Summary
Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.
Protocol
Uqam etik kurul Centre Hospitalier Universitaire de Montréal St-Luc Hastanesi (Montréal, Kanada) etik komitenin kurallarına uygun olan bu protokolleri onayladı. Katılımcılar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.
1. Orta Hazırlama ve İlköğretim Villöz sitotrofoblastlar İzolasyonu
- 25 mM HEPES,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ilave etmek suretiyle, insan primer villöz sitotrofoblastlar için kültür ortamı hazırlayın. Bir steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden hazırlanan orta filtre -20 ila 50 ml'lik alikolar içinde ° C sıcaklıkta dondurucuya.
- Standart protokoller 3 Aşağıdaki taze plasenta primer villus sitotrofoblastlar izole edin.
- villöz doku kaldırmak için dikkatli olurken pense kullanarak, kapalı çizilme hafifçe tarafından dokudan fetal membran kaldırmak. Cutneşter ve makas kullanılarak yaklaşık 3 x 3 cm küp plasental villuslar kalan. İyice anne kanı çıkarmak için% 0.9 NaCl içeren su ile yıkayın.
- pense ile her küp Holding, dikkatle kalan gemiler ve fibröz doku kullanarak makasları villöz doku kaldırmak.
- Ve deoksiribonükleaz I (DNase I) (, villöz doku 15 ila 30 mg, (nihai konsantrasyon 1.2 mg / mL 9,6 x 10 5 1.8 x 10 6 U) Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ihtiva eden tripsin dört kez sindirimi sürekli çalkalanarak bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika süreyle nihai konsantrasyon 200 mg / ml).
Ikinci sindirim için 100 ml ve kalan iki sindirim için 75 ml ilk sindirim için 150 ml toplam hacmi kullanın: Not.
- Frensiz 15 dakika 1250 xg'de dağılmış hücreleri ve santrifüj içeren süpernatant toplayın. içeren prewarmed DMEM 1 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın% 1 penisilin / streptomisin.
- Fren yapmadan 507 x g'de 23 dakika boyunca% 70 polivinilpirolidon kaplanmış silika gradyanı (gradyan hazırlanması için Tablo 1 'e bakınız) ve santrifüj - bir süreksiz% 5 üstünde dağılmış hücrelere katman. Aspirasyon ile 1.033 kadar 1.017 arasındaki yoğunluk tabakası kaldırmak ve yeni bir pipet ile degrade% 40 ile% 50 arasında katmanları toplamak. % 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM önceden ısıtılmış 10 ml ile iyice hücreleri yıkayın.
Not: Toplanan fraksiyon trofoblast barındıran 1.048 ile 1.062 arasında yoğunlukları karşılık gelir. - Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Kısaca, hücreler karıştırmak ve yeni bir mikrosantrifüj tüpü içinde 10 ul ekle. Tripan mavisi 10 ul ekleyin ve hafifçe tekrar karıştırın. hücre süspansiyonu çizin ve hemositometre odaları doldurun. 10X objektif altında hücreleri saymak.
- 1 x 10 6 ve 4.5 x 10 bölümden 1.3 ve 2 kullanılmak üzere ayrı tüpler içine 6 hücre, ilgili koyunly. Diğer deneyler için 4 günlük bir süre için CO2, 37 ° C / de desteklenmiş DMEM aracı maddesi ve kültür 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda kalan hücreleri, tohum ve% 5.
- villöz doku kaldırmak için dikkatli olurken pense kullanarak, kapalı çizilme hafifçe tarafından dokudan fetal membran kaldırmak. Cutneşter ve makas kullanılarak yaklaşık 3 x 3 cm küp plasental villuslar kalan. İyice anne kanı çıkarmak için% 0.9 NaCl içeren su ile yıkayın.
- İzole primer villus sitotrofoblastlar saflık değerlendirilmesi
- Sıkma 300 x g mikrosantrifüj tüpleri içinde yeni izole edilmiş sitotrofoblastlar 1 x 10 6. Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 ml. Santrifüj hücreleri 300 xg'de ve aspirasyon ile PBS kaldırmak.
- hücrelere soğuk metanol 1 ml ilave edilir ve 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri ve aspirasyon ile metanol kaldırın.
Dikkat: metanol taşıma sırasında teneke kutu maske, koruyucu gözlük ve lastik eldiven kullanın. - 300 xg'de hücreleri, santrifüj rehidrate ve aspirasyon ile PBS çıkarmak için oda sıcaklığında PBS 1 ml ilave edilir.
- FBS (1:50 [hacim / hacim] seyreltme) bir FcR içeren PBS içinde inkübe hücreleriOda sıcaklığında 45 dakika boyunca reaktif (1:10) bloke spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de oda sıcaklığında 500 ul PBS, santrifüj hücreler iki kez yıkayın ve aspirasyon ile PBS kaldırmak. 100 ul oda sıcaklığı PBS içinde süspanse edin hücreleri.
- ya da oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 0.2 BSA içeren PBS içinde bir kontrol izotip eşleştirilmiş spesifik olmayan antikorda: bir fare monoklonal floresein izotiosiyanat (FITC) ile inkübe hücreleri anti-insan sitokeratin-7 antikoru klonu LP5K (200 1) ile konjüge edilmiş karanlık. PBS hücrelerin yıkayın.
- Flow sitometri 3 hücreleri analiz edin. başka deneyler için akış sitometrisi ile% 96 CK-7-pozitif hücrelerin en az göstermektedir hücre preparatları kullanın.
Insan primer Villöz sitotrofoblastlar 2. siRNA transfeksiyonu
- Bir mikro-gözeneklendirmeden cihazı kullanılarak insan primer villöz sitotrofoblastlar transfeksiyonu
- ihtiva eden 6 oyuklu plakalar hazırlamakmicroporated hücre inkübasyon için desteklenmiş DMEM aracı maddesi 2 ml.
- Birincil sitotrofoblastlar (Bölüm 1.2) izole edildikten sonra, süspansiyon içinde hücrelerin bir kısım almak ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı belirlenir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile mikrosantrifüj tüpü ve topak hücrelere 1.5 x 10 6 hücre transfer edin. 1 mi Dulbecco PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + içermeyen) hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
- Süpernatantı ve yeniden süspansiyon haline getirme tamponu 100 ul yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri.
Oda sıcaklığında uzun süre, 15-30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu tutmak önlemek hücre canlılığı ve transfeksiyon etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için: edin. - 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne Syncytin-2 siRNA (ya da kontrol-şifreli siRNA) 300 ng ekleyin ve bir 100 ul transfeksiyon pipet kullanarak hücre siRNA karışımı aspire. Ekleistasyona pipet (Malzeme listesi) ve 30 milisaniyelik bir 1.300 V tek darbe hücreleri tabi.
- Hemen, hücre hasarı önlemek için, 37 ° C önceden ısıtılmış ilave ortam içeren (aşama 2.1.1 hazırlandı) 6 çukurlu plakalara hücreleri transferi.
- Kalan numuneler için 2.1.5 ve 2.1.6 adımları.
- Yavaşça hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için 30 saniye için plaka sallayın. 24 ila 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe plakası. kültür ortamı transfeksiyondan 24 saat sonra yenileyin.
- Western blot analizi ile transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek (adımlar 6 3'e bakın).
- İnsan birincil sitotrofoblastlar siRNA lipofeksiyon-
- Villöz sitotrofoblastlar ve izole edildikten sonra, kültür ortamı 2 ml 6 yuvalı plakalar içinde oyuk başına 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücreler tohum ve 18 saat inkübe edilir.
- Syncytin-2-spesifik siRNA 300 ng seyreltin (veya kontrol-şifrelisiRNA) ve antibiyotiğe ve serum barındırmayan ortam, 10 ul toplam hacim içinde, ayrı 1.5 ml tüpler lipid bazlı transfeksiyon reaktifi 5 ul. 5 dakika boyunca inkübe edin.
- seyreltilmiş reaktifler karışımı ve transfeksiyon kompleksi oluşturmak üzere, oda sıcaklığında, ilave bir 20 dakika boyunca inkübe edin. 100 ul'lik nihai bir hacme kadar karışıma antibiyotiğe ve serumsuz ortam içinde 90 ul ekle.
- 6-delikli plakalardaki (aşama 2.2.1) kültür ortamının çıkarın. 2 taze ortam ilave edildi ve her bir oyuğa 100 ul transfeksiyon karışımı ekleyin. 24 ila 48 saat boyunca bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe hücreleri. kültür ortamı transfeksiyondan 24 saat sonra yenileyin.
- Western blot analizi ile transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek (adımlar 6 3'e bakın).
Tüm hücre kültüründen Lisatlar 3. hazırlanması
- Ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış DPBS kullanarak (adımlarda 2.1.8 ve 2.2.4 den) her durulama (2+ Mg Ca 2 + ücretsiz). DPBS aspire ve% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 500 ul ilave edin. Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 1-3 dakika boyunca inkübe edin. Serum içeren büyüme ortamı 500 ul ekleyerek tripsin tedaviyi durdurun.
Not: Uygun ortam hacminin şişe / çanak türüne göre: 10 7 hücre / 100 mm tabak / 150 cm2 şişe başına 1 mi; 5 x 10 6 hücre / 60 mm tabak başına 0.5 ml / 75 cm2 şişe. - Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri aktarın, pelet hücreleri. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile DPBS ile (Mg2 +, Ca2 + içermeyen) ve topak hücreler yıkanır.
- Dikkatle pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. buz üzerinde tüp yerleştirin. 50-200 ul buz soğukluğunda Radyo-immünopresipitasyon deneyi (RIPA), tampon (tampon bileşimi için Tablo 2'ye bakınız), taze ilave içeren pelletini1x nihai konsantrasyonda Ed proteaz ve fosfataz inhibitörleri. Kısaca, tüp vorteks ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de dönerler. Dikkatle buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir pipet kullanarak, buz üzerinde tutulan bir taze, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne süpernatantı aktarın. pelet atın.
Kültürlenmiş hücrelerin çekirdek özütleri 4. hazırlanması
- Her bir (adım 1.2.5) için, önceden ısıtılmış DPBS (Mg2 +, Ca2 + içermeyen), 1 ml ile iki kez kültür sitotrofoblastlar yıkayın. Aspire DPBS ve% 0.25 tripsin / EDTA, 500 ul ekle. Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 1-3 dakika boyunca inkübe ve serum ihtiva eden büyüme ortamı içinde 500 ul eklenmesiyle tripsin tedavisi dur.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri aktarın, pelet hücreleri. Santrifüj DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -ücretsiz) ve pelet hücreleri hücreleri yıkayınOda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 xg'de. Dikkatle pelet bozmadan tüm süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak, nükleer protein ekstresi. Protein ölçümü tahlili (Bradford ya bisinkoninik asit deneyi (BCA)) kullanılarak, her numunenin protein konsantrasyonu belirlenir.
5. Numune Hazırlama ve Elektroforez
- Bir protein miktar tayini kullanılarak, her hücre ekstresi protein konsantrasyonunu belirleyin (örneğin, Bradford 8 veya BCA 9).
- (Antikorlar azaltılması ve denatürasyon koşulları kullanılabilir ise), üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam proteinin 20-30 ug 2x Laemmli numune tamponu (Tablo 2) bir eşit hacmi ekleyin.
- 5 dakika boyunca 100 ° C'de kaynatılır hücre lizatlan. tekrarlanan donma / erime döngülerinden kaçınmak ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de, kalan tüplerini muhafaza etmek üzere lizatının kısım 50-100 ul. Numunelerin ısıtılmasıyla iken, tampon (Tablo 2) çalıştıran 1x 1 L hazırlar.
- bir kaç saniye için 16,000 x g'de örnekleri Spin ve buz üzerine yerleştirin.
- Molekül ağırlığı işaretleyici ile birlikte, bir% 12 SDS-PAGE jeli (jel bileşimi için Tablo 2'ye bakınız) her kuyuya proteinin eşit miktarda yükleyin. 100 V 2 saat 1 için jel çalıştırın
6. Membran Gel dan Protein aktarma
- 1 dakika boyunca metanol ile poliviniliden florit (PVDF) membran aktive ve 1X transfer tamponu /% 10 metanol çözeltisi ile yıkayın. üreticinin talimatlarına göre, bir protein boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 30 dakika boyunca aktarın.
Not: Aktarım etkinlik engelleme aşamasından önce Ponceau Kırmızı boyama kullanılarak değerlendirilebilir.
7. Antikor Boyama
- Oda sıcaklığında 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C de,% 5 engelleme çözeltisi kullanılarak MEMBRAN engeller.
- 6 ya da anti-gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH, 0,4 ug / ml; 1: 500) ile birlikte,% 5 bloke çözeltisi içinde gece boyunca: Anti-Syncytin-2 antikor (5.000 1 ila 4 ug / ml) ile membran inkübe 4 ° C (anti-Syncytin-2) ya da oda sıcaklığında 45 dakika karıştırıldı. Tris-tamponlu tuzlu su Tween Membran üç kez yıkayın (TBST tamponu bileşimi için Tablo 2'ye bakınız), 5 dakika boyunca.
- Uygun yaban turpu peroksidazı (HRP) ile konjüge edilmiş membran inkübe anti-tavşan veya anti-fare antikor ile (1: 10,000),% 5 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST içinde blokaj tamponunda. 5 dakika boyunca zarın TBST içinde üç kez yıkanır ve daha sonra TBS içinde durulayın. Kemiluminesan tabanlı blot substrat kullanılarak sinyalleri algılar.
Tek sarmal kollu oligonükleotit 8. Radyo-etiketlenmesi
- Fosforilasyon reaksiyonu,
- mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 U 1 x T4 polinükleotid kinaz tamponu ile bir ön oligonükleotidin 50 ng boyunca eklemeT4 polinükleotid kinaz ve 20 uCi (γ- 32 P) ATP ve nükleaz içermeyen su ile 20 ul reaksiyon hacmi oluşturuyor.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 0.5 M EDTA 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. nükleaz içermeyen su ile 50 ul hacim oluşturuyor.
- Oligonükleotidler, adi nükleotid uzaklaştırılması
- Imalatçının talimatlarına uygun olarak TE tamponu (Tablo 2) ile dengelenmiş bir G-25 sütunu hazırlayın. taze DNaz-özgür 1.5 ml mikrosantrifüj tüp sütun yerleştirin.
- Yavaş yavaş reçine yatağını rahatsız etmemek için dikkatli olmak, reçine üzerinde (adım 8.1.2 itibaren) sonda 50 ul ekleyin. 350 xg 2 dakika boyunca spin bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde saflaştırılmış örnek toplamak için. mikrosantrifüj tüpü içinde toplamak için 350 x g'de 2 dakika süre ile nükleaz içermeyen su ve spin 36 ul G-25 sütunu yıkayın.
- komplementer zinciri ol ile hibridizasyonigonucleotide
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne radyo-etiketli prob (86 ul) aktarın ve 200 ters oligonükleotidin ng ve tavlama tampon 1x (Tablo 2) ekleyin. Isıtma 95 ° C de 5 dakika ve soğutma için gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- İleri etiketlenmemiş 50 ng eklenerek radyoaktif olmayan iki-şeritli oligonükleotitlerin hazırlanması ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, oligonükleotitlerin ve tavlama tampon 1x tersine çevirir. nükleaz içermeyen su ile 100 ul birimi oluşturacak. Isı ve aşama 8.3.1 de tarif edildiği gibi, oda sıcaklığında tutun.
EMSA için denatüre edici olmayan poliakrilamid jeli 9. hazırlanması
- 1.5 mm'lik bir alanı tarak (jel bileşimi için Tablo 2'ye bakınız) ile 4% yerel jel (10 x 12 cm) hazırlayın. distile su kullanılarak tüm cam plakalar temizleyin.
Not: plakaları SDS gibi, iyonik deterjan tamamen ücretsiz olması önemlidir. - hemen pve levhalar arasında bizim akrilamid çözelti polimerizasyonu (yaklaşık 30 dakika) devam etmek için izin verir.
- elektroforez cihazı monte edin ve 0.5x TBE ile deposunu doldurun. Örnek yükleme öncesi 150 V de 1 saat 30 dakika boyunca jel ön çalıştırın.
10. DNA bağlama reaksiyonu
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 x jel kayma Bağlama tamponu (Tablo 2) nükleer ekstrakt (aşama 4.3) 10 ug ekleyebilir ve nükleaz içermeyen su ile 10 ul son hacim oluşturur. Bir kontrol olarak, nükleer ekstre içeren bir tüp hazırlanır. Yarışma reaksiyonu için soğuk spesifik olmayan ve spesifik çift kollu oligonükleotit (aşama 8.3.2) 1 ul ekle.
- Her reaksiyon için adım 8.3.1 radyoaktif prob 1 ul ekle. 20 dakika için oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. Reaksiyon başına 10x jel yükleme tamponu 1 ul ekleyin ve bölüm 9'da hazırlanan jel üzerinde her örnek yüklemek.
- 15 2 saat için 1 1/2 jel çalıştırınTaşıma işleminden sonra 0 V, bir fosfor ekranın altında bir pozlama kaset içinde bir plastik sargı ve konumda jel ve cam sarın. 24 saat boyunca 4 ° C'de kaseti bırakın.
- Pozlama kasetinden ekranı çıkarın ve tarama için fosfor görüntüleme cihazında yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
terimi, gebelik taze plasenta Protokol bölümde sunulan deneyler grubunu yapmak için insan primer villöz sitotrofoblastlar izole etmek için kullanılmıştır. Bunların izolasyonundan sonra, ilk sitokeratin-7 işaretleyici (Şekil 1) kullanılarak sitotrofoblastlar saflığını analiz edilmiştir. Hücre preparatları, böylece, bir monoklon anti-sitokeratin-7 antikoru kullanılarak boyandı. 1 sitometri, standart akış sitometrisi ile analiz primer villöz sitotrofoblastlar saflaştırılması Aşağıda, tipik bir deneyde, elde edilen sonuçları gösterir Şekil. yoğunluk gradyan adımından sonra, (bu durumda,% 99)>% 97 hücre pozitif dolayısıyla bu hücre tipinde saflaştırılmasında verimliliği çok yüksek derecede gösteren standart deneylerde sitokeratin-7 boyanır.
bunların izole edildikten sonra, insan primer sitotrofoblastlar doğrudan tra için kullanılabilirnsfection. İki değişik protokol, yani mikro-gözeneklendirmeden ve lipid bazlı transfeksiyon değerlendirilmiştir. Her iki protokol Syncytin-2 mRNA'nın spesifik siRNA ile test edilmiş ve bir karıştırılmış siRNA (negatif kontrol) ile karşılaştırılmıştır. Transfeksiyon etkinliği aşağıdaki Batı benek analizi ile değerlendirildi. Sonuçlar Syncytin-2, mikrogözeneklendirmede üzerine sitotrofoblast türetilmiş ekstrelerin (Şekil 2) susturulmuş olduğunu doğruladı. siRNA'lar lipit bazlı transfeksiyon reaktifi ile transfekte edilmiştir Diğer yandan, önemli bir susturma not edilmiştir.
Biz de taze izole sitotrofoblastlar üzerinde EMSA deneyler yaptı. Bir Syncytin-2 hızlandırıcı bölgeden kaynaklanan bir radyo-etiketli prob sentezlendi. (WT olarak adlandırılır; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') sentezlendi prob önceden CREB ilgili transkripsiyon faktörlerinin 7 bağlandığı gösterilmiştir. Nükleer extr varlığında 24 ve 48 saat kültüre villöz sitotrofoblastlar arasında hareket eder Syncytin-2-promotor kaynaklı prob iki DNA-protein kompleksleri varlığını göstermiştir. gözlenmiştir sinyalleri özgüllüğü (teyit; soğuk olmayan oligonükleotid fazla (5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ', fare sinir sorguç Enhancer 2) ile benzer bir rekabet ise 100x soğuk WT oligonükleotidin katılması, kompleksin oluşumu için rekabet Şekil 3).
Villöz sitotrofoblastlar Şekil akış sitometrisi yoluyla, birincil villöz sitotrofoblastlar saflık 1. değerlendirilmesi. Yeni izole edilmiş preparasyonlar, ilk geçirgen ve sitokeratin-7 (siyah çizgi) için izotip kontrol antikoru (kırmızı çizgi) ya da spesifik monoklonal antikor ile etiketlenmiştir. Hücreler, akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Lipit bazlı transfeksiyon ve mikrogözeneklendirmede arasındaki siRNA transfeksiyon verimliliği Şekil 2. karşılaştırması. Taze izole villöz sitotrofoblastlar lipit bazlı reaktif ya da gözeneklendirilmesinin kullanarak şifreli kontrol siRNA genel Syncytin-2 spesifik siRNA 300 ng ile transfekte edilmiştir. (A), Batı benek analizi, anti-Syncytin-2 ve anti-GAPDH antikorları kullanılarak her bir transfeksiyon durumundan selüler ekstraktlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. (B), Western blot analizlerinden Syncytin-2 protein seviyeleri (Hata çubukları standart sapma olarak tanımlanır *** p <0.001), GAPDH sinyalleri tekabül eden normalleştirme alttaki bant yoğunluğu açısından ölçüldü.5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
EMSA analizi ile tespit Şekil 3. DNA-protein kompleksleri. 24 ya da 48 saat süre ile kültüre primer villöz sitotrofoblastlar alınan çekirdek özütleri, WT prob özel veya özel olmayan fazla (100x) olan veya olmayan Syncytin-2'nin bir promotör bölgeye karşılık gelen kuluçkalanmıştır soğuk oligonükleotitler. DNA-protein kompleksleri, bir yerli jeli üzerinde taşıma sırasında ayrılmıştır. Belirli sinyaller ve ücretsiz sondalar jelin sağ tarafında gösterilir. Nükleer ekstrakt yokluğunda inkübe WT sonda, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. CT NE = sitotrofoblast nükleer özler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Percoll final% | Percoll (% 90) (mi) hacminin | HBSS hacmi (mi) |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
Tablo 1.% 5 -70% polivinilpirolidon kaplı silika gradyan ayarı.
| Tampon | kompozisyon | Yorumlar / Açıklama |
| PBS 1X | 0.9 mM CaCl2, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM MgCl2, 136.9 mM NaCI ve 0.8 mM Na-2 HPO 4 | |
| RIPA tamponunda | 150 mM NaCI,% 1.0 NP-40 ya da% 0.1 Triton X-100,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat), 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 | |
| Laemmli numune tampon | % 4 SDS,% 10 2-mercaptoethanol,% 20 gliserol,% 0.004 bromofenol, 0.125 M Tris-HCI, pH 6.8 | |
| 10x Tampon | 25 mM Tris baz, 190 mM glisin,% 0.1 SDS | |
| 10x transferi tampon | 25 mM Tris baz, 192 mM glisin | |
| TBST tamponu 1x | pH 7'de, 10 mM Tris-HCI, 15 mM NaCI,% 0.05 Tween 20 | İyice karıştırın ve süzün. filtreye başarısızlık membran "tespit" yol açabilir. |
| bloke edici tamponun | % 5, süt ya da BSA (sığır serum albümini), 1x tamponu TBST ilave | |
| TE Tamponu | 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM EDTA | |
| Tavlama tamponu | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| Bağlama Tamponu 5x Jel Shift | % 20 gliserol, 5 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 250 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) ve 0.25 mg / ml poli (dl-dC). | |
| Yükleme tamponu | 250 mM Tris-HCI (pH 7.5), mavi,% 0.2 bromofenol ve% 40 gliserol | |
| TBE 5x | Tris bazı, 54 g ve 20 ml 0,5 M EDTA içeren 1 L deiyonize su içinde borik asit 27.5 g, pH 8 içinde çözündürülür | |
| % 4 yerli jel | TBE 5x tampon | 6.0 mi |
| 29: 1 akrilamid / bisakrilamid (30% W / V) | 10 mi | |
| % 40 akrilamid (w / v) | 0.75 mi | |
| % 100 gliserol | 1.5 mi | |
| Arıtılmış su | 41.5 ml | |
| Amonyum persülfat% 25 | 250 mi | |
| TEMED | 75 mi | |
| % 4 StacSDS-PAGE King jel (6 mi) | GKD 2 O | 4.1 mi |
| % 30 akrilamid | 1.0 mi | |
| 1.0 M Tris | 0.75 mi | |
| % 10 SDS | 60 ul | |
| % 10 APS | 60 ul | |
| TEMED | 6 ul | |
| % 12 SDS-PAGE için ayıran jel (10 mi) | GKD 2 O | 3.3 mi |
| % 30 akrilamid | 4.0 mL | |
| 1.5 M Tris | 2.5 mi | |
| % 10 SDS | 100 ul | |
| % 10 APS | 100ul | |
| TEMED | 4 ul |
Tamponların Tablo 2. Bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
insan plasental fonksiyon ve geliştirme ile ilgili çalışmalar büyük ölçüde çeşitli plasental hücre popülasyonlarının izolasyonu optimize hedefleyen protokoller tarafından geliştirilmiştir. En iyi çalışılmış plasental hücre popülasyonunun biri büyük ölçüde verimli ve güvenilir bir izolasyon izin optimize protokolleri yararlandı çalışma olan villöz sitotrofoblastlar kalır. Bu ayrıca, transfeksiyon ve promotör çalışmaları gibi deneyler, bir dizi izin vermektedir. Daha önce tarif edilen protokol 3 kullanılarak, primer villöz sitotrofoblastlar saf popülasyonu elde edilebilir. CK-7 sitotrofoblastlar ifade edilen bir ara filaman proteinidir. Bu proteine karşı monoklonal antikorlar, plasenta, 10 kendi izole edildikten sonra, bu trofoblast nüfusun saflığını belirlemek için kullanılır. Hazırlık hücrelerin% 96 CK-7 pozitif olduğunda saf olduğu tanımlanmıştır. Hücreler daha sonra transfeksiyon için direkt olarak kullanılabilir. transfeksiyon protokollerilipid bazlı yaklaşımlar dahil genel olarak birincil hücreler 11,12 nükleik asitlerin transferi için kullanılır. Bununla birlikte, bazı hücrelerde lipid formülasyonun toksisite bir dezavantaj olmaktadır. Mikrogözeneklendirme az ısı, metal iyonu çözülmesini, pH değişimi ve oksit oluşumunu üreten bir elektroporasyon alanı gibi bir pipet kullanarak bir elektroporasyon teknolojisi; bunların tüm hücreler için zararlı olabilir. Burada sunulan verilere göre, mikro-gözeneklendirmeden Western blot analizi ile belirlendiği üzere, lipit bazlı transfeksiyon protokolü daha siRNA taşınması için daha etkin bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bir EMSA yaklaşımı, test edilmiştir Faaliyetinin 7 önemli faktörler bağladığı bilinen Syncytin-2 promotör seçilen bir bölgesine karşı tasarlanmış bir sonda kullanılarak. Prob izole sitotrofoblastlar nükleer ekstre ile inkübe edildi. Şekil 3'te görüldüğü gibi, belirli bir sinyal elde edilmiştir.
farklı protokoller burada H tarifSon yıllarda optimize edilmiştir ave. Bununla birlikte, tüm kritik adımların belirli sayıda bağımlı kaliteli sitotrofoblast preparasyonlar, dayanır. İlk ve en önemlisi, doğum sonrası, plasenta bir tampon çözelti içinde tutulması gerekir ve hücreler, en fazla 5 saat çözeltisine batırılmış sonra onlardan izole edilmelidir. Tripsin ve DNaz tedavileri de büyük önem taşıyor ve dikkatle sitotrofoblast hazırlık kalitesini en üst düzeye çıkarmak için yapılmalıdır. kendi izolasyonu için gerekli olan zamanın plasenta villus ve azaltma geniş fırçalama güçlü hücre sayısı izolasyonu etkinliğini yükseltebilirsiniz hem ek geliştirmeler vardır. Bu protokolün verimi daha da yakından izlenmelidir yoğunluk gradyan adımı sırasında optimum santrifüj bağlıdır. düzgün tüpleri dengelemek için başarısızlık da degrade bozulmasına yol ve ciddi hücre sayısını azaltmak olacaktır.
transfeksiyon protokolü tarifD, burada birkaç yıl içinde test edilmiştir. mikrogözeneklendirmede için gerekli koşulları genellikle basit olmasına rağmen, çeşitli birincil hücreler için transfeksiyon optimizasyonu yine gereklidir. Bu, transfekte edilmiş bir nükleik asit (siRNA veya plazmid DNA) miktarı optimizasyonu kapsamaktadır. Protokol Burada açıklanan dolayısıyla, çeşitli siRNA konsantrasyonlarının optimum ve verimli bir bastırma siRNA tespit etmek önerilir. hücre mikrogözeneklendirmesinin ve tam süspansiyon önce hücre peletine uygun bir süspansiyon hacminin eklenmesi transfeksiyon verimini etkileyen ek faktörler bulunmaktadır.
EMSA deneyleri ayrıca optimizasyon gerektirmiştir. plasenta donör ve değişen sitotrofoblast izolasyon verimliliği ve saflık ile ilişkili heterojenitesini göz önüne alındığında, EMSA deneyleri sonuçları doğrulamak için 5 kata kadar tekrar edilmesi gerekir. Buna ek olarak, yüksek hücre sayılarına sahip yeterli prote sağlamak için önemlidirNükleer ekstrakt preparatlar ve protein / DNA kompleksleri daha sonra algılama düzeyleri. Ayrıca, yüksek oranda radyoaktif oligonükleotid probları hazırlanmalı ve yeni satın alınan radyoaktif ATP taze hazırlanmalıdır.
sınırlamaları bir dizi sundu protokolde altını gerekir. İlk analizler, hücre hazırlıklarında sinsityotrofoblast parçalarının potansiyel varlığını değerlendirmek olamaz akım sitometri vurguladı gerekir. Diğer protokoller gibi akım sitometri veya antikor bağlı manyetik boncuk 13,14 kullanımı kullanarak sıralama olarak, bu sorunu çözmek için öne sürülmüştür. Bu fragmanlar, normal olarak hücre kültür çukurlarına uygun olmayan ve sık sık, hücre yıkama aşamasını takiben kaldırılır da söz edilmelidir. sunulan protokol Başka bir sınırlama birincil villus sitotrofoblastlar hücre kültüründe çok sınırlı yaşam süresi olması. VlIVdeki Bu nedenle, bağımsız olarak seçilen yöntem, kararlı transfeksiyonlous sitotrofoblastlar ulaşılamaz kalacaktır. EMSA bu protokolde açıklandığı gibi, aynı zamanda bazı sınırlamaları vardır, analiz eder. sinyallerin özgüllüğü kolayca fazla etiketsiz oligonükleotidler ile rekabet deneyleri ile değerlendirilebilir de, bağlı faktörleri sadece ile süper sinyalleri elde özel transkripsiyon faktörleri karşı antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. In vitro DNA-protein etkileşimleri inceleyen olarak EMSA deneyleri ayrıca sınırlı kalmaktadır. In vivo protokolleri gibi ChIP deneyinde olduğu gibi daha iyi temsil ayarları ile deneyler ve daha yeni daha EMSA sonucu doğrulamak için gereklidir.
sitotrofoblast izolasyon ve transfeksiyon için burada açıklanan protokoller geçici susturma veya belirli genlerin aşırı ekspresyonu fonksiyonu, çoğalması veya belirli bir trofoblast hücre tipinde ayrımında rollerini anlamak için gerekli olan çalışmalar için önemli uygulamalar var. Buna ek olarak, üzerine transfeksiyon, Tifade edilen proteinlerin agged versiyonları hücre takibi için uygun ve konfokal mikroskopi gibi standart teknikler ile analiz eder ve akış sitometrisi olacaktır. EMSA protokolü promotör düzenlenmesi ve karıştığı transkripsiyon faktörlerine ilişkin karmaşık ayrıntılarını incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu deneysel yaklaşım araştırmacılar plasenta eksikliği ve villöz sitotrofoblastlar ifade genin düzenlenmesi ile ilgili bazı hastalıkların gelişiminde rol oynayan faktörleri belirlemek için izin verecektir.
Sonuç olarak, insan primer sitotrofoblastlar plasenta kolaylıkla izole olması ve bu tür siRNA transfeksiyon ve EMSA gibi standart protokoller, mükellef bulunmaktadır edebilirsiniz. Bu lipofeksiyon 15 ve nucleofection 16 gibi farklı transfeksiyon yöntemleri, mevcut olmakla birlikte, mikro-gözeneklendirmeden sınırlı hücre de bir yaklaşım sağlar, izole villöz sitotrofoblastlar siRNA transfeksiyonu için çok etkili bir yöntem görülmektedirath ve nispeten düşük maliyetli. villöz sitotrofoblastlar bağlamında, bu yaklaşım, farklı genlerin susturulması ve çeşitli fonksiyonları veya hücre tipinin özelliklerini kendi ima değerlendirmesini izin vermelidir. Buna ek olarak, ekspresyon vektörleri transfeksiyon bu protokol kullanılarak mümkündür ve siRNA dayalı bir yaklaşım tamamlayıcı verileri elde edecektir. EMSA ile ilgili olarak, bu yöntem, DNase I ayak izi, metilasyon müdahalesi deney, kromatin immünopresipitasyon ve kromatin uygunluğu analizleri gibi alternatif yaklaşımlar, göre, protein-DNA kompleksleri değerlendirilmesi daha hızlı ve daha basit bir yöntem temin etmektedir. Standart promotör analiz ya da başka bir güçlendirici / baskılayıcı ihtiva eden DNA bölgeleri test dolayısıyla bu teknik önemli olmaya devam etmektedir. fonksiyonel düzeyde potansiyel etkileri ile genlerin düzenlenmesi, bilgi ekler olarak villöz sitotrofoblastlar için güvenilir kullanım Bizim gösteri, önemlidir. rağmen onlarınkültürde sınırlı bir süre, primer villöz sitotrofoblastlar standart çalışmalar için uygun olan ve daha yeni olarak bilgi yöntemlere uyarlanabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (# 298527) (BB) bir hibe ile desteklenmiştir. BT kurumsal FARE burs tarafından desteklenmiştir. AV NSERC Graham Bell Ph.D. tarafından desteklenen burs. BB İnsan Retrovirology bir Kanada Araştırma Başkanı (Tier 2) düzenledi. metnini revize yardım için Beatrix Beisner teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
