Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for effektiv transfeksjon av siRNA i nylig isolerte humane villous cytotrophoblasts ved hjelp microporation og identifisering av DNA-proteinkomplekser i disse cellene. Transfekterte celler kan overvåkes ved hjelp av Western blot-analyser og EMSA i løpet av 4 dagers kultur tid.
Protocol
Den UQAM etiske komité har godkjent disse protokollene, som er i samsvar med retningslinjene for etisk komité for St-Luc Hospital av Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada). Deltakerne undertegnet et informert samtykkeskjema.
1. Medium Fremstilling og isolering av Primære villøse Cytotrophoblasts
- Fremstille dyrkningsmedium for humane primære villous cytotrophoblasts ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 25 mM HEPES, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Filtrer forberedt medium gjennom sterilt 0,22 mikrometer filter og oppbevar i en -20 ° C fryser i porsjoner på 50 ml.
- Isoler primære villous cytotrophoblasts fra ferske placentas følgende standardprotokoller 3.
- Ved hjelp av tang, fjerne fosterhinnen fra vevet ved å forsiktig skrape den av, men som samtidig er forsiktig med å fjerne villøse vev. Skjærværende placenta villi i terninger ca 3 x 3 cm ved hjelp av skalpell og saks. Grundig vask med vann som inneholder 0,9% NaCl for å fjerne mors blod.
- Holde hver kube med tang, forsiktig fjerne villøse vev fra resterende skipene og vev ved hjelp av saks fiber.
- I 15 til 30 mg villøse vev, fordøye fire ganger i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) inneholdende trypsin (fra 9,6 x 10 5 til 1,8 x 10 6 U, sluttkonsentrasjon 1,2 mg / ml) og deoksyribonuklease I (DNase I) ( sluttkonsentrasjon 200 pg / ml) i 30 minutter ved 37 ° C i et vannbad med kontinuerlig risting.
Merk: Bruk 150 ml totalt volum for første fordøyelsen, 100 ml for andre fordøyelsen og 75 ml for de to gjenværende digestions.
- Samle supernatanten inneholdende dispergerte celler og sentrifuger ved 1250 xg i 15 minutter uten brems. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml forvarmet DMEM innehold1% penicillin / streptomycin.
- Layer de dispergerte celler på toppen av en diskontinuerlig 5% - 70% polyvinylpyrrolidon belagt silika gradient (se tabell 1 for fremstilling gradient) og sentrifuger i 23 minutter ved 507 xg uten brems. Fjern tettheten laget mellom 1,017 til 1,033 ved aspirasjon og samle lagene mellom 40% og 50% i gradienten med en ny pipette. Vask cellene i stor utstrekning med 10 ml forvarmet DMEM inneholdende 1% penicillin / streptomycin.
Merk: De innsamlede brøkdel tilsvarer tettheter mellom 1,048 og 1,062, som havner trophoblasts. - Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. I korthet, blande cellene og tilsett 10 ul i et nytt mikrosentrifugerør. Tilsett 10 mL av trypanblått og bland forsiktig på nytt. Tegn opp cellesuspensjonen og fylle hemocytometer kamre. Tell cellene under 10X objektiv.
- Plasser 1 x 10 6 og 4,5 x 10 6 celler i separate rør for bruk i §§ 1.3 og 2, respektively. Seed de resterende celler i en tetthet på 1,5 x 10 6 celler / brønn i DMEM supplert medium og kulturen ved 37 ° C og 5% CO2 i et maksimalt 4 dager for andre eksperimenter.
- Ved hjelp av tang, fjerne fosterhinnen fra vevet ved å forsiktig skrape den av, men som samtidig er forsiktig med å fjerne villøse vev. Skjærværende placenta villi i terninger ca 3 x 3 cm ved hjelp av skalpell og saks. Grundig vask med vann som inneholder 0,9% NaCl for å fjerne mors blod.
- Evaluering av renhet av isolerte primære villous cytotrophoblasts
- Spinn 1 x 10 6 av de nylig isolerte cytotrophoblasts i Mikrosentrifugerør ved 300 x g. Kast supernatanten og tilsett 1 ml forvarmet fosfat-bufret saltvann (PBS). Sentrifuger cellene ved 300 xg og fjerne PBS ved aspirasjon.
- Tilsett 1 ml kald metanol til cellene og inkuberes ved -20 ° C i 20 min. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter og fjerne metanol ved aspirasjon.
Forsiktig: Bruk beholderen maske, vernebriller og gummihansker ved håndtering av metanol. - Tilsett 1 ml PBS ved romtemperatur for å rehydrere celler, sentrifuger ved 300 xg og fjerne PBS ved aspirasjon.
- Inkuber cellene i PBS inneholdende FBS (1:50 [v / v] fortynning) og en FcRblokkerende reagens (01:10) i 45 minutter ved romtemperatur for å eliminere ikke-spesifikk binding.
- Vask to ganger med 500 mL av romtemperatur PBS, sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter og fjerne PBS ved aspirasjon. Resuspender celler i 100 ul PBS romtemperatur.
- Inkuber cellene med et mus monoklonalt fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert anti-human cytokeratin-7 antistoff klon LP5K (1: 200) eller et isotype kontroll-matchet ikke-spesifikt antistoff i PBS inneholdende 0,2% BSA i 45 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask celler i PBS.
- Analyser cellene ved flowcytometri 3. Bruk cellepreparater, som viser et minimum av 96% CK-7-positive celler ved flow cytometri for videre eksperimenter.
2. siRNA Transfeksjon av humane primære villøse Cytotrophoblasts
- Transfeksjon av humane primære villous cytotrophoblasts ved hjelp av en microporation enhet
- Fremstille 6-brønners plater som inneholdt2 ml supplementert DMEM-medium for inkubasjon av microporated celler.
- Etter isolering av primær cytotrophoblasts (se avsnitt 1.2), ta en delmengde av celler i suspensjon og bestemme celle nummer ved hjelp av en hemocytometer.
- Overfør 1,5 x 10 6 celler til et mikrosentrifugerør og pellet-celler ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med 1 ml Dulbeccos PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + -fri) og pelletere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 100 pl buffer resuspensjon.
Merk: Unngå å holde cellesuspensjon i mer enn 15-30 minutter ved romtemperatur, for å maksimere cellenes levedyktighet og transfeksjonseffektiviteten. - Tilsett 300 ng av Syncytin-2 siRNA (eller kontroll-kryptert siRNA) til 1,5 ml mikrosentrifugerør og suge den celle siRNA blandingen ved å bruke en 100 ul pipette transfeksjon. Sett innpipetten inn på stasjonen (se liste over materialer) og utsette cellene til en 1300 V enkelt puls på 30 millisekunder.
- Umiddelbart overføre cellene til 6-brønns plater (fremstilt i trinn 2.1.1) inneholdende 37 ° C forvarmet supplementert medium for å unngå celleskade.
- Gjenta trinn 2.1.5 og 2.1.6 for de resterende prøvene.
- Rist forsiktig platen i 30 sekunder for å sikre jevn fordeling av cellene. Inkuber platen ved 37 ° C i en fuktet CO2-inkubator i 24 til 48 timer. Oppdater dyrkningsmedium 24 timer etter transfeksjon.
- Evaluere transfeksjon effektiviteten ved Western blot analyse (se trinn 3-6).
- Lipofeksjon av siRNA i humane primære cytotrophoblasts
- Etter isolering av villous cytotrophoblasts, frø cellene ved en tetthet på 1,5 x 10 6 celler pr brønn i 6-brønns plater i 2 ml kulturmedium og inkuber i 18 timer.
- Fortynn 300 ng av Syncytin-to-spesifikke siRNA (eller kontroll-kryptertsiRNA) og 5 ul lipid-baserte transfeksjon reagens i separate 1,5 ml rør i et totalt volum på 10 ul antibiotic- og serumfritt medium. Inkuber i 5 min.
- Bland de fortynnede reagenser og inkuberes i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur for å danne den transfeksjon komplekset. Legg 90 ul antibiotic- og serumfritt medium til blandingen til et sluttvolum på 100 ul.
- Fjerne kulturmedium fra den 6-brønns plater (trinn 2.2.1). Tilsett 2 ml friskt medium, og 100 ul transfeksjon blanding til hver brønn. Inkuber cellene ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 24 til 48 timer. Oppdater dyrkningsmedium 24 timer etter transfeksjon.
- Evaluere transfeksjon effektiviteten ved Western blot analyse (se trinn 3-6).
3. Utarbeidelse av Lysates fra Whole Cell Culture
- Fjern media og skyll hver brønn (fra trinn 2.1.8 og 2.2.4) ved hjelp av pre-varmet DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratis). Aspirer DPBS og tilsett 500 mL av 0,25% trypsin / ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Inkuber i 1-3 minutter ved 37 ° C i en CO2 inkubator. Stopp trypsin behandling ved å tilsette 500 mL av serum som inneholder vekstmedier.
Merk: Bruk egnede medievolumet i henhold til type av kolben / parabol: 1 ml per 10 7 celler / 100 mm skål / 150 cm 2 kolbe; 0,5 ml pr 5 x 10 6 celler / 60 mm tallerken / 75 cm 2 kolbe. - Overfør cellene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med DPBS (Mg2 +, Ca2 + -fri) og pellet-celler ved sentrifugering ved 300 x g i 2 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten. Plasser røret på is. Resuspender pelleten i 50-200 pl iskald Radio-Immunoutfelling Assay (RIPA) buffer (se tabell 2 for bufferblanding) som inneholder ferskt leggeed protease og fosfatase hemmere ved en 1x endelig konsentrasjon. I korthet, vortex tube og la på is i 30 min.
- Sentrifugering ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Plasser forsiktig røret på is. Ved hjelp av en pipette, overføres supernatanten til en ny på forhånd avkjølt mikrosentrifugerør holdt på is. Kast pelleten.
4. Utarbeidelse av Nuclear Utdrag fra dyrkede celler
- For hver brønn (trinn 1.2.5), vaske dyrkede cytotrophoblasts to ganger med 1 ml forvarmet DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratis). Aspirer DPBS og tilsett 500 mL av 0,25% trypsin / EDTA. Inkuber i 1-3 minutter ved 37 ° C i en CO2 inkubator og stoppe trypsin behandling ved tilsetning av 500 ul av serum inneholdende vekstmedium.
- Overfør cellene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med DPBS (Mg 2+, Ca 2+-fri) og pelletsceller ved sentrifugeringved 300 xg i 2 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig all supernatanten uten å forstyrre pelleten og plassere røret på is.
- Pakk kjerneprotein i henhold til produsentens instruksjoner. Bestem proteinkonsentrasjon for hver prøve ved å bruke protein kvantifisering analyse (Bradford eller bicinchoninic syre-analyse (BCA)).
5. Prøvepreparering og elektroforese
- Bestem proteinkonsentrasjonen for hver celleekstrakt ved hjelp av en protein kvantifisering analyse (for eksempel, Bradford 8 eller BCA 9).
- I henhold til produsentens instruksjoner (hvis antistoffer kan brukes i reduksjons og denatureringsbetingelser), tilsett et likt volum av 2 x Laemmli-prøvebuffer (tabell 2) til 20-30 ug totalt protein.
- Kok cellelysater ved 100 ° C i 5 min. Alikvoter 50-100 ul lysat for å unngå gjentatte fryse / tine-sykluser og lagre de gjenværende rørene ved -20 ° C for fremtidig bruk. Mens prøvene er oppvarming, forberede en liter 1x buffer (tabell 2).
- Spin prøvene ved 16 000 xg i noen sekunder før du legger dem på is.
- Last lik mengde protein i hver brønn av en 12% SDS-PAGE-gel (se tabell 2 for gelblandingen), sammen med en molekylvekt markør. Kjør gelen ved 1 til 2 timer ved 100 V.
6. Overføring av protein fra gelen til membranen
- Aktiver polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med metanol i 1 min og skyll med 1x overføringsbuffer / 10% metanolløsning. Ifølge produsentens instruksjoner, overføre i 30 min til 1 time avhengig av protein størrelse.
Merk: Transfer effektivitet kan vurderes ved hjelp Ponceau Red flekker før blokkeringstrinn.
7. Antistoff Farging
- Blokkere membranen i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C ved anvendelse av 5% blokkeringsoppløsningen.
- Inkuber membranen med anti-Syncytin-2-antistoffer (4 ug / ml; 1: 5000) 6, eller med anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) i 5% blokkeringsoppløsningen natten over ved 4 ° C (anti-Syncytin-2) eller i 45 minutter ved romtemperatur. Vask membranen tre ganger i Tris-bufret saltvann Tween (TBST; se tabell 2 for bufferblanding) i 5 min.
- Inkuber membran med passende pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-kanin eller anti-mus-antistoff (1: 10000) i 5% blokkeringsbuffer i TBST ved romtemperatur i 1 time. Vask membranen tre ganger i TBST i 5 minutter og deretter skylles i TBS. Oppdage signaler ved hjelp av chemiluminescence baserte blotting substrat.
8. Radiomerking av enkelt oligonukleotid
- fosforyleringsreaksjonen
- I en mikro tube, tilsett 50 ng av en fremtids oligonukleotid sammen med 1x T4 polynukleotidkinase buffer, en UT4 polynukleotidkinase og 20 uCi (γ- 32 P) ATP og utgjør reaksjonsvolumet til 20 ul med nuklease-fritt vann.
- Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter. Stopp reaksjonen ved å tilsette 5 ul 0,5 M EDTA. Gjør opp volumet til 50 pl med nukleasefritt vann.
- Fjerning av kommunefritt nukleotider fra oligonukleotider
- Forbered en G-25-kolonne likevekt med TE buffer (tabell 2) etter produsentens anvisninger. Plasser kolonnen i en frisk DNase-fri 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sakte legger 50 ul probe (fra trinn 8.1.2) over harpiks, være forsiktig for ikke å forstyrre harpikssjiktet. Spinn i 2 minutter ved 350 x g for å samle opp renset prøve i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Vask G-25-kolonne med 36 ul av nuklease-fri vann og sentrifugering i 2 minutter ved 350 x g for å samle det i mikrosentrifugerør.
- Hybridisering med komplementære tråden oligonucleotide
- Overfør den radiomerkede probe (86 ul) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 200 ng av den reverserte oligonukleotid og 1x av sammensmeltningsbuffer (tabell 2). Varme 5 min ved 95 ° C og la over natten ved værelsestemperatur for kjøling.
- Fremstille ikke-radioaktive dobbelt-trådede oligonukleotider ved tilsetning av 50 ng umerket forover og bakover oligonukleotider og 1x av sammensmeltningsbuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjør opp volumet til 100 mL med nukleasefritt vann. Varmen og holde ved romtemperatur som beskrevet i trinn 8.3.1.
9. Utarbeidelse av en ikke-denaturerende polyakrylamidgel for EMSA
- Fremstille en 4% innfødt gel (10 x 12 cm) med en 1,5 mm plass kam (se tabell 2 for gelblandingen). Rengjør alle glassplater som bruker destillert vann.
Merk: Det er viktig at platene være helt fri for ionisk vaskemiddel, som SDS. - umiddelbart pvår akrylamid oppløsning i mellom platene og tillate polymeriseringen å fortsette (ca. 30 min).
- Monter elektroforese apparater og fylle tanken med 0.5x TBE. Forhånds kjøre gelen i 30 minutter til 1 time ved 150 V før prøven lasting.
10. DNA bindingsreaksjon
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 10 mikrogram av kjerneekstrakt (trinn 4.3) i 1x Gel Shift Binding buffer (tabell 2) og utgjør den endelige volumet til 10 pl med nukleasefritt vann. Som en kontroll, forberede et rør uten kjerneekstrakt. For konkurransen reaksjonen, tilsett 1 ul kald ikke-spesifikk eller spesifikke dobbeltkjedet oligonukleotid (trinn 8.3.2).
- Tilsett 1 pl av radioaktiv probe fra trinn 8.3.1 til hver reaksjon. Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 20 min. Tilsett 1 mL av 10x gel lastebuffer per reaksjon og laste hver prøve på gelen utarbeidet i § 9.
- Kjør gel for 1 1/2 til 2 timer ved 150 V. Etter migrasjon, pakk gelen og glasset i en plastfolie og posisjon i en eksponering kassett under en fosforskjerm. La kassett ved 4 ° C i 24 timer.
- Ta av skjermen fra eksponering kassetten og sett i fosfor bildeenhet for skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ferske placentas fra sikt svangerskap ble brukt til å isolere humane primære villous cytotrophoblasts å gjennomføre settet med eksperimenter som presenteres i protokollen delen. Etter deres isolasjon, vi først analysert renheten av cytotrophoblasts gjennom bruk av den cytokeratin-7 markør (figur 1). Cellepreparater ble så farget ved å bruke et monoklonalt anti-cytokeratin-7 antistoff. Figur 1 viser resultatene fra et typisk forsøk etter rensing av primære villous cytotrophoblasts, analysert ved hjelp av standard strømningscytometri. Etter den densitetsgradient trinnet, er> 97% celler (i dette tilfellet 99%) positivt farget for cytokeratin-7 i standard forsøk, og dermed viser en meget høy grad av effektivitet i rensing av denne celletype.
Etter deres isolasjon, kan humane primære cytotrophoblasts brukes direkte for transfection. To forskjellige protokoller ble evaluert, det vil si, microporation og lipid-baserte transfeksjon. Begge protokoller ble testet med siRNA spesifikke for Syncytin-2-mRNA og sammenlignet med en kodet siRNA (negativ kontroll). Transfeksjonseffektiviteten ble derefter undersøkt ved Western blot-analyse. Resultatene bekreftet at Syncytin-2 uttrykk ble betydelig dempet i cytotrophoblast-avledet ekstrakter på microporation (figur 2). På den annen side ble ingen signifikant lyddemping bemerket når sirnas ble transfektert ved lipid-baserte transfeksjon reagens.
Vi har også gjennomført EMSA eksperimenter på nylig isolerte cytotrophoblasts. En radiomerket probe som stammer fra en Syncytin-2 promoter regionen ble syntetisert. Det syntetiserte probe (betegnet WT, 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') har tidligere blitt vist å binde CREB-relaterte transkripsjonsfaktorer 7. I nærvær av kjernefysisk extr handlinger fra 24 og 48-timers dyrkede villous cytotrophoblasts, den Syncytin-2-promotor-avledede probe viste tilstedeværelse av to DNA-proteinkomplekser. Tilsetning av kald 100x WT oligonukleotid konkurrerte for dannelsen av komplekset, mens ingen tilsvarende konkurranse med overskudd av en kald urelaterte oligonukleotid (mus nevrale kløft Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') ble observert, noe som bekrefter spesifisiteten av begge signaler ( figur 3).
Figur 1. Evaluering av renheten av primære villous cytotrophoblasts ved strømningscytometri. Fersk isolerte preparater av villous cytotrophoblasts ble først permeabilisert og deretter merket med isotype kontrollantistoff (rød linje) eller monoklonalt antistoff som er spesifikt for cytokeratin-7 (sort linje). Cellene ble analysert ved strømningscytometri. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sammenligning av siRNA transfeksjonseffektiviteter mellom lipid-baserte transfeksjon og microporation. Fersk isolerte villous cytotrophoblasts ble transfektert med 300 ng av Syncytin-to-spesifikke siRNA kontra en egge kontroll siRNA hjelp av lipid-basert reagens eller microporation. (A) Western blot analyser ble utført på cellulære ekstrakter fra hver transfeksjon tilstand ved hjelp av anti-Syncytin-2 og anti-GAPDH antistoffer. (B) Syncytin-2 protein nivåer fra Western blot analyser ble kvantifisert i form av bandet intensiteten følgende normalisering med tilsvarende GAPDH signaler (Feilfelt er definert som SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. DNA-proteinkomplekser som identifiseres av EMSA analyse. Kjerne ekstrakter fra primær villous cytotrophoblasts dyrket i 24 eller 48 timer ble inkubert med en WT probe svarende til en promoter region of Syncytin-2 med eller uten overskudd (100x) av spesifikk eller ikke-spesifikk kalde oligonukleotider. DNA-proteinkomplekser ble separert ved migrasjon på en innfødt gel. Spesifikke signaler og frie prober er vist på høyre side av gelen. WT sonde inkubert i fravær av kjerneekstrakt ble også brukt som en negativ kontroll. CT NE = cytotrophoblast atom ekstrakter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| % Av Percoll endelige | Volum av Percoll (90%) (ml) | Volum av HBSS (ml) |
| 70 | 2,33 | 0,67 |
| 65 | 2,17 | 0,83 |
| 60 | 2,00 | 1.00 |
| 55 | 1,83 | 1.17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1,50 | 1,50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1.17 | 1,83 |
| 30 | 1.00 | 2,00 |
| 25 | 0,83 | 2,17 |
| 20 | 0,67 | 2,33 |
| 15 | 0,50 | 2,50 |
| 10 | 0,33 | 2,67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Tabell 1. 5% -70% polyvinylpyrrolidon belagt silika gradient setting.
| Buffer | sammensetning | Kommentarer / beskrivelse |
| PBS 1x | 0,9 mM CaCl2, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2PO 4, 0,5 mM MgCl2, 136,9 mM NaCl og 0,8 mM Na HPO 2 4 | |
| RIPA buffer | 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 og 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), 50 mM Tris-HCl pH 8,0 | |
| Laemmli-prøvebuffer | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glyserol, 0,004% bromfenolblått, 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8 | |
| 10x kjører buffer | 25 mM Tris-base, 190 mM glycin, 0,1% SDS | |
| 10x overføringsbuffer | 25 mM Tris base, 192 mM Glysin | |
| TBST 1x buffer | 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 ved pH 7 | Bland godt og filtrere. Unnlatelse av å filter kan føre til "spotting" av membranen. |
| Blokkering buffer | 5% melk eller BSA (bovint serum albumin) tilsatt til TBST-buffer 1x | |
| TE-buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA | |
| gløding buffer | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| 5x Gel Shift Binding Buffer | 20% glycerol, 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 0,25 mg / ml poly (di-dC). | |
| Laster buffer | 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% bromfenolblått og 40% glycerol | |
| TBE 5x | Oppløs 54 g Tris-base og 27,5 g borsyre i 1 L deionisert vann, som inneholder 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8 | |
| 4% innfødte gel | TBE 5x buffer | 6,0 ml |
| 29: 1 akrylamid / bisakrylamid (30% vekt / volum) | 10 ml | |
| 40% akrylamid (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% glycerol | 1,5 ml | |
| Destillert vann | 41,5 ml | |
| Ammoniumpersulfat 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stackonge Gel (6 ml) for SDS-PAGE | DDH 2 O | 4,1 ml |
| 30% Akrylamid | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 mL | |
| 10% APS | 60 mL | |
| TEMED | 6 mL | |
| 12% separering Gel (10 ml) for SDS-PAGE | DDH 2 O | 3,3 ml |
| 30% Akrylamid | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 pl | |
| 10% APS | 100ul | |
| TEMED | 4 pl |
Tabell 2. Sammensetning av buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier av menneskelig morkakefunksjon og utvikling har blitt kraftig forbedret av protokoller som tar sikte på å optimalisere isolering av ulike placental celle populasjoner. En av de beste studert morkakecellepopulasjon forblir de villous cytotrophoblasts, studiet av noe som har stor nytte av optimaliserte protokoller som tillater effektiv og pålitelig isolasjon. Dette har ytterligere tillot en rekke eksperimenter, så som transfeksjon og promotor studier. Ved hjelp av en tidligere beskrevet protokoll 3, kan rene bestander av primær villous cytotrophoblasts oppnås. CK-7 er et mellomliggende filamentprotein som uttrykkes i cytotrophoblasts. Monoklonale antistoffer mot dette protein blir brukt til å bestemme renheten av trophoblast populasjonen etter deres isolering fra placenta 10. Preparater er definert til å være ren når 96% av cellene er positive for CK-7. Celler kan deretter anvendes direkte for transfeksjon. transfeksjon protokollerinvolverer lipid baserte tilnærminger er bredt brukt til å overføre nukleinsyrer inn i primære celler 11,12. Imidlertid blir toksisiteten av lipid preparat i noen celler en ulempe. Microporation er en elektroporasjon teknologi ved hjelp av en pipettespiss som en elektroporering plass, som genererer minimal varme, metall ion-oppløsning, pH-variasjon og oksyddannelse; som alle kan være skadelige for cellene. Basert på data presentert her, representerer microporation en mer effektiv metode for siRNA levering enn den lipid-baserte transfeksjon protokoll, som bedømt ved Western blot-analyser. Ved hjelp av en EMSA tilnærming, en probe konstruert mot en utvalgt region av Syncytin-2 promoter som er kjent for å binde viktige faktorer for sin aktivitet 7 ble testet. Proben ble inkubert med atom ekstrakt fra isolerte cytotrophoblasts. Som vist i figur 3, ble spesifikke signaler oppnådd.
De ulike protokoller beskrevet her have blitt optimalisert de siste årene. Men alle avhengige av høy kvalitet cytotrophoblast preparater, som er avhengig av et visst antall kritiske trinn. Først og fremst, etter fødselen, placentas må holdes i en bufferoppløsning og cellene må isoleres fra dem ikke mer enn 5 timer etter å ha blitt nedsenket i løsningen. Trypsin og DNase behandlinger er også av stor betydning og bør være nøye gjennomført for å maksimere kvaliteten på cytotrophoblast forberedelse. Omfattende vasking av morkaken villi og reduksjon av den tid som er nødvendig for deres isolasjon er begge ytterligere forbedringer, som sterkt kan oppgradere effektiviteten av celletallet isolasjon. Utbyttet av denne protokollen er avhengig videre på optimal sentrifugering under tettshetsgradient steg, som skal overvåkes nøye. Unnlatelse av å balansere rørene vil også føre til forvrengning av gradient og sterkt redusere celle tall.
Transfeksjon protokollen beskrived her har blitt testet i over flere år. Selv om forholdene som trengs for microporation er generelt grei, er optimalisering av transfeksjon for de ulike primærceller likevel nødvendig. Dette innebærer også optimalisering av mengden av transfekterte nukleinsyre (siRNA eller plasmid DNA). Derfor, for protokollen beskrevet her, optimalisering av ulike siRNAs konsentrasjoner er anbefalt å identifisere et effektivt undertrykke siRNA. Tilsetning av en passende suspensjon volum til cellepelleten før microporation og fullstendig suspensjon av cellene er flere faktorer, som påvirker transfeksjonseffektivitet.
EMSA eksperimenter har også nødvendig optimalisering. Gitt heterogenitet forbundet med morkaken givere og varierende cytotrophoblast isolasjon effektivitet og renhet, EMSA eksperimenter må gjentas opptil 5 ganger for å bekrefte resultatene. I tillegg har høye celleantall er viktig for å sikre tilstrekkelig protei nivåer i atomekstraktpreparater og påfølgende påvisning av protein / DNA-komplekser. Videre bør sterkt radioaktive oligonukleotidprober være forberedt, og bør være forberedt frisk fra nylig kjøpt radioaktivt ATP.
En rekke begrensninger må understrekes i den framlagte protokollen. Det må først understrekes at flowcytometri analyser ikke kan vurdere potensialet tilstedeværelse av syncytiotrophoblast fragmenter i cellepreparater. Andre protokoller er blitt foreslått for å løse dette problemet, slik som sortering ved hjelp av flow cytometri eller bruken av antistoff-bundne magnetiske kuler 13,14. Det bør nevnes at skjønt disse fragmentene normalt ikke holder seg til celledyrkningsbrønner og fjernes ofte følger cellen vasketrinn. En annen begrensning til den framlagte protokoll er det primære villous cytotrophoblasts ha en meget begrenset overlevelsestid i cellekultur. Følgelig, uavhengig av den valgte fremgangsmåten, stabil transfeksjon av VilLous cytotrophoblasts vil forbli uoppnåelig. EMSA analyser, som beskrevet i denne protokollen, har også visse begrensninger. Selv om spesifisiteten av de signaler som lett kan vurderes ved konkurranseeksperimenter med overskudd av umerkede oligonukleotider kan bindes faktorer bare bli identifisert ved anvendelse av antistoffer mot spesifikke transkripsjonsfaktorer som resulterer i supershifted signaler. EMSA eksperimenter videre forbli begrenset som det studier in vitro DNA-protein interaksjoner. Forsøk med mer representative innstillinger, for eksempel ChIP analysen, og nyere in vivo protokoller for å ytterligere bekrefte EMSA resultat.
Protokollene beskrevet her for cytotrophoblast isolasjon og transfeksjon har viktige programmer for studier der forbigående stanse eller overekspresjon av spesifikke gener for å forstå sin rolle i funksjon, spredning eller differensiering av en bestemt trophoblast celletype. I tillegg, ved transfeksjon, tagged versjoner av uttrykte proteiner vil være egnet for intracellulær sporing og analyser ved hjelp av standardteknikker, slik som konfokal mikroskopi og flowcytometri. Den EMSA protokollen kan brukes til å studere intrikate detaljer knyttet til arrangøren regulering og de impliserte transkripsjonsfaktorer. Videre vil dette eksperimentell tilnærming tillate forskere å identifisere faktorer involvert i utviklingen av visse sykdommer relatert til placentation mangel og endret regulering av gener uttrykt i villous cytotrophoblasts.
Som konklusjon, kan humane primære cytotrophoblasts være lett isolert fra placentas og er mottagelig for standardprotokoller, slik som siRNA transfeksjon og EMSA. Selv om forskjellige transfeksjon prosedyrer, slik som lipofeksjon 15 og nucleofection 16 er tilgjengelige, synes microporation en meget effektiv metode for siRNA transfeksjon av isolerte villous cytotrophoblasts, og tilbyr en metode med begrenset celle death og relativt lave kostnader. I sammenheng med villous cytotrophoblasts, bør denne tilnærmingen tillate stanse av forskjellige gener og vurdering av deres implikasjon i forskjellige funksjoner eller egenskaper ved celletype. I tillegg transfeksjon av ekspresjonsvektorer er også mulig ved bruk av denne protokollen, og vil gi komplementære data til siRNA-tilnærming. Med hensyn til EMSA, gir denne teknikken en hurtigere og enklere metode for å vurdere protein-DNA komplekser sammenlignet med alternative metoder, som DNase I footprinting, metylering forstyrrelser assay kromatin immunpresipitering og kromatin konformasjon analyser. Derfor er denne teknikken verdifull i standard analyser promoter eller testing av andre enhancer / suppressor-inneholdende DNA-områder. Vår demonstrasjon av sin pålitelig bruk for villous cytotrophoblasts er viktig, ettersom det gir informasjon om reguleringen av gener, med potensielle implikasjoner på funksjonsnivå. Til tross for deresbegrenset tid i kultur, primære villous cytotrophoblasts er egnet for standard studier og bør kunne tilpasses mer nyeste samt informative metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Sciences og Engineering Research Council of Canada (NSERC) (# 298527) (BB). CT ble støttet av en institusjonell FARE stipend. AV ble støttet av en NSERC Graham Bell Ph.D. stipend. BB holdt en Canada Research Chair i Human Retrovirology (Tier 2). Takk til Beatrix Beisner om hjelp i å revidere teksten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
