This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
العضلية مثقف يمكن استخدامها لدراسة cardiomyocyte البيولوجيا باستخدام التقنيات التي هي مكملة للأنظمة في الجسم الحي. على سبيل المثال، ونقاء وسهولة الوصول إليها من ثقافة في المختبر يمكن دفع غرامة السيطرة على التحاليل البيوكيميائية، والتصوير الحي، والكهربية. ثقافة على المدى الطويل العضلية تقدم الوصول إلى المناهج التجريبية الإضافية التي لا يمكن أن تكتمل في الثقافات على المدى القصير. على سبيل المثال، وحتى الآن إلى حد كبير اقتصر التحقيق في المختبر فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا العضلية على الفئران، والتي تظهر لتكون أكثر قوة في الثقافة على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن توافر مجموعة أدوات غنية من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ونماذج المرض متطورة تجعل أنظمة الماوس جاذبية للأبحاث القلب. على الرغم من أن العديد من التقارير وجود من الماوس الكبار cardiomyocyte العزلة، عدد قليل من الدراسات تظهر ثقافة على المدى الطويل. المقدمة هنا هي طريقة خطوة بخطوة لالعزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. أولا، يتم استخدام الوراء نضح Langendorff الهضم بكفاءة القلب مع البروتياز، تليها تنقية خطورة الترسيب. بعد فترة من العزلة فقد التمايز التالية، وخلايا إرفاق تدريجيا للثقافة ويمكن تربيتها لمدة أسابيع. يستخدم المحللة خلية اتش لتنبيغ بكفاءة العضلية معزولة. وتوفر هذه الأساليب لذلك، نظام نموذجي بسيطة لكنها قوية لدراسة البيولوجيا القلب.
وكثيرا ما تستخدم العضلية مثقف لمراقبة سلوك الخلايا في بيئة تسيطر عليها بشكل جيد في المختبر. على سبيل المثال، خصائص الخلية المورفولوجية والكهربائية، والكيمياء الحيوية، أو الميكانيكية يمكن دراستها على ركائز هندسيا، 1،2 في وسائل الاعلام محددة، وردا على المخدرات جزيء صغير، والببتيدات، تنظيم الجينات، 3 أو التحفيز الكهربائي. 4 المحتوى الخلوي يمكن أيضا يمكن السيطرة عليها باستخدام تعريف المشترك الثقافات. 5 هذه التجارب في المختبر هي مفيدة في مجال مكافحة المخدرات كبيرة أو شاشات الوراثية وتكمل في طرق الحي لأنواع مختلفة من التحقيقات التي تنطوي على البيولوجيا cardiomyocyte.
ثقافة على المدى الطويل تمكن السبل التجريبية التي تتطلب فترات زمنية طويلة لتحقيق التغيير المظهري. والمثال في الوقت المناسب هو أن من البالغين انتشار cardiomyocyte الثدييات، حيث عادة ما يتم دراستها فقد التمايز، دورة الخلية اعادة الدخول، وانقسام الخلايا على ذاتهأيام veral إلى أسابيع. 6،7 هنا، وهي المرة ثقافة بمد يسهل التلاعب الجيني، 7،8 فقد التمايز الوظيفي (على سبيل المثال، التفكيك الساركومير) 9 وفقد التمايز يحتمل النسخي. 6 اللاحقة دورة الخلية اعادة الدخول وانقسام الخلايا يتطلب فترات أطول الثقافة للاحتفال، خاصة إذا جولات متعددة من الانقسام هي الهدف التجريبي. أهمية الخلية دورة cardiomyocyte أمر أساسي لعدة أعمال العلمية الرئيسية الأخيرة في تجديد القلب، حيث تبين أن فقد التمايز وانتشار الخلايا العضلية الموجودة من قبل المسؤولين عن تجديد القلب في الزرد والفئران حديثي الولادة. 10-12 وهكذا، فإن إمكانية لتحفيز فقد التمايز ودورة الخلية اعادة الدخول في العضلية الكبار الثدييات يبقى السؤال الرئيسي في تجديد قلب الإنسان 13-15
أنا ن التجارب في المختبر دراسة دورة الخلية من القلب الثديياتوقد استخدمت myocytes في الغالب مصادر الفئران، نظرا لسهولة النسبية للثقافة على المدى الطويل مقارنة مع نماذج الماوس. 16 ومع ذلك، نظم الفئران توفر الموارد غنية من الأدوات المعدلة وراثيا تتميز بشكل جيد ونماذج المرض التي هي مفيدة في كل من في المختبر والمجراة البروتوكولات. على سبيل المثال، قد مكن تتبع النسب استنادا لجنة المساواة العرقية تحديد العضلية الموجودة مسبقا كمصدر للتجديد عضلة القلب في قلب فأر حديثي الولادة في الجسم الحي. 12 في الدراسات المختبرية العضلية الماوس حديثي الولادة، تتبع النسب مكنت دراسة التفاعلات مع انسجة الخلايا من خلال ثقافة مشتركة مع الخلايا الليفية. 5 ولكن نظرا لتحدياتها، وجود 17 تقارير قليلة من العزلة وطويلة الأجل ثقافة العضلية الماوس الكبار. 18،19
ومن المعروف ان عزلة العضلية الماوس الكبار قابلة للثقافة على المدى القصير وحدها أن تكون مهمة صعبة. هذا protocيوفر رأ خطوة بخطوة على تعليمات حول كيفية تحقيق العضلية قابلة للحياة من فئران بالغة التي يمكن أن تستخدم في كل من المدى القصير وكذلك التحقيقات على المدى الطويل. العضلية معزولة باستخدام هذا البروتوكول يمكن transduced بكفاءة مع ناقلات الفيروسة الغدانية 20،21 وتربيتها لمدة أسابيع. وتوفر هذه الأساليب نظام قوي لدراسة البيولوجيا cardiomyocyte في المختبر.
وتستند هذه الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة على عدة عناصر من الأعمال السابقة باستخدام أشكال مختلفة من نضح الوراء Langendorff. 18،22 وعلى الرغم من عدة بروتوكولات تم نشرها على عزل الخلايا العضلية الماوس الكبار للثقافة على المدى القصير والدراسة، 23-25 ميزة هذا البروتوكول هو القدرة على ثقافة العضلية معزولة على المدى الطويل. وسيكون هذا مفيدا في دراسة العمليات الخلوية التي تنطوي على التعبير الجيني خارج الرحم والتي تتطلب فترات طويلة من الوقت، كما هو الحال في استراتيجيات إعادة برمجة الخلايا.
على الصحة العامة للالعضلية معزولة تعتمد على عدة جوانب هامة من هذا البروتوكول. أولا، الوقت من استخراج القلب لنضح أمر بالغ الأهمية ويجب أن يتم تنفيذ في 5 دقائق أو أقل. إزالة الكالسيوم يساعد على فصل التفاعلات خلية خلية، ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على صحة الخلايا على المدى ال?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية الاختراق (ممولة جزئيا من قبل مؤسسة ساندلر)، والمعاهد الوطنية للصحة الطريق إلى جائزة الاستقلال (R00HL114738)، ومؤسسة إدوارد مالينكرودت الابن. وأيد JJ من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من المعاهد الوطنية للصحة (T32HL007731). الكتاب هي وحدها المسؤولة عن محتويات هذه الأعمال، التي لا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Equipment | |||
Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
NaCl | Sigma | S9888 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
Taurine | Sigma | 86329 | |
Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
HEPES | Fisher | BP310100 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
EGTA | Amresco | 0732-288 | |
Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
MEM | Corning | 15-010-CV | |
FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
Lab tape | VWR | 89097-990 | |
Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |