Summary
Ce protocole décrit un procédé pour transfecter efficacement ARNsi dans les cytotrophoblastes villeux humaines fraîchement isolées en utilisant la microporation et l'identification des complexes ADN-protéine dans ces cellules. Les cellules transfectées peuvent être contrôlées par Western Blot et des analyses EMSA pendant la période de culture de 4 jours.
Protocol
Le comité d'éthique de l'UQAM a approuvé ces protocoles, qui sont en conformité avec les directives du comité d'éthique de l'Hôpital St-Luc du Centre hospitalier universitaire de Montréal (Montréal, Canada). Les participants ont signé un formulaire de consentement éclairé.
1. Moyen Préparation et isolement de primaires villosités cytotrophoblastes
- Préparer un milieu de culture pour les cytotrophoblastes villeux primaires humains en complétant Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 25 mM de HEPES, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Filtrer le milieu préparé à travers un filtre de 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -20 ° C en aliquotes de 50 ml.
- Isoler cytotrophoblastes villosités primaires de placentas frais suivants protocoles standard 3.
- En utilisant des pinces, retirer la membrane foetal à partir du tissu en grattant doucement le tout, en prenant soin de ne pas enlever le tissu villeux. Coupe lerestante villosités placentaires en cubes d'environ 3 x 3 cm à l'aide de scalpel et les ciseaux. Laver soigneusement avec de l'eau contenant 0,9% de NaCl pour éliminer le sang maternel.
- Tenir chaque cube avec une pince, retirer délicatement le tissu villeux de navires restants et des ciseaux de tissu fibreux à l'aide.
- 15 à 30 mg de tissu villeux, digèrent quatre fois dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant de la trypsine ( à partir de 9,6 x 10 5 à 1,8 x 10 6 U; concentration finale 1,2 mg / ml) et de la désoxyribonucléase I (DNase I) ( une concentration finale de 200 pg / ml) pendant 30 min à 37 ° C dans un bain-marie avec une agitation continue.
Remarque: Utilisez 150 ml volume total pour la première digestion, 100 ml pour la deuxième digestion et 75 ml pour les deux digestions restants.
- Recueillir le surnageant contenant des cellules dispersées et centrifuger à 1.250 xg pendant 15 min sans frein. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM contenant préchauffée1% de pénicilline / streptomycine.
- Couche des cellules dispersées au - dessus d'un 5% discontinu - 70% gradient de silice polyvinylpyrrolidone revêtu (voir le tableau 1 pour la préparation gradient) et centrifuger pendant 23 min à 507 xg sans frein. Enlever la couche de densité entre 1,017 à 1,033 par aspiration et collecte des couches entre 40% et 50% du gradient avec une nouvelle pipette. Laver les cellules abondamment avec 10 ml de pré-chauffé DMEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine.
Note: La fraction recueillie correspond à des densités entre 1.048 et 1.062, qui abrite les trophoblastes. - Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. En bref, mélanger des cellules et ajouter 10 ul dans un nouveau tube. Ajouter 10 pi de bleu trypan et mélanger doucement à nouveau. Dresser la suspension cellulaire et remplir les chambres de hémocytomètre. Compter les cellules sous objectif 10X.
- Placez 1 x 10 6 et 4,5 x 10 6 cellules dans des tubes séparés pour une utilisation dans les sections 1.3 et 2, respectivementl y. Ensemencer les cellules restantes à une densité de 1,5 x 10 6 cellules / puits dans du milieu DMEM additionné et de la culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant un maximum de 4 jours pour les autres expériences.
- En utilisant des pinces, retirer la membrane foetal à partir du tissu en grattant doucement le tout, en prenant soin de ne pas enlever le tissu villeux. Coupe lerestante villosités placentaires en cubes d'environ 3 x 3 cm à l'aide de scalpel et les ciseaux. Laver soigneusement avec de l'eau contenant 0,9% de NaCl pour éliminer le sang maternel.
- L'évaluation de la pureté des villosités primaires isolées cytotrophoblastes
- Spin 1 x 10 6 des cytotrophoblastes fraîchement isolées dans des tubes à centrifuger à 300 x g. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de solution salée préchauffée tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger les cellules à 300 xg et supprimer PBS par aspiration.
- Ajouter 1 ml de methanol froid aux cellules et on incube à -20 ° C pendant 20 min. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 minutes et éliminer le methanol par aspiration.
Attention: Utiliser un masque à cartouche, lunettes de protection et des gants de caoutchouc lors de la manipulation du méthanol. - Ajouter 1 ml de PBS à la température ambiante pour réhydrater les cellules, centrifuger à 300 xg et enlever PBS par aspiration.
- Incuber les cellules dans du PBS contenant du FBS (1:50 [v / v] dilution) et un FcRun réactif de blocage (1:10) pendant 45 min à température ambiante pour éliminer la liaison non spécifique.
- Laver deux fois avec 500 pi de la température ambiante PBS, les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min et retirez PBS par aspiration. Resuspendre les cellules dans 100 ul de PBS température ambiante.
- Incuber les cellules avec un isothiocyanate d'anticorps monoclonal de souris de fluorescéine (FITC) LP5K anti-humain de la cytokératine-7 clone d'anticorps (1: 200) ou un anticorps de contrôle correspondant à l'isotype non spécifique dans du PBS contenant 0,2% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante l'obscurité. Laver les cellules dans du PBS.
- Analyser les cellules par cytométrie en flux 3. Utiliser des préparations cellulaires, qui font preuve d'un minimum de 96% de cellules CK-7 positives par cytométrie de flux pour d'autres expériences.
2. siRNA Transfection des droits primaires villosités cytotrophoblastes
- Transfection de cytotrophoblastes villosités primaires humains en utilisant un dispositif de microporation
- Préparer des plaques à 6 puits contenant2 ml de milieu DMEM additionné pour l'incubation des cellules micropore.
- Après isolement de cytotrophoblastes primaires (voir section 1.2), prélever une aliquote de cellules en suspension et de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Transférer 1,5 x 10 6 cellules à un microtube et un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Laver les cellules avec 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -free) et sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules doucement dans 100 ul de tampon de remise en suspension.
Note: Eviter maintenir la suspension de cellules pendant plus de 15 à 30 min à température ambiante, afin de maximiser la viabilité cellulaire et de l'efficacité de la transfection. - Ajouter 300 ng de syncytine-2 siRNA (ou control-brouillées siRNA) au tube de 1,5 ml et aspirer le mélange de cellules-siRNA en utilisant une transfection pipette 100 pi. Insérerla pipette dans la station (voir la liste des matériaux) et soumettre les cellules à une impulsion unique de 30 msec 1300 V.
- Transférer immédiatement les cellules à des plaques 6 puits (préparé à l'étape 2.1.1) contenant 37 ° C préchauffé milieu supplémenté pour éviter des dommages aux cellules.
- Répétez les étapes 2.1.5 et 2.1.6 pour les échantillons restants.
- Agitez doucement la plaque pendant 30 secondes pour assurer une distribution des cellules. Incuber la plaque à 37 ° C dans un humidifié incubateur à CO2 pendant 24 à 48 heures. Actualisez milieu de culture 24 heures après la transfection.
- Évaluer l'efficacité de transfection par analyse Western blot (voir les étapes 3 à 6).
- Lipofection de siRNA dans les cytotrophoblastes primaires humaines
- Après isolement de cytotrophoblastes villeux, ensemencer les cellules à une densité de 1,5 x 10 6 cellules par puits dans des plaques à 6 puits dans 2 ml de milieu de culture et mettre à incuber pendant 18 heures.
- Diluer 300 ng de syncytine-2 spécifique siRNA (ou brouillés contrôle-ARNsi) et 5 ul de réactif de transfection à base de lipides dans des tubes séparés de 1,5 ml dans un volume total de 10 ul de milieu aux antibiotiques et sans sérum. Incuber pendant 5 min.
- Mélanger les réactifs dilués et laisser incuber pendant 20 minutes supplémentaires à la température ambiante pour former le complexe de transfection. Ajouter 90 ul de milieu sans sérum et aux antibiotiques, au mélange à un volume final de 100 ul.
- Éliminer le milieu de culture à partir des plaques à 6 puits (étape 2.2.1). Ajouter 2 ml de milieu frais et le mélange de transfection de 100 ul dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 24 à 48 heures. Actualisez milieu de culture 24 heures après la transfection.
- Évaluer l'efficacité de transfection par analyse Western blot (voir les étapes 3 à 6).
3. Préparation de lysats de toute la culture cellulaire
- Retirez le support et rincer chaque puits ( à partir des étapes 2.1.8 et 2.2.4) en utilisant DPBS pré-chauffé (Mg 2+, Ca 2+ libre). Aspirer le DPBS et ajouter 500 pi de trypsine à 0,25% d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber pendant 1-3 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2. Arrêter le traitement de la trypsine en ajoutant 500 ul de sérum contenant du milieu de croissance.
Note: Utiliser le volume des médias appropriés selon le type de flacon / plat: 1 ml par 10 7 cellules / boîte de 100 mm / 150 cm 2 flacon; 0,5 ml par 5 x 10 6 cellules / boîte de 60 mm / 75 cm 2 flacon. - Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml, un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Laver les cellules avec du DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) et un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot. Placer le tube sur la glace. Reprendre le culot dans 50-200 ul Radio-immunoprécipitation Assay (RIPA) tampon glacée (voir le tableau 2 pour la composition du tampon) contenant fraîchement ajoutered protéase et d'inhibiteurs de phosphatase à une concentration finale 1x. En bref, le tube vortex et laisser sur la glace pendant 30 min.
- Spin à 16.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Placez délicatement le tube sur la glace. En utilisant une pipette, transférer le surnageant dans un tube à centrifuger pré-refroidi frais conservés sur la glace. Jeter le culot.
4. Préparation des extraits nucléaires de cellules cultivées
- Pour chaque puits (étape 1.2.5), laver cytotrophoblastes culture deux fois avec 1 ml de pré-chauffé DPBS (Mg 2+, Ca 2+ libre). Aspirer DPBS et ajouter 500 pi de 0,25% de trypsine / EDTA. Incuber pendant 1-3 min à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 et d' arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant 500 ul de sérum contenant du milieu de croissance.
- Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml, un culot de cellules par centrifugation à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Laver les cellules avec du DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) et un culot de cellules par centrifugation ,à 300 g pendant 2 min à température ambiante. Retirez délicatement tout surnageant sans perturber le culot et placer le tube sur la glace.
- Extraire la protéine nucléaire selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration en protéine de chaque échantillon en utilisant un dosage de protéine de quantification (Bradford ou un dosage à l'acide bicinchoninique (BCA)).
5. Préparation des échantillons et Électrophorèse
- Déterminer la concentration en protéines de chaque extrait cellulaire en utilisant un dosage de protéine de quantification (par exemple, Bradford 8 ou 9 BCA).
- Selon les instructions du fabricant (si les anticorps pourraient être utilisés dans la réduction et la dénaturation des conditions), ajouter un volume égal de 2x Laemmli Sample Buffer (tableau 2) à 20-30 ug de protéine totale.
- Faire bouillir les lysats cellulaires à 100 ° C pendant 5 min. Aliquoter 50-100 ul de lysat pour éviter les cycles / de congélation-décongélation répétés et stocker les tubes restants à -20 ° C pour une utilisation future. Tandis que les échantillons sont le chauffage, la préparation de 1 litre de 1 x tampon en cours d' exécution (tableau 2).
- Faites tourner les échantillons à 16.000 xg pendant quelques secondes et placez-les sur la glace.
- Charger la même quantité de protéine dans chaque puits d'un gel SDS-PAGE à 12% (voir le tableau 2 pour la composition de gel), avec un marqueur de poids moléculaire. Exécutez le gel pendant 1-2 heures à 100 V.
6. Le transfert de la protéine à partir du gel à la membrane
- Activer le fluorure de polyvinylidène (PVDF) avec du methanol pendant 1 min, puis rincer avec une solution tampon / 10% de méthanol de transfert de 1x. Selon les instructions du fabricant, le transfert pendant 30 minutes à 1 heure selon la taille de la protéine.
Remarque: L'efficacité du transfert peut être évaluée en utilisant Ponceau Rouge coloration avant l'étape de blocage.
7. Anticorps Staining
- Bloquer la membrane pendant 1 heure à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C en utilisant une solution de blocage de 5%.
- Incuber la membrane avec des anti-syncytine-2 anticorps (4 ug / ml; 1: 5000) 6 ou avec un anticorps anti-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) dans une solution de blocage de 5% pendant une nuit à 4 ° C (anti-syncytine-2) ou pendant 45 min à température ambiante. Laver la membrane trois fois dans une solution saline tamponnée au Tris Tween (TBST; voir le tableau 2 pour la composition du tampon) pendant 5 min.
- Incuber la membrane avec de la peroxydase de raifort approprié (HRP) conjugué à anti-lapin ou un anticorps anti-souris (1: 10000) dans un tampon de blocage 5% dans du TBST à température ambiante pendant 1 h. Laver la membrane trois fois dans TBST pendant 5 minutes, puis rincer à TBS. Détecter les signaux en utilisant le substrat à base de blot chimioluminescence.
8. radiomarquage de Single Stranded Oligonucleotide
- réaction de phosphorylation
- Dans un microtube, ajouter 50 ng d'un oligonucléotide avec un tampon avant le long de polynucleotide kinase T4 1x, U 1T4 polynucleotide kinase et 20 uCi (γ- 32 P) ATP et de faire augmenter le volume de réaction à 20 pi avec de l' eau sans nucléase.
- Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Arrêter la réaction en ajoutant 5 ul de 0,5 M d'EDTA. Compléter le volume à 50 ul avec de l'eau sans nucléase.
- L'élimination des nucléotides non constituées à partir d'oligonucléotides
- Préparer une colonne G-25 équilibrée avec du tampon TE (tableau 2) suivant les instructions du fabricant. Placer la colonne dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse sans DNase frais.
- Ajouter lentement 50 pi de sonde (de l'étape 8.1.2) sur la résine, en faisant attention à ne pas perturber le lit de résine. Centrifugation pendant 2 minutes à 350 x g pour recueillir l'échantillon purifié dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Laver la colonne G-25 avec 36 pi d'eau sans nucléase et de spin pendant 2 min à 350 xg pour les recueillir dans le tube à centrifuger.
- Hybridation avec le brin complémentaire oligonucleotide
- Transférer la sonde radiomarquée (86 ul) dans un tube de 1,5 ml et ajouter 200 ng de l'oligonucléotide inverse et 1x de tampon d'hybridation ( voir le tableau 2). Pendant 5 min à 95 ° C et on laisse une nuit à température ambiante pour refroidir.
- Préparer des oligonucléotides double brin non radioactifs en ajoutant 50 ng de non marqué avant et arrière oligonucléotides et 1x de tampon de recuit dans un tube de 1,5 ml. Compléter le volume à 100 pi avec de l'eau sans nucléase. La chaleur et maintenir à la température ambiante comme décrit à l'étape 8.3.1.
9. Préparation d'un gel de polyacrylamide non dénaturant pour EMSA
- Préparer un gel natif de 4% (10 x 12 cm) avec un 1,5 mm d' espace-peigne (voir le tableau 2 pour la composition de gel). Nettoyer les plaques de verre à l'aide d'eau distillée.
Remarque: Il est essentiel que les plaques soient totalement exempts de détergent ionique, comme SDS. - Immédiatement pnotre solution d'acrylamide entre les plaques et permettre à la polymérisation de procéder (environ 30 minutes).
- Assembler l'appareil d'électrophorèse et remplir le réservoir avec 0,5x TBE. Pré-exécuter le gel pendant 30 min à 1 h à 150 V avant le chargement des échantillons.
La réaction de liaison 10. ADN
- Dans un tube de 1,5 ml, ajouter 10 pg d'extrait nucléaire (étape 4.3) 1x Gel Décalage reliure tampon (tableau 2) et compléter le volume final à 10 pi avec de l' eau sans nucléase. Comme témoin, on prépare un tube sans extrait nucléaire. Pour la réaction de la concurrence, ajouter 1 pl d'oligonucléotide froid non spécifique ou spécifique double brin (étape 8.3.2).
- Ajouter 1 pl de sonde radioactive de l'étape 8.3.1 à chaque réaction. Laisser incuber la réaction à température ambiante pendant 20 min. Ajouter 1 pi de tampon de charge 10x gel par réaction et charger chaque échantillon sur le gel préparé à l'article 9.
- Exécutez le gel pendant 1 1/2 à 2 heures à 150 V. Après la migration, enveloppez le gel et le verre dans une pellicule de plastique et de la position dans une cassette d'exposition au-dessous d'un écran luminescent. Laissez la cassette à 4 ° C pendant 24 heures.
- Retirez l'écran de la cassette d'exposition et l'insérer dans le dispositif d'imagerie de phosphore pour la numérisation.
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Representative Results
placentas frais de grossesses à terme ont été utilisés pour isoler les cytotrophoblastes villosités primaires humains pour mener l'ensemble des expériences présentées dans la section Protocole. Après leur isolement, nous avons d' abord analysé la pureté de cytotrophoblastes par l'utilisation de la cytokératine-7 marqueur (Figure 1). Préparations cellulaires ont ainsi été colorées en utilisant un anticorps monoclonal anti-cytokératine-7. La figure 1 représente les résultats d'une expérience typique après purification de cytotrophoblastes villeux primaire, analysée par cytométrie de flux standards. Après l'étape de gradient de densité,> 97% de cellules (dans ce cas, 99%) sont colorées positivement pour la cytokératine-7 dans des essais standards, ce qui démontre un très haut degré d'efficacité dans la purification de ce type de cellule.
Après leur isolement, les cytotrophoblastes primaires humains peuvent être directement utilisés pour transfection. Deux protocoles différents ont été évaluées, à savoir la microporation et la transfection à base de lipides. Les deux protocoles ont été testés avec l'ARNsi spécifique à l'ARNm syncytine-2 et comparés à ceux d'un ARNsi crypté (contrôle négatif). L'efficacité de transfection a ensuite été évaluée par analyse par transfert de Western. Les résultats ont confirmé que l' expression syncytine-2 a été significativement réduits au silence dans des extraits de cytotrophoblaste dérivé sur la microporation (figure 2). D'autre part, aucune inactivation significative n'a été observée lorsque des ARNsi ont été transfectées par le réactif de transfection à base de lipides.
Nous avons également mené des expériences EMSA sur cytotrophoblastes fraîchement isolés. Une sonde radiomarquée qui provient d'une région de promoteur syncytine-2 a été synthétisé. La sonde synthétisée (appelée WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') a été précédemment montré pour lier 7 facteurs de transcription liés CREB. En présence d'une extr nucléaire actes de 24 et 48 h cytotrophoblastes villeux culture, la sonde syncytine-2-promoteur dérivé ont montré la présence de deux complexes ADN-protéines. L'addition de l'oligonucléotide froid 100x WT a participé à la formation du complexe, tandis qu'aucune compétition similaire avec un excès d'un oligonucléotide non lié à froid (souris crête neurale Enhancer 2; 5 'GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3') a été observée, ce qui confirme la spécificité des deux signaux ( Figure 3).
Figure 1. Evaluation de la pureté de cytotrophoblastes villosités primaires par cytométrie de flux. Fraîchement isolé préparations de cytotrophoblastes villosités ont d' abord été perméabilisées puis marquées avec un anticorps de contrôle d'isotype (ligne rouge) ou un anticorps monoclonal spécifique de cytokératine-7 (ligne noire). Les cellules ont été analysées par cytométrie de flux. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Comparaison des siARN efficacités de transfection entre transfection et microporation à base de lipides. Cytotrophoblastes villeux fraîchement isolées ont été transfectées avec 300 ng de syncytine-2 spécifique siRNA contre un siRNA contrôle brouillé en utilisant le réactif ou microporation à base de lipides. (A) Les analyses Western blot ont été effectuées sur des extraits cellulaires à partir de chaque condition de transfection en utilisant l' anti-syncytine-2 et des anticorps anti-GAPDH. Les niveaux des analyses Western blot syncytine-2 protéines (B) ont été quantifiés en termes d'intensité de bande suivant la normalisation avec des signaux de GAPDH correspondant (barres d'erreur sont définis comme SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. complexes ADN-protéines identifiées par l' analyse EMSA. Des extraits nucléaires de cytotrophoblastes villosités primaires cultivées pendant 24 ou 48 heures ont été incubées avec une sonde WT correspondant à une région de promoteur de syncytine-2 avec ou sans excès (100x) de spécifique ou non oligonucléotides froids. complexes ADN-protéines ont été séparés lors de la migration sur un gel natif. signaux spécifiques et sondes libres sont indiquées sur le côté droit du gel. sonde WT incubées en l'absence d'extrait nucléaire a également été utilisé comme témoin négatif. Extraits nucléaires cytotrophoblaste CT NE =. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| % De Percoll finale | Volume de Percoll (90%) (ml) | Volume de HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0,67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0,67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| dix | 0,33 | 2.67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Tableau 1. 5% de réglage du gradient de la silice revêtue de polyvinylpyrrolidone à 70%.
| Tampon | Composition | Commentaires / Description |
| PBS 1x | 0,9 mM de CaCl2, 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 0,5 mM MgCl 2, NaCl 136,9 mM et 0,8 mM de Na 2 HPO 4 | |
| RIPA Buffer | NaCl 150 mM, 1,0% de NP-40 ou 0,1% de Triton X-100, le désoxycholate de sodium à 0,5%, 0,1% SDS (dodécylsulfate de sodium), 50 mM Tris-HCl pH 8,0, | |
| Sample Buffer Laemmli | 4% de SDS, 10% de 2-mercaptoethanol, 20% de glycerol, 0,004% de bleu de bromophénol, 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x tampon en cours d'exécution | 25 mM de base Tris, la glycine 190 mM, SDS à 0,1% | |
| tampon de transfert 10x | Tris base 25 mM, Glycine 192 | |
| tampon TBST 1x | 10 mM de Tris-HCl, 15 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20 à pH 7 | Bien mélanger et filtrer. Le non-filtre peut conduire à "repérer" de la membrane. |
| un tampon de blocage | 5% de lait ou de BSA (sérum albumine bovine) a été ajouté à 1 x tampon TBST | |
| tampon TE | 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM | |
| tampon Recuit | 1 M de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de MgCl2, 0,2 mM d' EDTA, 1 mM de DTT | |
| 5x Gel Maj Binding Buffer | 20% glycérol, 5 mM de MgCl2, 2,5 mM d' EDTA, 2,5 mM de DTT, 250 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 0,25 mg / ml de poly (dl-dC). | |
| tampon de chargement | 250 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% de bleu de bromophénol et 40% de glycérol | |
| TBE 5x | Dissoudre 54 g de base Tris et 27,5 g d'acide borique dans 1 litre d'eau déminéralisée, qui comprend 20 ml d'EDTA 0,5 M pH 8 | |
| 4% de gel natif | tampon TBE 5x | 6,0 ml |
| 29: 1 acrylamide / bisacrylamide (30% p / v) | 10 ml | |
| 40% d'acrylamide (p / v) | 0,75 ml | |
| 100% de glycérol | 1,5 ml | |
| Eau distillée | 41,5 ml | |
| 25% de persulfate d'ammonium | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacroi Gel (6 ml) pour SDS-PAGE | ddH 2 O | 4,1 ml |
| 30% Acrylamide | 1,0 ml | |
| 1,0 M de Tris | 0,75 ml | |
| SDS à 10% | 60 ul | |
| 10% APS | 60 ul | |
| TEMED | 6 pi | |
| 12% gel de séparation (10 ml) pour SDS-PAGE | ddH 2 O | 3,3 ml |
| 30% Acrylamide | 4,0 ml | |
| 1,5 M de Tris | 2,5 ml | |
| SDS à 10% | 100 ul | |
| 10% APS | 100ul | |
| TEMED | 4 ul |
Tableau 2. Composition des tampons.
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Discussion
Les études sur la fonction placentaire humaine et le développement ont été grandement améliorées par des protocoles visant à optimiser l'isolement des différentes populations de cellules placentaires. L'un des meilleurs population de cellules placentaires étudiée reste les cytotrophoblastes villeux, dont l'étude a grandement bénéficié de protocoles optimisés permettant l'isolement efficace et fiable. Cela a permis en outre un certain nombre d'expériences, telles que des études de transfection et de promoteur. En utilisant un protocole précédemment décrit 3, les populations pures de cytotrophoblastes villeux primaires peuvent être obtenus. CK-7 est une protéine de filament intermédiaire, qui est exprimé dans les cytotrophoblastes. Des anticorps monoclonaux contre cette protéine sont utilisés pour déterminer la pureté de cette population trophoblaste après leur isolement à partir du placenta 10. Les préparations sont définies comme étant pur quand 96% des cellules sont positives pour la CK-7. Les cellules peuvent ensuite être utilisés directement pour la transfection. les protocoles de transfectionimpliquant des approches à base de lipides sont largement utilisés pour transférer des acides nucléiques dans des cellules primaires 11,12. Cependant, la toxicité de la formulation lipidique dans certaines cellules devient un inconvénient. Microporation est une technologie d'électroporation en utilisant un embout de pipette en tant qu'espace d'électroporation, ce qui génère une chaleur minimale, la dissolution des ions métalliques, la variation du pH et de la formation d'oxyde; qui peuvent tous être délétère pour les cellules. Sur la base des données présentées ici, microporation représente une approche plus efficace pour la livraison de siRNA que le protocole de transfection à base de lipides, d'après des analyses Western blot. En utilisant une approche EMSA, une sonde conçue contre une région sélectionnée du syncytine-2 promoteur qui est connu pour lier des facteurs importants pour son activité 7 a été testée. La sonde a été incubé avec l'extrait nucléaire de cytotrophoblastes isolées. Comme présenté sur la figure 3, les signaux spécifiques ont été obtenus.
Les différents protocoles décrits ici have été optimisée au cours des dernières années. Cependant, ils reposent tous sur des préparations de cytotrophoblaste de haute qualité, qui dépendent d'un certain nombre d'étapes critiques. Tout d'abord, après la naissance, placentas doivent être conservés dans une solution tampon et les cellules doivent être isolés d'eux pas plus de 5 heures après avoir été immergé dans la solution. traitements trypsine et DNase sont également d'une grande importance et doivent être soigneusement prises pour maximiser la qualité de la préparation cytotrophoblaste. Vaste lavage des villosités de placenta et la réduction du temps nécessaire à leur isolement sont deux améliorations supplémentaires, ce qui peut fortement améliorer l'efficacité du nombre de cellules d'isolement. Le rendement de ce protocole dépend en outre de centrifugation optimale lors de l'étape de gradient de densité, qui doit être surveillée de près. Le défaut d'équilibrer correctement les tubes sera également conduire à des distorsions du gradient et réduire considérablement le nombre de cellules.
Le protocole de transfection décriventd ici a été testé sur plusieurs années. Bien que les conditions nécessaires à microporation sont généralement simples, l'optimisation de la transfection pour les différentes cellules primaires sont néanmoins nécessaires. Cela implique également l'optimisation de la quantité d'acide nucléique transfecté (ARNsi ou d'ADN de plasmide). Ainsi, pour le protocole décrit ici, l'optimisation des diverses concentrations ARNsi est recommandé d'identifier un ARNsi réprimant efficacement. L'addition d'un volume de suspension approprié au culot cellulaire avant microporation et la suspension complète des cellules sont autant de facteurs qui influent sur l'efficacité de la transfection.
expériences EMSA ont également nécessité l'optimisation. Compte tenu de l'hétérogénéité associée à des donneurs de placenta et les efficacités variables et des puretés d'isolement cytotrophoblaste, expériences EMSA doivent être répétées jusqu'à 5 fois pour confirmer les résultats. De plus, présentant un nombre élevé de cellules est important afin d'assurer prote suffisammentdes niveaux dans des préparations d'extraits nucléaires et la détection ultérieure de complexes protéine / ADN. En outre, des sondes oligonucléotidiques hautement radioactives doivent être préparées et doivent être préparées à partir d'ATP radioactif récemment acheté.
Une série de limitations doit être soulignée dans le protocole présenté. Il doit d'abord souligner que les analyses de cytométrie en flux ne peuvent pas évaluer la présence potentielle de fragments de syncytiotrophoblaste dans les préparations cellulaires. D' autres protocoles ont été proposées pour résoudre ce problème, telles que le tri en utilisant la cytométrie de flux ou de l'utilisation de billes magnétiques liées à l' anticorps 13,14. Il convient de mentionner cependant que ces fragments ne sont normalement pas adhérer aux puits de culture cellulaire et sont souvent enlevées après l'étape de lavage des cellules. Une autre limitation du protocole présenté est que cytotrophoblastes villeux primaires ont un temps de survie très limitée dans une culture cellulaire. Par conséquent, quelle que soit la méthode choisie, la transfection stable de Vilcytotrophoblastes lous restera inaccessible. EMSA analyses, comme décrit dans ce protocole, ont aussi certaines limites. Bien que la spécificité des signaux peut être facilement évaluée par des expériences de compétition avec excès d'oligonucléotides non marqués, les facteurs liés ne peuvent être identifiés en utilisant des anticorps contre les facteurs de transcription spécifiques résultant des signaux supershifted. Expériences EMSA ailleurs restent limitées car il étudie dans les interactions protéine-ADN in vitro. Des expériences avec des paramètres plus représentatifs, tels que dosage ChIP, et plus récemment dans les protocoles in vivo sont nécessaires pour confirmer davantage le résultat EMSA.
Les protocoles décrits ici pour l'isolement cytotrophoblaste et transfection ont des applications importantes pour les études dans lesquelles le silençage transitoire ou surexpression de gènes spécifiques est nécessaire pour comprendre leur rôle dans la fonction, la prolifération ou la différenciation d'un type de cellule de trophoblaste spécifique. En outre, lors de la transfection, tLes versions agged des protéines exprimées seront appropriées pour le suivi et analyse intracellulaire par des techniques classiques, telles que la microscopie confocale et cytométrie de flux. Le protocole EMSA peut être utilisé pour étudier les détails complexes relatifs à la régulation du promoteur et les facteurs de transcription impliqués. En outre, cette approche expérimentale permettra aux chercheurs d'identifier les facteurs impliqués dans le développement de certaines maladies liées à une carence en placentation et la régulation altérée des gènes exprimés dans cytotrophoblastes villeux.
En conclusion, les cytotrophoblastes humains primaires peuvent être facilement isolés à partir de placentas et se prêtent à des protocoles standards, tels que la transfection de siRNA et de l'EMSA. Bien que les procédures de transfection différentes, telles que la lipofection 15 et nucléofection 16 sont disponibles, microporation semble une méthode très efficace pour siRNA transfection de cytotrophoblastes villeux isolées, offrant une approche avec peu de cellulesath et un coût relativement faible. Dans le contexte de cytotrophoblastes villeux, cette approche devrait permettre la mise sous silence des gènes différents et l'évaluation de leur implication dans différentes fonctions ou caractéristiques du type de cellule. En outre, la transfection de vecteurs d'expression est également possible en utilisant ce protocole et d'obtenir des données complémentaires à l'approche siRNA. En ce qui concerne l'EMSA, cette technique fournit un procédé plus rapide et plus simple d'évaluation de complexes protéine-ADN par rapport à d'autres approches, telles que la DNase I empreinte, un dosage d'interférence de méthylation, immunoprécipitation de la chromatine et la conformation de la chromatine analyse. Par conséquent, cette technique reste valable dans les analyses ou les essais de tous les autres / régions d'ADN contenant suppresseurs-enhancer promoteur standard. Notre démonstration de son utilisation fiable pour cytotrophoblastes villeux est important, car il ajoute des informations sur la régulation des gènes, avec des implications potentielles au niveau fonctionnel. En dépit de leurtemps limité dans la culture, cytotrophoblastes villosités primaires sont appropriés pour des études standard et devrait être adaptable à la plus récente ainsi que des méthodes d'information.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la sciences et en génie du Conseil national du Canada (CRSNG) (# 298527) (BB). CT a été soutenu par une bourse de FARE institutionnelle. AV a été soutenu par un doctorat du CRSNG Graham Bell Bourse d'études. BB titulaire d'une chaire de recherche du Canada en rétrovirologie humaine (niveau 2). Merci à Beatrix Beisner de l'aide dans la révision du texte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
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