모터 유래 프로브는 두 DNA 단백질 복합체의 존재를 보여 주었다. 관찰되지 않았다 두 신호의 특이성 (확인; 감기 무관 올리고 초과 (5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 '마우스 신경 능선 향상제 2)와 더 유사 경쟁하면서 100X 감기 WT 올리고 뉴클레오티드를 첨가하는, 복합체의 형성을 위해 경쟁 그림 3).
융모 cytotrophoblasts의 그림 유동 세포 계측법을 통해 주 융모 cytotrophoblasts의 순도 1. 평가. 갓 격리 준비가 먼저 투과성이 다음 사이토 케라틴-7 (검은 선)에 대한 이소 제어 항체 (레드 라인) 또는 특정 단일 클론 항체로 표지 하였다. 세포를 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 레 / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지질 계 형질 감염 및 microporation 사이의 siRNA의 형질 감염 효율의도 2의 비교. 갓 절연 융모 cytotrophoblasts는 지질 계 시약 또는 microporation를 사용하여 스크램블링 제어 siRNA에 대 Syncytin-2 특이 적 siRNA 300 NG로 형질 감염시켰다. (A) 웨스턴 블롯 분석을 방지 Syncytin -2- 안티 GAPDH 항체를 사용하여 각 형질 전환 조건에서 세포 추출물에 대해 수행 하였다. (B) 웨스턴 블롯 분석에서 Syncytin-2 단백질 수준 (오차 막대는 표준 편차로 정의된다 *** p <0.001), GAPDH 신호를 대응하는 정규화 다음 밴드 강도의 정량화 하였다.5 / 53995fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EMSA 분석에 의해 식별도 3 DNA 단백질 복합체. 24 또는 48 시간 동안 배양 주 융모 cytotrophoblasts로부터 핵 추출물은 WT 프로브 특정 또는 불특정 초과 (100X)와 함께 또는없이 Syncytin -2-의 프로모터 영역에 대응하는 배양 감기 올리고 뉴클레오티드. DNA 단백질 복합체는 천연 겔상에서 이전에 분리 하였다. 특정 신호와 자유 프로브 겔의 우측에 표시된다. 핵 추출물의 부재 하에서 배양 WT 프로브는 음성 대조군으로 사용 하였다. CT NE = cytotrophoblast 핵 추출물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 퍼콜 결승전 % | 퍼콜 (90 %) (ML)의 양 | HBSS의 양 (㎖) |
| (70) | 2.33 | 0.67 |
| (65) | 2.17 | 0.83 |
| (60) | 2.00 | 1.00 |
| (55) | 1.83 | 1.17 |
| (50) | 1.67 | 1.33 |
| (45) | 1.50 | 1.50 |
| (40) | 1.33 | 1.67 |
| (35) | 1.17 | 1.83 |
| (30) | 1.00 | 2.00 |
| (25) | 0.83 | 2.17 |
| (20) | 0.67 | 2.33 |
| (15) | 0.50 | 2.50 |
| (10) | 0.33 | 2.67 |
| (5) | 0.17 | 2.83 |
표 1의 5 % -70 %, 폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 실리카 구배 설정.
| 완충기 | 구성 | 댓글 / 설명 |
| PBS 1X | 0.9 mM의 염화칼슘 2, 2.7 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 KH 2 PO 4, 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 136.9 mM의 염화나트륨 0.8 밀리미터 나 2 HPO 4 | |
| RIPA 버퍼 | 150 mM의 염화나트륨, 1.0 % NP-40, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS (도데 실 황산나트륨), 50mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 | |
| 램 믈리 시료 완충액 | 4 % SDS, 10 % 2- mercaptoethano(L), 20 % 글리세롤, 0.004 % 블루 브로 모 페놀, 0.125 M 트리스 -HCl, pH가 6.8 | |
| 10 배 실행 버퍼 | 25 mM 트리스베이스, 190 mM의 글리신, 0.1 % SDS | |
| 10 배의 전송 버퍼 | 25 mM 트리스베이스, 192 mM의 글리신 | |
| TBST 1X 버퍼 | pH가 7에서 10 mM 트리스 - 염산, 15 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20 | 잘 혼합하고 필터링 할 수 있습니다. 필터에 실패 멤브레인의 "안보"가 발생할 수 있습니다. |
| 버퍼를 차단 | 5 % 우유 또는 BSA (소 혈청 알부민)은 1X TBST 버퍼를 첨가하여 | |
| TE 버퍼 | 10 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 1 mM의 EDTA | |
| 어닐링 버퍼 | 1 M의 NaCl, 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 100 mM의의 MgCl 2, 0.2 mM의 EDTA, 1mM의 DTT | |
| 버퍼 바인딩 5 배 젤 이동 | 20 % 글리세1,5 밀리미터의 MgCl 2, 2.5 mM의 EDTA, 2.5 mM의 DTT, 250 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.5) 및 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 (디 DC). | |
| 로드 버퍼 | 250 mM 트리스 - 염산 (PH 7.5), 블루 0.2 % 브로 모 페놀 40 % 글리세롤 | |
| TBE 5 배 | 트리스 자료 54 g, 20 ml의 0.5 M EDTA를 포함 1 L 탈 이온수에 붕산 27.5 g, pH가 8을 녹여 | |
| 4 % 기본 겔 | TBE 5 배 버퍼 | 6.0 ml의 |
| 29 : 1 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (30 % w / v)의 | 10 ml의 | |
| 아크릴 아미드 40 % (W / V) | 0.75 ml의 | |
| 100 % 글리세롤 | 1.5 ml의 | |
| 증류수 | 41.5 ml의 | |
| 과 황산 암모늄 25 % | 250 ml의 | |
| TEMED | 75 ml의 | |
| 4 % STACSDS-PAGE 젤 킹 (6 mL) 중 | DDH 2 O | 4.1 ml의 |
| 30 % 아크릴 아미드 | 1.0 ml의 | |
| 1.0 M 트리스 | 0.75 ml의 | |
| 10 % SDS | 60 μL | |
| 10 % APS | 60 μL | |
| TEMED | 6 μL | |
| 12 % SDS-PAGE 젤 분리하기위한 (10 mL) 중 | DDH 2 O | 3.3 ml의 |
| 30 % 아크릴 아미드 | 4.0 ml의 | |
| 1.5 M 트리스 | 2.5 ml의 | |
| 10 % SDS | 100 μL | |
| 10 % APS | (100)μL | |
| TEMED | 4 μL |
버퍼의 표 2. 구성.
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Discussion
인간의 태반 기능과 개발에 관한 연구는 매우 다양한 태반 세포 집단의 분리를 최적화하기위한 프로토콜이 향상되었습니다. 최고의 연구 된 태반 세포 집단 중 하나는 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 격리를 허용 최적화 된 프로토콜에서 도움이되고 연구되는의 융모 cytotrophoblasts을, 남아있다. 이것은 또한 이러한 형질 전환 및 프로모터 연구 등의 실험의 수를 허용했다. 이전에 설명 된 프로토콜을 사용하여 3 차 융모 cytotrophoblasts 순수 집단을 얻을 수있다. CK-7 cytotrophoblasts 표현되는 중간 필라멘트 단백질이다. 이 단백질에 대한 단일 클론 항체는 태반 (10)에서 자신의 분리 후이 영양막 세포 인구의 순도를 결정하는 데 사용됩니다. 준비는 세포의 96 %는 CK-7에 대한 긍정적 때 순수로 정의된다. 이어서 세포를 형질 감염을 위해 직접적으로 사용될 수있다. 형질 프로토콜지질 - 기반 접근법을 포함하는 광범위 기본 셀 (11, 12)에 핵산을 전송하는 데 사용된다. 그러나 일부 세포에서 지질 제제의 독성은 단점이된다. Microporation 최소 열, 금속 이온의 용출, 산도 변화 및 산화물 형성을 발생시키는 전기 공간으로서 피펫 팁을 사용하여 일렉트로 포 레이션 기술; 이는 모든 세포에 유해 할 수있다. 여기에 제공된 데이터에 기초하여, microporation 웨스턴 블롯 분석에 의해 판정 된 바와 같이, 지질 계 형질 감염 프로토콜보다 siRNA의 전달을위한 더 효율적인 접근 방법을 나타낸다. EMSA 방법, 시험 하였다 활성 7 중요한 요소를 결합하는 것으로 알려져있는 Syncytin-2 프로모터의 선택된 영역에 대해 설계된 프로브를 사용. 프로브가 절연 cytotrophoblasts로부터 핵 추출물과 함께 배양 하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, 특정 신호가 얻어졌다.
서로 다른 프로토콜은 여기에 시간 설명최근에 최적화되어 들이죠. 하지만, 그들 모두는 중요한 단계의 특정 수에 의존 고품질 cytotrophoblast 제제에 의존한다. 무엇보다 먼저, 출생 다음, 태반은 완충액에 유지 될 필요가 있고 세포는 더 이상 5 시간 이하 용액에 침지 한 후 이들로부터 격리되어야한다. 트립신의 DNase 처리는 또한 매우 중요한하고 신중 cytotrophoblast 제제의 품질을 최대화하기 위해 수행되어야한다. 자신의 분리에 필요한 시간의 태반 융모와 감소의 폭 넓은 세정 강하게 세포 수 분리의 효율을 업그레이드 할 수 있습니다 모두 추가 개선이다. 이 프로토콜의 수율은 더욱 가깝게 감시되어야 밀도 구배 단계 동안 최적의 원심 분리에 달려있다. 제대로 튜브의 균형을하지 않으면 또한 그라데이션의 왜곡으로 이어질 심각 세포 수를 감소시킬 것이다.
형질 감염 프로토콜을 설명D 여기에 몇 년 동안 테스트되었습니다. microporation에 필요한 조건은 일반적으로 간단하지만, 다양한 기본 세포 형질 전환의 최적화는 그럼에도 불구 필요합니다. 이것은 또한 형질 핵산 (siRNA의 플라스미드 또는 DNA)의 양의 최적화를 포함한다. 프로토콜이 여기에 설명을 위해 따라서, 각종 된 siRNA 농도의 최적화는 효율적으로 억압 된 siRNA를 확인하는 것이 좋습니다. 세포 microporation 완전한 정지 전에 세포 펠렛을 적절한 부피 현탁액의 첨가는 형질 감염 효율에 영향을 미치는 추가적인 요인이다.
EMSA 실험은 최적화를 필요로했다. 태반 기증자와 다양한 cytotrophoblast 분리 효율과 순도와 관련된 이질성을 감안할 때, EMSA 실험 결과를 확인하기 위해 최대 5 번까지 반복해야합니다. 또한, 높은 세포 수를 갖는 충분한 보호 자전거를 보장하는 것이 중요핵 추출물 제제 및 단백질 / DNA 복합체의 후속 검출 수준이다. 또한, 높은 방사성 올리고 뉴클레오티드 프로브를 준비해야하며, 최근에 구입 한 방사성 ATP에서 신선한 준비를해야합니다.
제한 일련 제시된 프로토콜 강조되어야한다. 먼저 분석은 세포의 제제는 syncytiotrophoblast 단편의 존재 가능성을 평가할 수 유동 세포 계측법 강조 할 필요가있다. 다른 프로토콜은 이러한 유세포 또는 항체 - 결합 된 자성 비드 (13, 14)를 사용하여 정렬로,이 문제를 해결하기 위해 제안되었다. 그러나, 이들 단편은 보통 세포 배양 웰에 부착되지 않아 종종 세포 세척 단계 다음 제거되어 있지만 언급한다. 제시된 프로토콜에 대한 또 다른 제한은 기본 융모 cytotrophoblasts는 세포 배양에 매우 제한된 생존 시간을 가지고있다. VIL의 이에 상관없이 선택에있어서의 안정적인 트랜lous cytotrophoblasts는 얻기 어려운 유지됩니다. EMSA는이 프로토콜에 기술 된 바와 같이, 또한 소정의 제한이, 분석한다. 신호의 특성을 용이하게 과잉 표지 된 올리고 뉴클레오티드와 경쟁 실험에 의해 평가 될 수 있지만, 바인딩 요소는 supershifted 신호 발생 특정 전사 인자에 대한 항체를 사용하여 식별 될 수있다. 이 시험 관내 DNA - 단백질 상호 작용 연구로 EMSA 실험은 또한 여전히 제한. 생체 프로토콜 이러한 칩 분석 자세히 대표 설정, 실험 등은 최근 EMSA 상기 결과를 확인하기 위해 필요하다.
cytotrophoblast 분리 및 형질 전환 본원에 기술 된 프로토콜은 과도 침묵 또는 특정 유전자의 과발현은 함수 증식 또는 특정 영양막 세포 유형의 분화에서의 역할을 이해하기 위해 필요로되는 연구에 중요한 애플리케이션을 갖는다. 또한, 형질 전환시, t발현 된 단백질의 agged 버전은 세포 내 추적에 적합 및 공 초점 현미경과 같은 표준 기술에 의해 분석하고 유동 세포 계측법됩니다. EMSA 프로토콜 프로모터 조절과 연루 전사 인자와 관련된 복잡한 세부 연구하는데 사용될 수있다. 또한,이 실험 방법은 연구자 태반 융모 결핍 cytotrophoblasts 발현 유전자 변형 규제에 관련된 특정 질환의 발달에 관여하는 인자를 확인하는 것을 허용 할 것이다.
결론적으로, 인간의 기본 cytotrophoblasts는 태반에서 쉽게 고립 될 및 siRNA를 형질 전환 및 EMSA 같은 표준 프로토콜 의무가있다 할 수 있습니다. 이러한 리포 펙 (15)와 nucleofection (16)와 같은 다른 형질 전환 절차를 사용할 수 있지만, microporation 제한 셀 드와 접근 방식을 제공, 고립 된 융모 cytotrophoblasts의 siRNA를 형질 전환을위한 매우 효율적인 방법을 보인다ATH 상대적으로 저렴한 비용. 융모 cytotrophoblasts의 맥락에서,이 방법은 다른 유전자 사일런 다양한 기능 또는 세포 유형의 특성에서의 의미의 평가를 허용한다. 또한, 발현 벡터는 형질 감염이 프로토콜을 이용하여 실현하고 siRNA를 기반 방식에 상보 데이터를 산출 할 것이다. EMSA에 관하여,이 기술은의 DNase I 배출량 측정 메틸화 간섭 분석 염색질 면역 및 염색질 형태 분석 등의 다른 방법에 비해 단백질 DNA 복합체의 평가보다 신속하고 간단한 방법을 제공한다. 표준 프로모터 분석 또는 다른 인핸서 / 억제 함유 DNA 영역 시험에 따라서,이 기술은 가치가 유지된다. 이 기능 수준에 잠재적 인 영향과 유전자의 조절에 정보를 추가로 융모 cytotrophoblasts에 대한 신뢰성 사용의 우리의 시위는 중요하다. 에도 불구하고 자신의문화 제한된 시간, 주 융모 cytotrophoblasts 표준 연구에 적합하며 최근뿐만 아니라 유익한 방법에 적용 할 수 있어야합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 캐나다의 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (# 298527) (BB)에서 교부금에 의해 지원되었다. CT는 기관 FARE 장학금에 의해 지원되었다. AV는 NSERC 그레이엄 벨 박사에 의해 지원되었다 장학금. BB는 인간 Retrovirology에서 캐나다 연구 의장에게 (2 단계)을 개최했다. 텍스트를 수정에 도움을 베아트릭스 Beisner 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
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