Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til effektiv transfektion af siRNA i frisk isolerede humane villøse cytotrophoblaster hjælp mikroperforering og identificere DNA-protein-komplekser i disse celler. Transficerede celler kan monitoreres ved Western blot og EMSA-analyser under 4-dages dyrkningstid.
Protocol
Den UQAM etiske udvalg har godkendt disse protokoller, som er i overensstemmelse med retningslinjerne i den etiske komité i St-Luc Hospital af Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada). Deltagerne underskrev et informeret samtykke formular.
1. Medium Udarbejdelse og Isolering af Primary villøs cytotrophoblaster
- Forbered dyrkningsmedium til humane primære villøse cytotrophoblaster ved supplering Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 25 mM HEPES, 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Filter den forberedte medium gennem sterilt 0,22 um filter og opbevares i en -20 ° C fryser i portioner af 50 ml.
- Isoler primære villøse cytotrofoblaster fra friske placenta følgende standard protokoller 3.
- Ved hjælp af en tang, fjerne føtale membran fra vævet ved forsigtigt skrabe det ud, og samtidig være omhyggelig med ikke at fjerne villøs væv. Skærresterende placental villi i terninger på ca. 3 x 3 cm ved hjælp skalpel og en saks. Vask grundigt med vand indeholdende 0,9% NaCl for at fjerne moderens blod.
- Hold hver terning med en tang, forsigtigt fjerne den villøs væv fra de resterende skibe og fibrøst væv med en saks.
- I 15 til 30 mg villøs væv, fordøje fire gange i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) indeholdende trypsin (fra 9,6 x 10 5 til 1,8 x 10 6 U; slutkoncentration 1,2 mg / ml) og deoxyribonuclease I (DNase I) ( slutkoncentration 200 ug / ml) i 30 min ved 37 ° C i et vandbad under kontinuerlig omrystning.
Bemærk: Brug 150 ml samlet volumen for første fordøjelse, 100 ml for den anden fordøjelse og 75 ml for de to resterende spaltninger.
- Opsaml supernatanten indeholdende dispergerede celler og centrifuger ved 1.250 xg i 15 minutter uden bremse. Supernatanten fjernes, og de resuspender cellerne i 1 ml forvarmet DMEM indeholdende1% penicillin / streptomycin.
- Lag de dispergerede celler oven på en diskontinuerlig 5% - 70% polyvinylpyrrolidon-coatet silica gradient (se tabel 1 for gradient forberedelse) og centrifugeres i 23 minutter ved 507 xg uden bremse. Fjern tætheden lag mellem 1,017-1,033 ved aspiration og indsamle lag mellem 40% og 50% i gradienten med en ny pipette. Vask cellerne ekstensivt med 10 ml forvarmet DMEM indeholdende 1% penicillin / streptomycin.
Bemærk: Den opsamlede fraktion svarer til tætheder mellem 1,048 og 1,062, hvilke havne trofoblaster. - Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Kort beskrevet blandes celler og tilsæt 10 pi i en ny mikrocentrifugerør. Tilsæt 10 pi trypanblåt og blandes forsigtigt igen. Udarbejde cellesuspensionen og fylde hæmocytometeret kamre. Tæl cellerne under 10X mål.
- Placer 1 x 10 6 og 4,5 x 10 6 celler i separate rør til brug i §§ 1.3 og 2, respektively. Seed de resterende celler i en densitet på 1,5 x 10 6 celler / brønd i DMEM-medium og dyrkning ved 37 ° C og 5% CO2 i maksimalt 4 dage for andre eksperimenter.
- Ved hjælp af en tang, fjerne føtale membran fra vævet ved forsigtigt skrabe det ud, og samtidig være omhyggelig med ikke at fjerne villøs væv. Skærresterende placental villi i terninger på ca. 3 x 3 cm ved hjælp skalpel og en saks. Vask grundigt med vand indeholdende 0,9% NaCl for at fjerne moderens blod.
- Evaluering af renheden af isolerede primære villøse cytotrophoblaster
- Spin 1 x 10 6 af de frisk isolerede cytotrophoblaster i mikrocentrifugerør ved 300 x g. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml forvarmet phosphatpufret saltvand (PBS). Centrifugér celler ved 300 xg og fjern PBS ved aspiration.
- Der tilsættes 1 ml kold methanol til cellerne og inkuberes ved -20 ° C i 20 minutter. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter og fjernelse af methanol ved aspiration.
Forsigtig: Brug dåse maske, beskyttelsesbriller og gummihandsker mens håndtering methanol. - Der tilsættes 1 ml PBS ved stuetemperatur at rehydrere celler, centrifugeres ved 300 xg og fjern PBS ved aspiration.
- Cellerne inkuberes i PBS indeholdende FBS (1:50 [v / v] fortynding) og en FcRblokerende reagens (1:10) i 45 minutter ved stuetemperatur for at fjerne ikke-specifik binding.
- Vask to gange med 500 pi stuetemperatur PBS, centrifugeres celler ved 300 xg i 5 minutter og fjern PBS ved aspiration. Resuspender celler i 100 pi stuetemperatur PBS.
- Cellerne inkuberes med et monoklonalt muse fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-human cytokeratin-7-antistof klon LP5K (1: 200) eller en kontrol isotype-matchet ikke- specifikt antistof i PBS indeholdende 0,2% BSA i 45 minutter ved stuetemperatur i mørket. Vask cellerne i PBS.
- Analyser cellerne ved flowcytometri 3. Brug cellepræparater, som viser mindst 96% CK-7-positive celler ved flowcytometri til yderligere forsøg.
2. siRNA Transfektion af humane primære villøs cytotrophoblaster
- Transfektion af humane primære villøse cytotrophoblaster ved anvendelse af en mikroperforeringsanordning
- Forbered 6-brønds plader indeholdende2 ml suppleret DMEM-medium til inkubation af microporated celler.
- Efter isolering af primære cytotrophoblaster (se afsnit 1.2), tage en prøve af celler i suspension og bestemme celle nummer ved hjælp af en hæmocytometer.
- Overfør 1,5 x 10 6 celler til et mikrocentrifugerør og pellet cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med 1 ml Dulbeccos PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + -fri) og pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes forsigtigt i 100 pi resuspensionsbuffer.
Bemærk: Undgå holde cellesuspension i mere end 15-30 minutter ved stuetemperatur, for at maksimere cellernes levedygtighed og transfektionseffektivitet. - Tilføj 300 ng Syncytin-2 siRNA (eller kontrol-scrambled siRNA) til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opsug celle-siRNA blanding ved hjælp af en 100 pi transfektion pipette. Indsætpipetten ind på stationen (se liste over materialer) og underkaste cellerne til en 1300 V enkelt puls på 30 msek.
- overdrage cellerne til plader med 6 brønde (fremstillet i trin 2.1.1) indeholdende 37 ° C forvarmet suppleret medium for at undgå beskadigelse celle.
- Gentag trin 2.1.5 og 2.1.6 for de resterende prøver.
- Vip forsigtigt pladen i 30 sekunder for at sikre jævn fordeling af cellerne. Inkubér pladen ved 37 ° C i en fugtig CO2-inkubator i 24 til 48 timer. Genopfriske dyrkningsmedium 24 timer efter transfektion.
- Vurdere transfektion effektivitet ved Western blot analyse (se trin 3 til 6).
- Lipofektion af siRNA i humane primære cytotrophoblaster
- Efter isolering af villøse cytotrophoblaster, frø cellerne ved en tæthed på 1,5 x 10 6 celler pr brønd i 6-brønds plader i 2 ml dyrkningsmedium og inkuberes i 18 timer.
- Fortynd 300 ng Syncytin-2-specifikke siRNA (eller kontrol-krypteretsiRNA) og 5 pi lipidbaseret transfektionsreagens i separate 1,5 ml rør i et samlet volumen på 10 pi antibiotic- og serum-frit medium. Der inkuberes i 5 min.
- Bland den fortyndede reagenser og inkuberes i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur til dannelse af transfektion kompleks. Tilføj 90 pi antibiotic- og serum-frit medium til blandingen til et slutvolumen på 100 pi.
- Fjern kulturmediet fra 6-brønds plader (trin 2.2.1). Tilsæt 2 ml frisk medium og 100 ul transfektion mix til hver brønd. Inkuber cellerne ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 24 til 48 timer. Genopfriske dyrkningsmedium 24 timer efter transfektion.
- Vurdere transfektion effektivitet ved Western blot analyse (se trin 3 til 6).
3. Fremstilling af lysater fra Whole Cell Culture
- Fjern medierne og skyl hver brønd (fra trin 2.1.8 og 2.2.4) ved hjælp af pre-varmet DPBS (Mg2 +, Ca2 + gratis). Aspirer DPBS og tilsættes 500 pi 0,25% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Inkuber i 1-3 minutter ved 37 ° C i en CO2-inkubator. Stop trypsinbehandling ved tilsætning 500 pi serum indeholdende vækstmedium.
Bemærk: Brug egnede medier volumen efter typen af kolben / skål: 1 ml pr 10 7 celler / 100 mm skål / 150 cm2 kolbe; 0,5 ml pr 5 x 10 6 celler / 60 mm skål / 75 cm2 kolbe. - Overfør celler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, pellet celler ved centrifugering ved 300 xg i 2 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med DPBS (Mg2 +, Ca2 + -fri) og pellet cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet. Glasset anbringes på is. Pellet resuspenderes i 50-200 pi iskold Radio-immunpræcipitationsassay (RIPA) buffer (se tabel 2 for buffer sammensætning) indeholdende frisk tilføjeed protease og phosphataseinhibitorer på en 1x slutkoncentration. Kort beskrevet vortexes røret og efterlade på is i 30 minutter.
- Centrifugering ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Placer forsigtigt røret på is. Ved hjælp af en pipette, overføres supernatanten til et frisk forkølet mikrocentrifugerør holdes på is. Kassér pelleten.
4. Fremstilling af kerneekstrakter fra dyrkede celler
- For hver brønd (trin 1.2.5), vask dyrkede cytotrophoblaster to gange med 1 ml forvarmet DPBS (Mg2 +, Ca2 + fri). Aspirer DPBS og tilsættes 500 pi 0,25% trypsin / EDTA. Inkuber i 1-3 minutter ved 37 ° C i en CO2-inkubator og stoppe trypsinbehandling ved tilsætning 500 pi serum indeholdende vækstmedium.
- Overfør celler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, pellet celler ved centrifugering ved 300 xg i 2 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med DPBS (Mg2 +, Ca2 + -fri) og pellet cellerne ved centrifugeringved 300 x g i 2 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt alle supernatant uden at forstyrre pellet og placer røret på is.
- Udvinde nukleart protein ifølge producentens anvisninger. Bestem proteinkoncentrationen af hver prøve anvendelse af protein kvantificering assay (Bradford eller bicinchoninsyre-assay (BCA)).
5. Prøveforberedelse og elektroforese
- Bestem proteinkoncentrationen for hver celleekstrakt anvendelse af et protein kvantificering assay (f.eks Bradford 8 eller BCA 9).
- Ifølge producentens instruktioner (hvis antistoffer kunne anvendes i reduktions- og denatureringsbetingelser), tilsættes et lige stort volumen af 2X Laemmli prøvebuffer (tabel 2) til 20-30 ug totalt protein.
- Kog cellelysater ved 100 ° C i 5 minutter. Aliquot 50-100 pi lysat for at undgå gentagne fryse / tø-cykler og gemme de resterende rør ved -20 ° C til senere brug. Mens prøverne opvarmning, forberede 1 liter 1x løbebuffer (tabel 2).
- Spin prøverne ved 16.000 xg i et par sekunder, og placere dem på is.
- Indlæse samme mængde protein i hver brønd i en 12% SDS-PAGE-gel (se tabel 2 for gelsammensætning), sammen med en molekylvægtmarkør. Kør gelen i 1 til 2 timer ved 100 V.
6. Overførsel af Protein fra Gel til Membrane
- Aktiver polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med methanol i 1 minut og skyl med 1x transfer buffer / 10% methanol-opløsning. Ifølge producentens anvisninger, overføre i 30 min til 1 time, afhængigt af proteinet størrelse.
Bemærk: Transfer effektivitet kan vurderes ved anvendelse Ponceau Red-farvning før blokerende trin.
7. antistoffarvning
- Blokere membranen i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C ved anvendelse af 5% blokeringsopløsning.
- Inkuber membranen med anti-Syncytin-2-antistoffer (4 ug / ml; 1: 5.000) 6 eller med anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) i 5% blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C (anti-Syncytin-2) eller i 45 minutter ved stuetemperatur. Vask membranen tre gange i Tris-pufret saltopløsning Tween (TBST, se tabel 2 for buffer præparat) i 5 minutter.
- Inkuber membranen med passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-kanin eller anti-muse-antistof (1: 10.000) i 5% blokeringsbuffer i TBST ved stuetemperatur i 1 time. Vask membranen tre gange i TBST i 5 minutter og derefter skylles i TBS. Detektere signaler under anvendelse af kemiluminescens-baserede blotting substrat.
8. Radioaktiv mærkning af Single oligonukleotid
- phosphoryleringsreaktion
- I et mikrocentrifugerør, tilsæt 50 ng af en forreste oligonukleotid sammen med 1x T4 polynukleotidkinase puffer, 1 UT4-polynukleotidkinase og 20 uCi (γ- 32 P) ATP og fyldes op reaktionsvolumenet til 20 pi med nuclease-frit vand.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Reaktionen standses ved tilsætning af 5 pi 0,5 M EDTA. Der fyldes op til 50 pi med nuklease-frit vand.
- Fjernelse af personlige nukleotider fra oligonukleotider
- Forbered en G-25 søjle ækvilibreret med TE-buffer (tabel 2) efter producentens instruktioner. Kolonnen anbringes i en frisk DNase-fri 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Langsomt tilsættes 50 ul sonde (fra trin 8.1.2) i løbet af harpiksen, og pas på ikke at forstyrre harpiks seng. Spin i 2 minutter ved 350 xg for at opsamle oprenset prøve i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vask G-25-søjle med 36 pi nuclease-frit vand og centrifugering i 2 minutter ved 350 xg at indsamle det i mikrocentrifugerør.
- Hybridisering med den komplementære streng oligonucleotide
- Overfør radioaktivt mærkede probe (86 pi) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 200 ng af den omvendte oligonukleotid og 1x annealing-buffer (tabel 2). Heat 5 minutter ved 95 ° C og efterlade natten over ved stuetemperatur til afkøling.
- Forbered ikke-radioaktive dobbeltstrengede oligonukleotider ved tilsætning af 50 ng af umærket forward og reverse oligonukleotider og 1x annealing-buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der fyldes op til 100 pi med nuklease-frit vand. Varme og holde ved stuetemperatur som beskrevet i trin 8.3.1.
9. Udarbejdelse af en ikke-denaturering Polyacrylamid Gel for EMSA
- Der fremstilles en 4% nativ gel (10 x 12 cm) med en 1,5 mm space-kam (se tabel 2 for gelsammensætning). Rengør alle glasplader bruger destilleret vand.
Bemærk: Det er kritisk, at pladerne være helt fri for ionisk detergent, som SDS. - Umiddelbart pvores den acrylamid-opløsning i mellem pladerne og tillade polymerisering at fortsætte (ca. 30 min).
- Saml elektroforese apparat og fyld tanken med 0,5x TBE. Pre-run gelen i 30 minutter til 1 time ved 150 V før prøvepåsætning.
10. DNA-bindingsreaktion
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der tilsættes 10 ug kerneekstrakt (trin 4.3) i 1x Gel Shift bindingspuffer (tabel 2) og fyldes op til slutvolumenet til 10 pi med nuclease-frit vand. Som en kontrol, forberede et rør uden kerneekstrakt. Til konkurrencen reaktionen, tilsættes 1 ml af koldt ikke-specifik eller specifik dobbeltstrenget oligonukleotid (trin 8.3.2).
- Tilsæt 1 pi radioaktiv probe fra trin 8.3.1 til hver reaktion. Inkubér reaktionen ved stuetemperatur i 20 minutter. Tilsæt 1 pi 10x gelloadningspuffer pr reaktion og indlæse hver prøve på gelen udarbejdet i § 9.
- Kør gelen i 1 1/2 til 2 timer ved 150 V. Efter migration, wrap gelen og glasset i en plastfolie og position i en eksponering kassette under en fosfor-skærm. Efterlad kassetten ved 4 ° C i 24 timer.
- Fjern skærmen fra kassetten eksponering og indsæt i fosfor imaging enhed til scanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friske placenta fra graviditeter blev anvendt til at isolere humane primære villøse cytotrophoblaster at udføre sæt eksperimenter præsenteret i afsnittet protokol. Efter deres isolering, vi først analyseret renheden af cytotrophoblaster ved anvendelse af cytokeratin-7 markør (figur 1). Cellepræparater blev således farvet under anvendelse af et monoklonalt anti-cytokeratin-7-antistof. Figur 1 viser resultater fra et typisk forsøg efter oprensning af primære villøse cytotrophoblaster, analyseret ved standard flowcytometri. Efter densitetsgradient trin bliver> 97% celler (i dette tilfælde, 99%) positivt farvet for cytokeratin-7 i standard eksperimenter, hvilket viser en meget høj grad af effektivitet i oprensningen af denne celletype.
Efter deres isolation, kan humane primære cytotrophoblaster anvendes direkte til transfection. To forskellige protokoller blev evalueret, dvs. mikroporering og lipid-baserede transfektion. Begge protokoller blev testet med siRNA specifik for Syncytin-2-mRNA og sammenlignet med en kodet siRNA (negativ kontrol). Transfektionseffektiviteten blev dernæst evalueret ved Western blot analyse. Resultaterne bekræftede, at Syncytin-2-ekspression blev signifikant stumme i cytotrophoblast-afledte ekstrakter ved mikroporering (figur 2). På den anden side blev der ikke signifikant lyddæmpning bemærket, når siRNA'er blev transficeret ved den lipidbaserede transfektionsreagens.
Vi har udført også EMSA eksperimenter på frisk isolerede cytotrophoblaster. Et radioaktivt mærkede probe, der stammede fra en Syncytin-2-promotorområdet blev syntetiseret. Det syntetiserede probe (betegnet WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') er tidligere blevet vist at binde CREB transskription 7 faktorer. I nærvær af nukleare Udvinding handlinger fra 24 og 48 timers dyrkede villøse cytotrophoblaster viste Syncytin-2-promotor-afledt probe tilstedeværelsen af to DNA-protein-komplekser. Tilsætning af 100x kold WT oligonukleotid konkurrerede om dannelsen af komplekset, mens ingen lignende konkurrence med overskud af en kold ubeslægtet oligonukleotid (muse Neural Crest Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') blev observeret, hvilket bekræfter specificiteten af begge signaler ( figur 3).
Figur 1. Evaluering af renheden af primære villøse cytotrophoblaster gennem flowcytometri. Frisk isolerede præparater af villøse cytotrophoblaster blev først permeabiliseret og derefter mærket med isotypekontrolantistof (rød linje) eller monoklonalt antistof specifikt for cytokeratin-7 (sort linie). Celler blev analyseret ved flowcytometri. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sammenligning af siRNA transfektionseffektiviteten mellem lipid-baserede transfektion og mikroperforering. Frisk isolerede villøse cytotrophoblaster blev transficeret med 300 ng Syncytin-2-specifikke siRNA vs. en kodet kontrol siRNA hjælp af lipidbaserede reagens eller mikroperforering. (A) Western blot analyser blev udført på cellulære ekstrakter fra hver transfektion tilstand ved hjælp anti-Syncytin-2 og anti-GAPDH antistoffer. (B) Syncytin-2 protein niveauer fra Western blot analyser blev kvantificeret i form af band intensitet efter normalisering med tilsvarende GAPDH signaler (Fejllinjer defineres som SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. DNA-proteinkomplekser identificeret ved EMSA analyse. Nukleare ekstrakter fra primære villøse cytotrophoblaster dyrket i 24 eller 48 timer blev inkuberet med en WT probe svarende til en promotor region Syncytin-2 med eller uden overskud (100x) af specifik eller ikke-specifik kolde oligonukleotider. DNA-proteinkomplekser blev separeret ved migration på en nativ gel. Specifikke signaler og frie prober er angivet på højre side af gelen. WT probe inkuberet i fravær af kerneekstrakt blev også anvendt som en negativ kontrol. CT NE = cytotrophoblast kerneekstrakter. Klik her for at se en større version af dette tal.
| % Af Percoll endelig | Volumen af Percoll (90%) (ml) | Volumen HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0,67 |
| 65 | 2.17 | 0,83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1,83 | 1.17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1,50 | 1,50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1.17 | 1,83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0,83 | 2.17 |
| 20 | 0,67 | 2.33 |
| 15 | 0,50 | 2.50 |
| 10 | 0,33 | 2,67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Tabel 1. 5% polyvinylpyrrolidon-coatet silica gradient indstilling -70%.
| Buffer | Sammensætning | Kommentarer / Beskrivelse |
| PBS 1x | 0,9 mM CaCl2, 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM MgCl2, 136,9 mM NaCl og 0,8 mM Na 2 HPO 4 | |
| RIPA puffer | 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 eller 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), 50 mM Tris-HCI pH 8,0 | |
| Laemmli prøvebuffer | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromphenolblåt, 0,125 M Tris-HCI, pH 6,8 | |
| 10x løbebuffer | 25 mM Tris-base, 190 mM glycin, 0,1% SDS | |
| 10x overføringsbuffer | 25 mM Tris-base, 192 mM glycin | |
| TBST 1x buffer | 10 mM Tris-HCI, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 ved pH 7 | Bland godt og filtrere. Manglende filter kan føre til "spotting" af membranen. |
| blokerende buffer | 5% mælk eller BSA (bovint serumalbumin) tilsat til TBST 1x puffer | |
| TE Buffer | 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA | |
| annealingbuffer | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 100 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| 5x Gel Shift Binding Buffer | 20% glycerol, 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5) og 0,25 mg / ml poly (dI-dC). | |
| påsætningsbuffer | 250 mM Tris-HCI (pH 7,5), 0,2% bromphenolblåt og 40% glycerol | |
| TBE 5x | Opløs 54 g Tris-base og 27,5 g borsyre i 1 L deioniseret vand, som omfatter 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8 | |
| 4% nativ gel | TBE 5x buffer | 6,0 ml |
| 29: 1 acrylamid / bisacrylamid (30% vægt / volumen) | 10 ml | |
| 40% acrylamid (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% glycerol | 1,5 ml | |
| Destilleret vand | 41,5 ml | |
| Ammoniumpersulfat 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacking Gel (6 ml) til SDS-PAGE | Hedeselskabet 2 O | 4,1 ml |
| 30% acrylamid | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 pi | |
| 10% APS | 60 pi | |
| TEMED | 6 pi | |
| 12% adskillende gel (10 ml) til SDS-PAGE | Hedeselskabet 2 O | 3,3 ml |
| 30% acrylamid | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 pi | |
| 10% APS | 100pi | |
| TEMED | 4 pi |
Tabel 2. Sammensætning af buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af menneskelig placenta funktion og udvikling er blevet stærkt forbedret af protokoller til formål at optimere isolering af forskellige placenta cellepopulationer. En af de bedst undersøgte placenta cellepopulation forbliver de villøse cytotrophoblaster, studiet af hvilken i høj grad har nydt godt af optimerede protokoller tillader effektiv og pålidelig isolation. Dette har yderligere tilladt en række forsøg, såsom transfektion og promotor- undersøgelser. Ved hjælp af en tidligere beskrevet protokol 3, kan der opnås rene populationer af primære villøse cytotrophoblaster. CK-7 er et mellemprodukt filament protein, som er udtrykt cytotrophoblaster. Monoklonale antistoffer mod dette protein anvendes til at bestemme renheden af denne trofoblast befolkning efter deres isolering fra placenta 10. Præparater er defineret til at være rent, når 96% af cellerne er positive for CK-7. Celler kan efterfølgende anvendes direkte til transfektion. transfektionsprotokollerinvolverer lipid-baserede tilgange er stort set bruges til at overføre nukleinsyrer i primære celler 11,12. Imidlertid toksicitet af lipid-formulering i nogle celler bliver en ulempe. Mikroporering er en elektroporation teknologi ved hjælp af en pipette spids som en elektroporation rum, der genererer minimal varme, metalion opløsning, pH variation og oxid formation; som alle kan være skadelige for cellerne. På baggrund af de fremlagte data heri, mikroporering repræsenterer en mere effektiv tilgang til siRNA levering end lipid-baserede transfektion protokol, som bedømt ved Western blot-analyser. Ved anvendelse af en EMSA tilgang, en probe designet over for et udvalgt område af Syncytin-2-promotoren, der vides at binde vigtige faktorer for dets aktivitet 7 blev afprøvet. Sonden blev inkuberet med nukleare ekstrakt fra isolerede cytotrophoblaster. Som beskrevet i figur 3, blev der opnået specifikke signaler.
De forskellige protokoller beskrevet heri have blevet optimeret i de senere år. Men de alle afhængige af høj kvalitet cytotrophoblast præparater, som afhænger af et vist antal kritiske trin. Først og fremmest efter fødslen, behøver placentaer opbevares i en pufferopløsning, og celler skal isoleres fra dem ikke mere end 5 timer efter at være fordybet i opløsningen. Trypsin og DNase behandlinger er også af stor betydning og bør nøje forpligtet sig til at maksimere kvaliteten af cytotrophoblast forberedelse. Omfattende skrubbe af moderkagen villi og reduktion af den nødvendige tid til deres isolation er både yderligere forbedringer, som i høj grad kan opgradere effektiviteten af celletallet isolation. Udbyttet af denne protokol afhænger videre på optimal centrifugering under densitetsgradient skridt, som bør overvåges nøje. Manglende korrekt balance rørene vil også føre til forvridning af gradienten og alvorligt reducere celle numre.
Den transfektionsprotokol beskrived heri er blevet testet for over flere år. Selvom betingelser er nødvendige for mikroporering er generelt ligetil, er optimering af transfektion for de forskellige primære celler alligevel påkrævet. Dette indebærer også optimering af mængden af transficeret nukleinsyre (siRNA eller plasmid-DNA). Således for protokollen beskrevet her, anbefales optimering af forskellige siRNA'er koncentrationer til at identificere en effektivt undertrykke siRNA. Tilsætning af en passende suspension volumen til cellepelleten før mikroporering og fuldstændig suspension af cellerne er yderligere faktorer, som påvirker transfektionseffektiviteten.
EMSA forsøg har også nødvendiggjort optimering. I betragtning af heterogenitet forbundet med placenta donorer og de varierende cytotrophoblast isolation effektivitet og renheder, skal gentages op til 5 gange EMSA eksperimenter for at bekræfte resultaterne. Endvidere har høje celletal er vigtigt at sikre tilstrækkelig protei niveauer i præparater nukleare ekstrakt og efterfølgende påvisning af protein / DNA-komplekser. Desuden bør højradioaktive oligonucleotidprober være forberedt, og bør være forberedt frisk fra nylig købt radioaktiv ATP.
En række begrænsninger skal understreges i den præsenterede protokol. Det skal først understreges, at flowcytometri analyser ikke kan vurdere den potentielle tilstedeværelse af syncytiotrophoblast fragmenter i cellepræparater. Andre protokoller er blevet foreslået at løse dette problem, såsom sortering ved anvendelse af flowcytometri eller anvendelse af antistof-bundne magnetiske perler 13,14. Det skal nævnes dog, at disse fragmenter ikke normalt overholde cellekultur brønde og er ofte fjernes efter cellen vasketrinet. En anden begrænsning til det præsenterede protokol er, at de primære villøse cytotrophoblaster har en meget begrænset overlevelsestid i cellekultur. Derfor, uanset den valgte metode, stabil transfektion af willlous cytotrophoblaster forbliver uopnåelige. EMSA analyser, som beskrevet i denne protokol, har også visse begrænsninger. Selvom specificiteten af signalerne let kan bedømmes ved kompetitive forsøg med overskud af umærkede oligonukleotider, kan bundne faktorer kun identificeres under anvendelse af antistoffer mod specifikke transkriptionsfaktorer resulterer i supershift signaler. EMSA eksperimenter desuden være begrænset, da det studerer in vitro DNA-protein interaktioner. Forsøg med flere repræsentative indstillinger, såsom chip assay og nyere in vivo-protokoller er nødvendige for yderligere at bekræfte EMSA resultat.
De heri beskrevne for cytotrophoblast isolation og transfektion protokoller har vigtige applikationer til undersøgelser, hvor forbigående dæmpning eller overekspression af specifikke gener er nødvendige for at forstå deres rolle i funktion, proliferation eller differentiering af en specifik trofoblast celletype. Desuden ved transfektion, tagged versioner af udtrykte proteiner vil være egnede til intracellulær sporing og analyser ved standardteknikker, såsom konfokal mikroskopi og flowcytometri. EMSA protokol kan bruges til at studere indviklede detaljer vedrørende promotor regulering og de implicerede transkriptionsfaktorer. Desuden vil denne eksperimentelle tilgang tillader forskerne at identificere faktorer, der er involveret i udviklingen af visse sygdomme relateret til placentation mangel og den ændrede regulering af gener udtrykt i villøse cytotrophoblaster.
Som konklusion kan humane primære cytotrophoblaster let isoleres fra placenta og kan underkastes standard protokoller, såsom siRNA transfektion og EMSA. Selvom forskellige transfektion procedurer, såsom lipofektion 15 og nucleofection 16 er til rådighed, mikroporering forekommer en meget effektiv metode til siRNA transfektion af isolerede villøse cytotrophoblaster, der tilbyder en tilgang med begrænset celle death og relativt lave omkostninger. I forbindelse med villøse cytotrophoblaster, bør denne fremgangsmåde tillader lyddæmpning af forskellige gener og vurderingen af deres implikation i forskellige funktioner eller karakteristika celletype. Desuden transfektion af ekspressionsvektorer er også mulig med denne protokol og vil give supplerende data til siRNA tilgang. Med hensyn til EMSA, giver denne teknik en hurtigere og simplere metode til at evaluere protein-DNA-komplekser i forhold til alternative fremgangsmåder, såsom DNase I footprinting, methylering interferens assay chromatin immunoprecipitation og chromatin konformation analyser. Derfor denne teknik er stadig værdifuld i standard promotor analyser eller afprøvning af andre forstærker / suppressor-holdige DNA-områder. Vores demonstration af sin pålidelige brug for villøse cytotrophoblaster er vigtig, da det tilføjer oplysninger om regulering af gener, med potentielle konsekvenser på det funktionelle niveau. På trods af deresbegrænset tid i kultur, primære villøse cytotrophoblaster er egnede til standardstudier og bør kunne tilpasses til den nyere samt informative metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Sciences og Engineering Research Council of Canada (NSERC) (# 298.527) (BB). CT blev støttet af en institutionel FARE stipendium. AV blev understøttet af en NSERC Graham Bell Ph.D. stipendium. BB holdt en Canada Research Chair i Human Retrovirology (Tier 2). Tak til Beatrix Beisner om hjælp til at revidere teksten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
