Summary
Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.
Protocol
O comitê de ética UQAM aprovou estes protocolos, que estão em conformidade com as orientações do comitê de ética de St-Luc Hospital do Centre Hospitalier Universitaire de Montreal (Montreal, Canadá). Os participantes assinaram um termo de consentimento informado.
1. Médio Preparação e Isolamento de primárias das vilosidades citotrofoblastos
- Prepare meio de cultura para citotrofoblastos vilosidades primárias humanas, completando meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), com HEPES 25 mM, 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar o meio preparado por meio estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um congelador a -20 ° C em alíquotas de 50 ml.
- Isolar citotrofoblastos vilosidades primárias de placentas frescos seguintes protocolos padrão 3.
- Utilizando um alicate, retire a membrana fetal a partir do tecido delicadamente riscar-lo, tomando cuidado para não remover o tecido das vilosidades. Corte oremanescente vilosidades da placenta em cubos de cerca de 3 x 3 cm usando bisturi e tesoura. Lavar exaustivamente com água contendo NaCl 0,9% para remover o sangue materno.
- Segurando cada cubo com um alicate, remova cuidadosamente o tecido das vilosidades dos vasos remanescentes e tecidos fibrosos usando uma tesoura.
- Para 15 a 30 mg de tecido das vilosidades, digerir quatro vezes em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo tripsina (de 9,6 x 10 5-1,8 x 10 6 L; concentração final 1.2 mg / ml) e desoxirribonuclease I (ADNase I) ( concentração final de 200 ug / ml) durante 30 min a 37 ° C num banho de água com agitação contínua.
Nota: Use 150 ml de volume total para a primeira digestão, 100 ml para a segunda digestão e 75 ml para as duas digestões remanescentes.
- Recolhe-se o sobrenadante contendo as células dispersas e centrifugar a 1250 xg durante 15 min sem travão. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de DMEM contendo pré-aquecido1% de penicilina / estreptomicina.
- A camada de células dispersas no topo de uma descontínua 5% - 70% gradiente de silica revestida com polivinilpirrolidona (ver Tabela 1 para a preparação de gradiente) e centrifuga-se durante 23 min a 507 x g sem travão. Remover a camada de densidade entre 1,017-1,033 por aspiração e recolher as camadas entre 40% e 50% do gradiente com uma pipeta nova. Lave as células exaustivamente com 10 ml de DMEM pré-aquecido contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
Nota: A fracção recolhida corresponde a densidades entre 1.048 e 1.062, que abriga trofoblastos. - Contar as células usando um hemocitômetro. Resumidamente, células de misturar e adicionar 10 ul num tubo de microcentrífuga novo. Adicionar 10 ml de azul de tripano e misture delicadamente novamente. Elaborar a suspensão de células e preencher as câmaras hemocitômetro. Contar as células sob objetiva de 10X.
- Coloque 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 células em tubos separados para uso em seções 1.3 e 2, respectivaly. Semear as restantes células a uma densidade de 1,5 X 10 6 células / poço em meio de cultura DMEM suplementado e a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um máximo de 4 dias para outras experiências.
- Utilizando um alicate, retire a membrana fetal a partir do tecido delicadamente riscar-lo, tomando cuidado para não remover o tecido das vilosidades. Corte oremanescente vilosidades da placenta em cubos de cerca de 3 x 3 cm usando bisturi e tesoura. Lavar exaustivamente com água contendo NaCl 0,9% para remover o sangue materno.
- Avaliação da pureza do isolado citotrofoblastos vilosidades primárias
- Spin 1 x 10 6 dos citotrofoblastos recentemente isoladas em microtubos a 300 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de pré-aquecida (PBS). células centrifugar a 300 xg e remover PBS por aspiração.
- Adicionar 1 ml de metanol frio para as células e incuba-se à temperatura de -20 ° C durante 20 min. células centrifugar a 300 xg durante 5 min e remover o metanol por aspiração.
Cuidado: Use máscara canister, óculos de segurança e luvas de borracha ao manusear metanol. - Adicionar 1 ml de PBS à temperatura ambiente para re-hidratar as células, centrifugação a 300 xg e remover por aspiração PBS.
- Incubar as células em PBS contendo FBS (01:50 [v / v] de diluição) e um FcRreagente de bloqueio (01:10) durante 45 min à temperatura ambiente para eliminar a ligação não específica.
- Lavar duas vezes com 500 ul de PBS temperatura ambiente, centrifugar células a 300 xg durante 5 min e remover por aspiração PBS. Ressuspender as células em 100 ul temperatura ambiente PBS.
- Incubar as células com um isotiocianato de monoclonal de rato fluoresceína (FITC) -conjugated LP5K anti-humana de clone de anticorpo citoqueratina-7 (1: 200) ou um controlo de isotipo-emparelhado não específica de anticorpos em PBS contendo 0,2% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente em o escuro. Lave as células em PBS.
- Analisar as células por citometria de fluxo 3. Use preparações de células, que demonstram um mínimo de células CK-7-positivos a 96% em citometria de fluxo para outras experiências.
2. siRNA transfecção de primárias Humanos das vilosidades citotrofoblastos
- A transfecção de citotrofoblastos vilosidades primárias humanas utilizando um dispositivo de formação de microporos
- Prepare placas de 6 poços contendo2 ml de meio DMEM suplementado para a incubação de células microporated.
- Após o isolamento de citotrofoblastos primários (ver secção 1.2), tomar uma alíquota de células em suspensão e determinar o número de células usando um hemocitômetro.
- Transferir 1,5 x 10 6 células para um tubo de microcentrífuga e as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2 + livre) e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em 100 ul de tampão de ressuspensão.
Nota: Evitar mantendo suspensão de células durante mais de 15-30 min à temperatura ambiente, para maximizar a viabilidade das células e a eficiência de transfecção. - Adicionar 300 ng de Syncytin-2 siRNA (ou mexidos-ARNsi de controlo) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e aspirar a mistura de células-siRNA transfecção utilizando uma pipeta de 100 uL. Inserira pipeta na estação (veja Lista de Materiais) e submeter as células a um 1.300 V pulso único de 30 ms.
- Imediatamente transferir as células para placas de 6 poços (preparado no passo 2.1.1) contendo meio suplementado 37 ° C pré-aquecido para evitar danos nas células.
- Repita os passos 2.1.5 e 2.1.6 para as amostras restantes.
- Agite suavemente a placa durante 30 segundos para assegurar uma distribuição das células. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção.
- Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6).
- A lipofecção de siRNA em citotrofoblastos primários humanos
- Após o isolamento dos citotrofoblastos vilosidades, semear as células a uma densidade de 1,5 x 10 6 culas por po em placas de 6 poços em 2 ml de meio de cultura e incuba-se durante 18 h.
- Diluir 300 ng de Syncytin-2-específica siRNA (ou Control-mexidossiARN) e 5 ul de reagente de transfecção à base de lípidos em separadas tubos de 1,5 ml em um volume total de 10 ul de forma a antibióticos e isento de soro. Incubar durante 5 min.
- Misturar os reagentes diluídos e incubar durante mais 20 min à temperatura ambiente para formar o complexo de transfecção. Adicionar 90 uL de meio aos antibióticos e sem soro à mistura até um volume final de 100 ul.
- Remover o meio de cultura das placas de 6 poços (passo 2.2.1). Adicionar 2 ml de meio fresco e a mistura de transfecção 100 ul a cada poço. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção.
- Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6).
3. Preparação de lisados de células inteiras a partir de cultura
- Remova a mídia e lavar cada poço (de passos 2.1.8 e 2.2.4), utilizando DPBS pré-aquecido (Mg 2+, Ca 2+ livre). Aspirar o DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% de ácido tripsina / etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. Pare de tratamento com tripsina, adicionando 500 mL de meio de crescimento contendo soro.
Nota: Use volume de mídia apropriadas de acordo com o tipo de frasco / prato: 1 ml por 10 7 células / 100 milímetros prato / 150 cm 2 frasco; 0,5 ml por 5 X 10 6 células / placa de 60 mm / 75 cm 2 balão. - Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Colocar o tubo em gelo. Ressuspender o sedimento em 50-200 Radio-imunoprecipitação de Ensaio (RIPA) de tampão gelado ul (ver Quadro 2 para a composição do tampão) contendo recém adicionarEd protease e inibidores de fosfatase a uma concentração final de 1x. Resumidamente, vortex do tubo e deixar em gelo durante 30 min.
- Centrifugação a 16000 xg durante 20 min a 4 ° C. Com cuidado, coloque o tubo em gelo. Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco pré-arrefecida mantido em gelo. Descartar o sedimento.
4. Preparação de Extratos nucleares de células em cultura
- Para cada poço (passo 1.2.5), lavar citotrofoblastos cultivadas duas vezes com 1 ml de DPBS pré-aquecido (Mg2 +, Ca2 + livre). Aspirar DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% tripsina / EDTA. Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 e parar o tratamento de tripsina por adição de 500 ul de meio de crescimento contendo soro.
- Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugaçãoa 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Retire com cuidado todas sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar o tubo no gelo.
- Extracto de proteína nuclear de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a concentração de proteína de cada amostra utilizando o ensaio de quantificação de proteínas (Bradford ou ensaio de ácido bicincon�ico (BCA)).
5. Preparação de amostras e Electroforese
- Determinar a concentração de proteína para cada extracto celular utilizando um ensaio de quantificação de proteína (por exemplo, Bradford 8 ou 9 BCA).
- De acordo com as instruções do fabricante (se os anticorpos poderiam ser utilizados em condições de redução e desnaturação), adicionar um volume igual de 2x tampão de amostra de Laemmli (Tabela 2) a 20-30 ug de proteína total.
- Os lisados celulares em ebulição a 100 ° C durante 5 min. Aliquota 50-100 ul de lisado para evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos e armazenar os restantes tubos a -20 ° C para uso futuro. Enquanto as amostras são aquecimento, preparar 1 L de 1x tampão de corrida (Tabela 2).
- Rodar as amostras a 16.000 xg durante alguns segundos e colocá-los em gelo.
- Carga igual quantidade de proteína em cada poço de um gel SDS-PAGE a 12% (ver Quadro 2 para a composição de gel), juntamente com um marcador de peso molecular. Submeter o gel durante 1 a 2 horas a 100 V.
6. Transferir a proteína a partir do gel para a membrana
- Activa membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 1 min e lavar com solução de tampão / metanol a 10% a transferência de 1x. De acordo com as instruções do fabricante, transferir durante 30 min a 1 hora, dependendo do tamanho da proteína.
Nota: eficiência de transferência pode ser avaliada utilizando a coloração de Ponceau Red antes do passo de bloqueamento.
7. Anticorpo de coloração
- Bloquear a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C utilizando uma solução de bloqueamento de 5%.
- Incubar a membrana com anticorpos anti-Syncytin-2 (4 ng / ml; 1: 5000) 6 ou com anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) em solução de bloqueio 5% durante a noite a 4 ° C (anti-Syncytin-2) ou durante 45 min à temperatura ambiente. Lava-se a membrana três vezes em solução salina tamponada com Tris Tween (TBST; ver Quadro 2 para a composição do tampão) durante 5 min.
- Incubar a membrana com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anti-coelho ou anti-ratinho (1: 10000) em 5% de tampão em TBST bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana três vezes em TBST durante 5 minutos e depois enxaguar em TBS. Detectar sinais utilizando o substrato blotting à base de quimioluminescência.
8. A marcação radioactiva de cadeia simples Oligonucle�ido
- reacção de fosforilação
- Num tubo de microcentrífuga, adicionar 50 ng de um oligonucleótido para a frente juntamente com T4 polinucleótido quinase 1x tampão, 1 LT4 polinucleótido-quinase e 20 uCi (γ- 32 P) ATP e perfazer o volume de reacção para 20 l com água livre de nuclease.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min. Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M. Perfazer o volume de 50 ul com água livre de nuclease.
- A remoção dos nucleótidos não incorporados a partir de oligonucleótidos
- Prepara-se uma coluna G-25 equilibrada com tampão TE (Tabela 2) seguindo as instruções do fabricante. Colocar a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de DNase-livre fresco.
- Lentamente, adicionar 50 ul de sonda (a partir do passo 8.1.2) sobre a resina, tendo o cuidado de não perturbar o leito de resina. Rotação durante 2 minutos a 350 x g para recolher a amostra purificada no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lava-se a coluna G-25 com 36 ul de água isenta de nuclease e centrifugação durante 2 minutos a 350 xg para recolhê-lo no tubo de microcentrífuga.
- A hibridação com a cadeia complementar oligonucleotide
- Transferir a sonda marcada radioactivamente (86 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ng do oligonucleótido reverso e 1 x de tampão de recozimento (Tabela 2). Aquecer 5 min a 95 ° C e deixar durante a noite à temperatura ambiente para arrefecimento.
- Prepare não radioactivos oligonucleótidos de cadeia dupla pela adição de 50 ng de não marcado para a frente e oligonucleótidos e 1x de tampão de recozimento reversa num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Perfazer o volume de 100 ml com água livre de nuclease. Calor e manter a temperatura ambiente como descrito no passo 8.3.1.
9. Preparação de um gel de poliacrilamida não desnaturante para EMSA
- Preparar um gel nativo a 4% (10 x 12 cm), com um espaço de pente 1,5 mm (ver Quadro 2 para a composição de gel). Limpe todas as placas de vidro com água destilada.
Nota: É fundamental que as placas de ser completamente livre de detergente iónico, como SDS. - imediatamente pa solução de acrilamida entre as placas e permitir a polimerização se realizasse (aproximadamente 30 min).
- Montar o aparelho de eletroforese e encher o tanque com TBE 0,5x. Pré-correr o gel durante 30 min a 1 h a 150 V antes do carregamento da amostra.
10. ADN de ligação Reacção
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 10 mg de extrato nuclear (passo 4.3) em tampão de Deslocamento da Encadernação 1x Gel (Tabela 2) e completar o volume final para 10 ml com água livre de nuclease. Como um controlo, preparar um tubo sem o extracto nuclear. Para a reacção de competição, adicionar 1 ul de oligonucleótido de cadeia dupla frio não específica ou específica (passo 8.3.2).
- Adicionar 1 ml de sonda radioactiva a partir do passo 8.3.1 a cada reacção. Incubar a reacção a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de gel 10x por reação e carregar cada amostra no gel preparada na secção 9.
- Submeter o gel durante 1 1/2 a 2 horas a 150 V. Após a migração, enrole o gel eo vidro em um filme plástico e posição em uma cassete de exposição abaixo uma tela de fósforo. Deixar cassete a 4 ° C durante 24 h.
- Remova a tela a partir da cassete de exposição e inserir no dispositivo de imagem de fósforo para digitalização.
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Representative Results
placentas frescos de gestação a termo foram usados para isolar citotrofoblastos vilosidades primárias humanos para conduzir o conjunto de experimentos apresentados na seção Protocolo. Seguindo o seu isolamento, analisou-se primeiro a pureza de citotrofoblastos através da utilização do marcador citoqueratina-7 (Figura 1). Preparações celulares foram assim coradas utilizando um anticorpo monoclonal anti-citoqueratina-7. A Figura 1 representa os resultados de uma experiência típica a seguir à purificação de citotrofoblastos vilosidades primárias, analisadas por citometria de fluxo padrão. Após o passo de gradiente de densidade, células de> 97% (neste caso, 99%) são coradas positivamente para citoqueratina-7 em ensaios padrão, demonstrando, assim, um elevado grau de eficiência na purificação deste tipo de células.
Depois de seu isolamento, citotrofoblastos primários humanos podem ser usados diretamente para transfection. Dois protocolos foram avaliados diferentes, isto é, de formação de microporos e de transfecção à base de lípidos. Ambos os protocolos foram testados com ARNsi específico para Syncytin-2 mRNA e comparado a um siARN scrambled (controlo negativo). A eficiência de transfecção foi avaliado próxima por análise de Western blot. Os resultados confirmaram que a expressão Syncytin-2 foi significativamente silenciados em extractos derivados de citotrofoblasto mediante microporos (Figura 2). Por outro lado, não silenciamento significativa foi observada quando os siRNAs foram transfectadas por o reagente de transfecção à base de lípidos.
Nós também conduziu experimentos AESM sobre citotrofoblastos recentemente isolados. Uma sonda marcada radioactivamente que se originou a partir de uma região promotora Syncytin-2 foi sintetizada. A sonda sintetizada (designado WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') foi mostrado previamente para ligar a factores de transcrição relacionados com o CREB 7. Na presença de extr nuclear actos de 24 e 48 h citotrofoblastos vilosidades cultivadas, a sonda Syncytin-2-promotor derivada mostrou a presença de dois complexos de ADN-proteína. A adição de 100x frio oligonucleótido WT competiu para a formação do complexo, ao passo que nenhuma competição semelhante com um excesso de um oligonucleótido não relacionado frio (rato da crista neural Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') foi observada, confirmando a especificidade de ambos os sinais ( A Figura 3).
Figura 1. Avaliação da pureza de citotrofoblastos vilosidades primárias através de citometria de fluxo. Recentemente isoladas de preparações citotrofoblastos vilosidades foram permeabilizadas primeiro e, em seguida, marcadas com anticorpo de controlo do isotipo (linha vermelha) ou anticorpo monoclonal específico para a citoqueratina-7 (linha preta). As células foram analisadas por citometria de fluxo. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Comparação de siRNA eficiências de transfecção entre transfecção à base de lípidos e formação de microporos. Citotrofoblastos vilosidades isoladas de fresco foram transfectadas com 300 ng de Syncytin-2-específica ARNsi contra um siRNA de controlo codificado utilizando o reagente à base de lípidos ou de formação de microporos. As análises de Western blot (A) foram realizadas em extractos celulares a partir de cada uma das condições de transfecção utilizando anticorpos anti-anti-GAPDH Syncytin-2 e. (B) os níveis de proteína Syncytin-2 a partir de análises de Western blot foram quantificados em termos de intensidade das bandas seguintes normalização com sinais GAPDH correspondente (barras de erro são definidos como SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os complexos de ADN-proteína identificada por análise de EMSA. Os extractos nucleares a partir de citotrofoblastos vilosidades primárias cultivadas durante 24 ou 48 horas foram incubadas com uma sonda de WT correspondente a uma região promotora de Syncytin-2 com ou sem excesso de (100x) de específica ou inespecífica oligonucleótidos frio. complexos DNA-proteína foram separados sobre a migração num gel nativo. sinais específicos e sondas livres são indicados no lado direito do gel. WT sonda incubada na ausência de extracto nuclear foi também utilizada como um controlo negativo. CT NE = extractos nucleares citotrofoblasto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| % De Percoll definitiva | Volume de Percoll (90%) (ml) | Volume de HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0,67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2,00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1,17 |
| 50 | 1,67 | 1.33 |
| 45 | 1,50 | 1,50 |
| 40 | 1.33 | 1,67 |
| 35 | 1,17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2,00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0,67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0,33 | 2.67 |
| 5 | 0,17 | 2.83 |
Tabela 1. 5% gradiente configuração silica revestida com polivinilpirrolidona -70%.
| Amortecedor | Composição | Comentários / Descrição |
| PBS 1x | CaCl 0,9 mM, 2, 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 0,5 mM de MgCl2, NaCl 136,9 mM e 0,8 mM de Na 2 HPO 4 | |
| tampão RIPA | 150 mM de NaCl, 1,0% de NP-40 ou 0,1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS (dodecilsulfato de sódio), Tris-HCl 50 mM pH 8,0 | |
| Tampão de amostra de Laemmli | 4% de SDS, 10% de 2-mercaptoethanol, 20% de glicerol, 0,004% de azul de bromofenol, 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x tampão de corrida | Tris base 25 mM, glicina 190 mM, SDS a 0,1% | |
| buffer de transferência de 10x | Tris base 25 mM, glicina 192 mM | |
| tampão TBST 1x | Tris-HCl 10, 15 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20 a pH 7 | Misture bem e filtrar. A falta de filtro pode levar a "mancha" da membrana. |
| tampão de bloqueio | 5% de leite ou de BSA (albumina de soro de bovino) adicionada a tampão de TBST 1x | |
| tampão TE | mM de Tris-HCl a 10 (pH 8,0), 1 mM de EDTA | |
| tampão de emparelhamento | NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl 2 100, EDTA 0,2 mM, DTT 1 mM | |
| Mudança 5x Gel Binding Buffer | 20% glicerol, 5 mM de MgCl2, EDTA 2,5 mM, DTT 2,5 mM, NaCl 250 mM, Tris-HCl a 50 (pH 7,5) e 0,25 mg / mL de poli (dl-dC). | |
| tampão de carregamento | Tris-HCl 250 (pH 7,5), 0,2% de azul de bromofenol e glicerol a 40% | |
| TBE 5x | Dissolve-se 54 g de Tris Base e 27,5 g de ácido bórico em 1 L de água desionizada, que inclui 20 mL de 0,5 M de EDTA, pH 8 | |
| 4% em gel nativo | 5x tampão TBE | 6,0 ml |
| 29: 1 de acrilamida / bisacrilamida (30% w / v) | 10 ml | |
| 40% de acrilamida (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% de glicerol | 1,5 ml | |
| Água destilada | 41,5 ml | |
| Persulfato de amónio a 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacrei gel (6 ml) para SDS-PAGE | ddH2O | 4,1 ml |
| 30% de acrilamida | 1,0 ml | |
| 1,0 M de Tris | 0,75 ml | |
| 10% de SDS | 60 ul | |
| 10% APS | 60 ul | |
| TEMED | 6 ul | |
| 12% de separação em gel (10 ml) para SDS-PAGE | ddH2O | 3,3 ml |
| 30% de acrilamida | 4,0 ml | |
| 1,5 M de Tris | 2,5 ml | |
| 10% de SDS | 100 ul | |
| 10% APS | 100ul | |
| TEMED | 4 ul |
Tabela 2. Composição de buffers.
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Discussion
Estudos sobre a função da placenta humana e desenvolvimento têm sido muito melhorada através de protocolos destinados a optimizar o isolamento de várias populações de células da placenta. Um dos melhores população de células da placenta estudado continua a ser o citotrofoblastos vilosidades, o estudo de que muito tem beneficiado de protocolos otimizados que permitem o isolamento eficiente e confiável. Isto permitiu ainda um certo número de experiências, tais como estudos de transfecção e promotor. Usando um protocolo previamente descrito 3, pode ser obtido populações puras de citotrofoblastos vilosidades primárias. CK-7 é uma proteína de filamento intermediário, que é expresso em citotrofoblastos. Os anticorpos monoclonais contra esta proteína são usados para determinar a pureza desta população trofoblasto após o seu isolamento a partir da placenta 10. As preparações são para ser definido puro quando 96% das células são positivas para CK-7. As células podem subsequentemente ser utilizado directamente para transfecção. protocolos de transfecçãoenvolvendo as abordagens baseadas em lípidos são amplamente usadas para transferir ácidos nucleicos para as células primárias 11,12. No entanto, a toxicidade da formulação lipídica em algumas células torna-se uma desvantagem. Microporos é uma tecnologia de eletroporação usando uma ponteira como um espaço de eletroporação, que gera calor mínima, a dissolução de iões de metal, variação de pH e formação de óxido; todos os quais podem ser prejudiciais para as células. Com base nos dados aqui apresentados, de formação de microporos representa uma abordagem mais eficiente para entrega de siRNA que o protocolo de transfecção à base de lípidos, tal como avaliado por análise de Western blot. Usando uma abordagem EMSA, uma sonda concebida contra uma região seleccionada do promotor Syncytin-2 que se sabe ligar factores importantes para a sua actividade 7 foi testada. A sonda foi incubado com extracto nuclear de citotrofoblastos isoladas. Como apresentado na Figura 3, foram obtidos sinais específicos.
Os diferentes protocolos aqui descritos have foi otimizado nos últimos anos. No entanto, todos eles contam com preparações citotrofoblasto alta qualidade, que dependem de um certo número de etapas críticas. Em primeiro lugar, após o nascimento, as placentas precisam ser mantidos numa solução tampão e as células têm de ser isolados a partir deles não mais do que 5 horas depois de ter sido imersa na solução. Tripsina e DNase tratamentos também são de grande importância e deve ser cuidado, para maximizar a qualidade da preparação citotrofoblasto. lavagem extensa das vilosidades da placenta e redução do tempo necessário para o seu isolamento são ambos melhorias adicionais, que podem atualizar fortemente a eficiência do isolamento número de células. O rendimento deste protocolo ainda depende centrifugação ideal durante a etapa de gradiente de densidade, que devem ser cuidadosamente monitorizados. A falha em equilibrar adequadamente os tubos também vai levar a uma distorção do gradiente e reduzir drasticamente o número de células.
O protocolo de transfecção descreverd aqui foi testado por mais vários anos. Embora as condições necessárias para a formação de microporos são geralmente linear, a optimização da transfecção de várias células primárias são, todavia, necessária. Isto também envolve a optimização da quantidade de ácido nucleico transfectado (siRNA ou de ADN de plasmídeo). Assim, para o protocolo descrito aqui, a optimização de várias concentrações siRNAs é recomendado para identificar um siRNA eficientemente reprimir. A adição de um volume de suspensão apropriado para a pelete de células, antes de formação de microporos e a suspensão completa das células são factores adicionais que afectam a eficiência da transfecção.
experimentos EMSA também exigiram otimização. Dada a heterogeneidade associado com os doadores placenta e as variáveis eficiência de isolamento citotrofoblasto e purezas, experimentos AESM precisa ser repetido até 5 vezes para confirmar os resultados. Além disso, com números elevados de células é importante para garantir suficiente protenos níveis em preparações de extrato nucleares e subsequente detecção de complexos de proteína / DNA. Além disso, sondas de oligonucleotídeos altamente radioativos deve ser preparado e deve ser preparado a partir de ATP radioactivo comprado recentemente.
Uma série de limitações deve ser sublinhada no protocolo apresentado. Primeiro, ele precisa ser salientado que a citometria de fluxo análises não pode avaliar a potencial presença de fragmentos sinciciotrofoblasto em preparações celulares. Têm sido propostos outros protocolos para resolver este problema, tal como a triagem utilizando a citometria de fluxo ou a utilização de contas magnéticas ligadas a anticorpos 13,14. Deve ser mencionado que esses fragmentos que normalmente não aderem aos poços de cultura de células e são muitas vezes removidos seguindo o passo de lavagem celular. Outra limitação com o protocolo apresentado é que citotrofoblastos vilosidades primárias têm um tempo de sobrevivência muito limitado em cultura de células. Assim, independentemente do método seleccionado, a transfecção estável de Vilcitotrofoblastos Lous permanecerá inatingível. analisa EMSA, conforme descrito neste protocolo, também têm certas limitações. Embora a especificidade dos sinais pode ser facilmente avaliada por experiências de competição com um excesso de oligonucleótidos não marcadas, os factores ligados só podem ser identificados utilizando anticorpos contra factores de transcrição específicos que resultam em sinais supershifted. Experimentos EMSA, além disso, continuam a ser limitados, uma vez que estuda em interações DNA-proteína in vitro. Experimentos com configurações mais representativas, como ensaio de Chip, e mais recente em protocolos in vivo são necessários para confirmar ainda mais o resultado EMSA.
Os protocolos aqui descritos para o isolamento citotrofoblasto e transfecção ter aplicações importantes para estudos em que se necessita silenciamento temporário ou a sobre-expressão de genes específicos para compreender o seu papel na função, a proliferação ou diferenciação de um tipo de célula trophoblast específico. Além disso, após a transfecção, tagged versões das proteínas expressas serão adequados para o rastreamento intracelular e analisa por meio de técnicas padrão, tais como microscopia confocal e citometria de fluxo. O protocolo de EMSA pode ser usado para estudar detalhes intrincados relativos à regulação do promotor e os factores de transcrição envolvidos. Além disso, esta abordagem experimental vai permitir aos investigadores para identificar factores envolvidos no desenvolvimento de certas doenças relacionadas com a deficiência de placentação e a regulação alterada de genes expressos em citotrofoblastos vilosidades.
Em conclusão, citotrofoblastos primários humanos pode ser facilmente isolado a partir de placenta e são passíveis de protocolos padrão, tais como siRNA transfecção e a EMSA. Embora diferentes procedimentos de transfecção, tais como lipofecção 15 e 16 estão disponíveis nucleofection, microporos parece um método muito eficiente para a transfecção de siARN isolado citotrofoblastos vilosidades, que oferece uma abordagem com limitada de célulasATH e custo relativamente baixo. No contexto da citotrofoblastos vilosidades, esta abordagem deverá permitir o silenciamento de genes diferentes ea avaliação da sua implicação em várias funções ou características do tipo de célula. Além disso, a transfecção de vetores de expressão também é viável utilizando este protocolo e irá produzir dados complementares para a abordagem baseada em siRNA. No que diz respeito à EMSA, esta técnica proporciona um método mais rápido e mais simples de avaliar os complexos proteína-ADN, quando comparada com as abordagens alternativas, tais como a DNase I footprinting, ensaio de interferência da metilação, imunoprecipitação da cromatina e conformação da cromatina análises. Assim, esta técnica continua a ser valiosa no promotor análises standard ou ensaio de quaisquer outras regiões de DNA potenciador / contendo supressores. Nossa demonstração do seu uso confiável para citotrofoblastos vilosidades é importante, uma vez que acrescenta informações sobre a regulação dos genes, com potenciais implicações ao nível funcional. apesar de suatempo limitado em cultura, citotrofoblastos vilosidades primárias são adequados para estudos padrão e deve ser adaptável a mais recente, bem como métodos informativos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciências e Pesquisa de Engenharia do Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT foi apoiado por uma bolsa FARE institucional. AV foi apoiado por um Ph.D. NSERC Graham Bell Bolsa. BB realizou uma Research Chair Canadá em Retrovirology Humano (Tier 2). Graças a Beatrix Beisner para ajudar na revisão do texto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
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