Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54012

Abstract

Cardiomiociti in coltura possono essere utilizzati per studiare la biologia dei cardiomiociti utilizzando tecniche che sono complementari ai sistemi in vivo. Ad esempio, la purezza e l'accessibilità della cultura in vitro consente un controllo preciso analisi biochimiche, immagini dal vivo, e elettrofisiologia. cultura a lungo termine di cardiomiociti offre l'accesso ad approcci sperimentali aggiuntivi che non possono essere completate in colture a breve termine. Ad esempio, l'indagine in vitro di dedifferentiation, ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è finora stato in gran parte limitato a cardiomiociti di ratto, che sembrano essere più robusto nella cultura a lungo termine. Tuttavia, la disponibilità di un ricco set di strumenti di linee di topi transgenici e modelli di malattia ben sviluppati rendere i sistemi di mouse attrattivo per la ricerca cardiaca. Anche se diversi rapporti esistano di topo adulto isolamento dei cardiomiociti, alcuni studi dimostrano la loro cultura a lungo termine. Presentato qui, è un metodo step-by-step per laisolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. Innanzitutto, retrograda perfusione Langendorff è usato per digerire efficientemente il cuore con proteasi, seguita da purificazione gravità sedimentazione. Dopo un periodo di de-differenziazione seguito isolamento, le cellule gradualmente attribuiscono alla cultura e possono essere coltivate per settimane. Adenovirus lisato cellulare viene utilizzato per trasdurre efficientemente i cardiomiociti isolati. Questi metodi forniscono un semplice, ma potente sistema modello per studiare la biologia cardiaco.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cardiomiociti in coltura sono spesso utilizzati per monitorare il comportamento delle cellule in un ambiente ben controllato in vitro. Ad esempio, le proprietà delle cellule morfologiche, elettriche, biochimici, o meccanici possono essere studiati su substrati ingegnerizzati, 1,2 in mezzi definiti, e in risposta ai farmaci piccole molecole, peptidi, regolazione genica, 3 o stimolazione elettrica. 4 Il contenuto cellulare può anche essere controllato tramite definiti co-culture. 5 Questi esperimenti in vitro sono utili per grandi schermi di droga o genetiche e si completano a metodi in vivo per i vari tipi di indagini che coinvolgono la biologia dei cardiomiociti.

cultura a lungo termine consente viali sperimentali che richiedono estese periodi di tempo per realizzare il cambiamento fenotipico. Un esempio attuale è quello di adulto la proliferazione dei cardiomiociti dei mammiferi, in cui de-differenziazione, del ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è tipicamente studiati su ségiorni veral o settimane. 6,7 Qui, il tempo di cultura estesa facilita la manipolazione genetica, 7,8 de-differenziazione funzionale (ad esempio, lo smontaggio sarcomerica) 9 e de-differenziazione potenzialmente trascrizionale. 6 successiva del ciclo cellulare di rientro e la divisione cellulare richiede periodi di cultura ancora più lunghi per osservare, soprattutto se più cicli di divisione sono l'obiettivo sperimentale. L'importanza del ciclo cellulare cardiomiociti è centrale per molti chiave recenti lavori scientifici nella rigenerazione del cuore, dove è stato dimostrato responsabile per la rigenerazione cardiaca in zebrafish e topi neonatali il dedifferentiation e la proliferazione dei cardiomiociti preesistenti. 10-12 Così, la possibilità per stimolare dedifferentiation e del ciclo cellulare rientro in cardiomiociti adulti mammiferi rimane una questione chiave nella rigenerazione cuore umano 13-15

I n esperimenti in vitro che studiano il ciclo cellulare dei mammiferi cardiomiociti sono prevalentemente utilizzati fonti ratto, grazie alla loro relativa facilità di coltura a lungo termine rispetto ai modelli di topo. 16 Tuttavia, sistemi murini offrono una ricca fonte di strumenti transgenici ben caratterizzati e modelli di malattia che sono utili sia in vitro che in vivo protocolli. Ad esempio, lineage tracing Cre-based ha permesso l'identificazione di cardiomiociti preesistenti come fonte di rigenerare miocardio nel cuore neonatale topo in vivo. 12 Studi in vitro su cardiomiociti di topo neonatali lineage tracing hanno permesso l'esame delle interazioni con stromale cellule attraverso co-coltura con fibroblasti. 5 Tuttavia, a causa delle sue sfide, 17 pochi rapporti esistono di isolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. 18,19

L'isolamento di vitali cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine da solo è conosciuto per essere un compito impegnativo. Questo ProtoColo fornisce istruzioni passo-passo su come raggiungere cardiomiociti vitali da topi adulti che possono essere utilizzati sia per il breve termine, così come le indagini a lungo termine. Cardiomiociti isolati utilizzando questo protocollo possono essere efficacemente trasdotte con vettori adenovirali 20,21 e coltivate per settimane. Questi metodi forniscono un potente sistema per studiare la biologia dei cardiomiociti in vitro.

I metodi descritti nel presente documento si basano su diversi elementi da opere precedenti utilizzando varianti della perfusione retrograda Langendorff. 18,22 Sebbene diversi protocolli sono stati pubblicati sulla isolamento di cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine e di studio, 23-25 ​​il vantaggio di questo protocollo è la capacità di cultura isolate cardiomiociti a lungo termine. Questo sarà utile nello studio dei processi cellulari in cui l'espressione genica ectopica e richiedono lunghi periodi di tempo, come nelle strategie riprogrammazione cellulare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutte le procedure descritte qui sono stati approvati dalla Utilizzo e manutenzione Comitato istituzionale degli animali presso l'Università della California, San Francisco.

NOTA: Brevemente, dopo estrazione cuore dal torace mouse, coronarica perfusione retrograda viene utilizzato per digerire efficientemente la matrice extracellulare con collagenasi e proteasi XIV. I ventricoli sono poi isolate, dissociato meccanicamente e filtrati in una sospensione di cellule singole. Gravità sedimentazione viene eseguita per isolare cardiomiociti, che sono separati da cellule stromali come fibroblasti e cellule endoteliali da loro alta densità. I cardiomiociti purificati possono essere coltivate per settimane su polistirolo laminina rivestite e trasdotte con vettori genici adenovirus.

Isolamento 1. Cardiomyocyte

  1. Preparare Buffer, Stazione chirurgica e perfusione Apparatus
    1. Preparare buffer e dei media in base alla TabLe 1.
    2. Accendere bagno di acqua circolante, impostare la temperatura di ingresso in modo che l'uscita della camicia d'acqua riscaldata raggiunge una temperatura di 37 ° C.
    3. sistema di perfusione pulito da vampate di calore con il 70% di etanolo. Quindi rimuovere tutte le tracce di etanolo dal sistema mediante flussaggio con diversi volumi di acqua sterile.
    4. Caricare il sistema di perfusione con tampone perfusione (Tabella 1). acqua in primo luogo di scarico dal sistema, poi sciacquare con 2 volumi di tampone perfusione. Poi riempire lo spazio morto con tampone perfusione tale che la colonna interna della giacca di calore è riempita con tampone perfusione, ma la camera debubbling è vuoto.
      SUGGERIMENTO: Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria presenti nella riga sotto la camera debubbling. Per rimuovere le bolle recalcitranti, coinvolgere tutti i rubinetti e permettere la pressione per costruire all'interno della linea per alcuni secondi. Quindi rilasciare il rubinetto inferiore, consentendo il buffer di perfusione ad alta pressione del getto dalla presa; il rapido flusso e Turbulence contribuirà a sloggiare le bolle che vengono catturati vicino alla presa di perfusione.
    5. Preparare una siringa con ago da utilizzare per incannulazione aortica. Collegare un ago smussato 18 G per una siringa da 1 ml riempita con tampone di perfusione. Rimuovere le bolle d'aria e fissare il gruppo siringa per un braccio dell'illuminatore dissezione miscroscope con nastro laboratorio.
      SUGGERIMENTO: per creare un ago ended smussato da un ago smussato, transetto l'albero ago con tronchese. Poi affinare la punta con una pietra levigatura fino a quando la punta è piatta.
      NOTA: per ridurre lo slittamento dell'aorta dall'ago durante incannulazione, irruvidire l'albero dell'ago incannulazione usando una lama di rasoio. Fissare l'ago dal mozzo e albero superiore, poi vide il rasoio e indietro perpendicolarmente all'asse lungo dell'albero dell'ago durante la rotazione fino a diversi solchi ricavati da 1 cm dalla punta dell'albero dell'ago. Passare a un nuovo rasoio quando la lama diventa opaco.
    6. Posizionare un pulitopetri piatto sotto il microscopio da dissezione per contenere il cuore durante l'incannulamento. Posizionare il braccio illuminatore tale che la punta della cannula è vicino al bordo del campo visivo, ma non ostacolare la dissezione. Assicurarsi che la punta della cannula è sotto il bordo della capsula di Petri.
      NOTA: Per aiutare immobilizzare il cuore durante la dissezione, posizionare un piccolo (~ 5 - 7 cm 2) quadrato di 215 micron di maglia nella capsula di Petri. Quando il cuore è posto su questa rete, creerà attrito per ridurre scorrimento e rotazione del cuore durante manipolazione meccanica.
    7. Tie 2 punti di sutura con sciolti nodo semplice doppio intorno al fulcro della cannula da utilizzare per il fissaggio della aorta.
  2. Cuore Estrazione e Incannulamento
    1. Somministrare eparina (5 UI / g di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale. Attendere 20 minuti per permettere l'eparina di circolare al cuore.
    2. Anestetizzare il mouse per iniettare intraperitonealeione del 20% carbammato di etile (2 mg etil carbammato / g di peso corporeo). Osservare da vicino fino a quando il mouse è sotto anestesia profonda (circa 3 - 5 minuti).
      NOTA: l'anestesia profonda è confermata da una mancanza di entrambi pizzico punta e riflessi corneali. Se il mouse non ha raggiunto l'anestesia profonda da 8 - 10 min, quindi somministrare una dose aggiuntiva di carbammato di etile. Anche se le risposte individuali all'anestesia varieranno tra i topi, il fallimento di entrare in profondità dell'anestesia alla prima somministrazione può indicare carbammato di etile degradato, che può precludere l'anestesia profondi anche dopo somministrazioni ripetute. Per evitare il degrado, preparare una soluzione fresca di carbammato di etile prima di ogni utilizzo.
    3. Immobilizzare il mouse per la piattaforma di chirurgia, garantendo ogni arto con del nastro adesivo chirurgico. Disinfettare la zona incisione con una quantità generosa di 70% di etanolo. Pat asciugare con un laboratorio-wipe.
    4. Sollevare la pelle con una pinza di tessuto appena sotto lo sterno. Effettuare una incisione laterale con piccole forbici, tagliando through la pelle e l'addome.
    5. Utilizzare hemostats per sollevare delicatamente la gabbia toracica tramite lo sterno. Utilizzando piccole forbici dissezione, estendere l'incisione in una forma a V verso l'ascelle. Tagliare prima nervatura e perforare la membrana su ogni lato.
    6. Continuare a sollevare la cassa toracica con hemostats e utilizzare piccole forbici iris al transetto completamente il diaframma. Fare attenzione a non forare il cuore.
    7. Ritrarre la gabbia toracica rostralmente utilizzando emostatiche annessi e rapidamente, ma si estendono attentamente l'incisione a forma di V, tagliando attraverso la gabbia toracica verso il ascelle su entrambi i lati. Ritrarre la sezione centrale della cassa toracica completamente e fissare le pinze emostatiche collegati a tenere in posizione.
    8. Rimuovere il pericardio utilizzando una pinza sottile.
    9. Mentre delicatamente sollevare il cuore con pinze curve, transetto le vene e le arterie collegate al cuore. Subito posizionare cuore in tampone perfusione ghiacciata per rallentare la contrazione muscolare.
    10. Mettere il cuore in una capsula di Petri sottoun microscopio dissezione (posto su un piccolo pezzo di 215 micron di maglia per aiutare immobilizzare durante la dissezione). Trim qualsiasi tessuto non-cardiaca in eccesso con iris belle forbici. Fare attenzione durante il taglio in prossimità dell'aorta.
    11. Transetto l'aorta vicino l'arteria brachioencephalic, e fare attenzione a non lasciare bolle o frammenti di tessuto entrano l'apertura.
    12. Riempire la capsula di Petri contenente cuore con tampone di ghiaccio freddo perfusione tale che il livello del liquido sale sopra l'apertura della cannula. Guaina l'aorta sulla cannula tale che la punta è appena distale alla valvola aortica.
      TIP: Per ridurre il rischio di embolia di aria, leggermente deprimere la siringa sulla cannula prima cannulazione per rimuovere le bolle d'aria potenziali che possono essere sviluppati alla fine della cannula. Inoltre, mantenere la punta della cannula e l'aorta sotto la superficie della soluzione per evitare l'introduzione di bolle mentre guaina dell'aorta.
    13. Infilare un pre-legato 7-0 seta sutura giùl'albero dell'ago cannulazione e la posizione appena sopra la punta dell'ago. Stringere il nodo con una pinza sottile. Ripetere questa operazione con un secondo di sutura posto appena sopra il primo.
      NOTA: Assicurarsi che la punta dell'ago è ancora sopra la valvola aortica prima e dopo il serraggio.
    14. Premere lentamente la siringa per espellere 0,5 ml di tampone perfusione attraverso il sistema vascolare coronarico.
      NOTA: Se la cannulazione ha avuto successo, il sangue sarà visualizzata lasciando il sistema vascolare coronarica e mettere in comune fuori delle vene dorsali e le arterie.
      IMPORTANTE: Il tempo di apertura della cavità toracica (in particolare, perforando la membrana) a siglare la perfusione deve essere ridotto al minimo per ridurre l'esposizione ipossico e massimizzare la sopravvivenza e la salute dei cardiomiociti isolati. Idealmente, questa volta deve essere inferiore a 5 min.
  3. perfusione
    NOTA: La perfusione retrogradaapparecchiatura può essere convenientemente utilizzato in un ambiente pulito su un banco di laboratorio standard o collocato in una cappa a flusso laminare per massimizzare la sterilità. Tuttavia, dopo perfusione è completa, il lavoro deve essere eseguito sotto flusso laminare per minimizzare la contaminazione.
    1. Delicatamente ma con fermezza rimuovere l'hub della cannula dalla siringa (usando guanti sterili) ruotando lentamente avanti e indietro. Tirando l'ago cannulazione fuori della siringa, espellere lentamente buffer di perfusione nel mozzo dell'ago per evitare bolle d'aria durante la perfusione.
    2. Rimuovere il tubo di ricircolo pescato da sotto la porta di uscita perfusione e sostituirlo con un bicchiere cattura dei rifiuti. Fissare il mozzo ago all'adattatore luer che viene fissato alla porta di uscita di perfusione (figure 1, 2) sulla camicia d'acqua, mentre la pompa è in esecuzione al livello più basso (15 giri, ~ 6 ml / min).
      SUGGERIMENTO: Quando si collega l'hub ago all'adattatore luer, permettono il buffer di perfusione stillicidio di ConNECT al liquido nel mozzo dell'ago per evitare di introdurre bolle.
    3. Profumato cuore senza ricircolo fino a 8 ml di tampone perfusione sono stati aspirati dal tubo di alimentazione.
      NOTA: Il volume di tampone perfusione aspirata dal tubo di alimentazione in questa fase assume un volume morto di 7 ml per il sistema di perfusione, per un totale di 15 ml di tampone perfusione pompato attraverso il cuore.
    4. Rimuovere il tubo di ingresso dal buffer di perfusione. aria Lasciare essere aspirata dal ingresso per meno del volume morto del sistema.
      NOTA: Il volume di aria aspirata in questa fase deve essere regolata per evitare che l'aria entri nel sistema vascolare coronarico (vedere il punto 1.3.7).
    5. Posizionare il tubo di ingresso nel buffer di digestione (Tabella 1), appena sopra il fondo della provetta. Alimentano lentamente e permettere al tubo di ingresso per aspirare un volume sufficiente per evitare di riempire eccessivamente il tubo.
    6. Visualizzare e seguire la bolla d'aria tra ilil buffer di perfusione e il buffer di digestione mentre viaggia attraverso la camicia di calore. Osservare il livello di tampone di perfusione nel centro della giacca di calore iniziano a cadere una volta che la bolla d'aria raggiunge la camera de-gorgogliamento. Quando il buffer di digestione raggiunge la camera de-gorgogliare, il livello del liquido nel rivestimento termico rimane costante.
      IMPORTANTE: Se il livello di buffer di perfusione scende troppo, chiudere il rubinetto di uscita e aprire il rubinetto di sfiato. Lasciare che il livello a salire ad un livello confortevole (3 - 5 pollici sopra la porta di uscita). Poi, fermare la pompa di perfusione e chiudere il rubinetto di sfiato. Aprire il rubinetto porta di uscita e riavviare la pompa di perfusione.
    7. Vedere la soluzione che emerge dal cuore. Come ultimo del buffer di perfusione lascia il cuore e il buffer di digestione inizia circola attraverso il cuore, cambiamento di colore da chiaro a marrone chiaro sarà osservato per la presenza di collagenasi.
    8. Profumato cuore con il tampone di digestionecirca il 10 - 15 min. Il cuore inizierà dinoccolato come il collagene è degradato e perde il supporto meccanico.
  4. La dissociazione meccanica e purificazione
    1. Rimuovere il cuore dalla cannula con una pinza e posto in una capsula di Petri a secco. tagliare rapidamente il tessuto extra-ventricolare con iris belle forbici. Trasferire i ventricoli di un piatto contenente tampone fresco petri perfusione da lavare. Spostare la capsula di Petri ad una cappa sterile e trasferire i ventricoli per un fresco, capsula di Petri a secco.
    2. Raccogliere 7,5 ml di tampone di digestione dalla giacca fuoco e aggiungere 2,8 ml di 1 M CaCl 2, mescolare per inversione. Aggiungere 2 - 3 ml di tampone di digestione con CaCl 2 ai ventricoli nella capsula di Petri.
      NOTA: La concentrazione di Ca 2+ è sollevata da 300 a 700 micron
    3. Triturare rapidamente il tessuto ventricolare con pinza sottile, in modo che la maggior parte pezzi sono inferiori a 1 mm 3. Aggiungere la rimangonoing buffer di digestione Ca 2+ integrato dal punto 1.3.2 ai ventricoli dissociate nella capsula di Petri e mescolare delicatamente agitazione.
    4. Collocare la capsula di Petri in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. Agitare la capsula di Petri ogni 2 minuti fino a quando cardiomiociti sufficienti (vedi nota sotto) sono stati rilasciati dal tessuto.
      NOTA: la lunghezza di incubazione può essere necessario regolare per calibrare il grado di digestione secondo le esigenze dell'esperimento. In generale, tempi di incubazione più lunghi aumentare la resa e la purezza, ma può ridurre il tasso di adesione cellulare e la sopravvivenza. 5 - 10 min è generalmente sufficiente per ottenere un alto rendimento (~ 5 - 10 x 10 5 cellule per cuore).
    5. Trasferire la capsula di Petri di nuovo ad una cappa a flusso laminare. Usando una pipetta di trasferimento tagliato a un angolo di 45 °, delicatamente pipetta il tessuto a dissociarsi ulteriormente.
    6. Utilizzare guanti sterili per piegare la maglia 215 micron in un cono e rinviare un conica da 50 ml. Pipettala sospensione tessuto dissociato sulla maglia e consentire il filtrato affluisca nella conica 50 ml. Utilizzare 7,5 ml di tampone di arresto pre-riscaldato (Tabella 1) per lavare i cardiomiociti dalla capsula di Petri attraverso le maglie, combinandosi con il primo filtrato.
      NOTA: Ca 2+ è portata alla finale 1.1 mM e la finale FBS 2,5% nel buffer fermata neutralizza l'attività della proteasi.
    7. Trasferire la sospensione cellulare ad una conica 15 ml e lasciar riposare per gravità per 15 min.
    8. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento in modo che solo 50 - 100 ml di soluzione rimane al di sopra delle celle. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato (Tabella 1) e mescolare delicatamente per inversione. Lasciare le cardiomiociti di stabilirsi per gravità per 15 min.
      SUGGERIMENTO: Per aumentare la purezza, ripetere il punto 1.4.8 come desiderato.
    9. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento tale che solo 50 - 100 ml osoluzione f resterà sulle cellule.

2. Cultura Cardiomyocyte

  1. Pre-coat tessuto cultura trattati piastre di Petri con laminina (10 mg / ml) e conservare a 37 ° C per 2 ore prima di placcatura cellule. Appena prima di placcatura, aspirare la soluzione laminina dalla piastra di coltura tissutale. Lavare una volta con MEM o PBS, quindi aspirare il liquido residuo per rimuovere laminina non assorbito.
  2. Aggiungere abbastanza pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato per ottenere la densità cellulare desiderato, mescolare delicatamente per inversione. Piatto desiderata concentrazione di cellule nel recipiente di coltura (tipicamente 5 - 20 x 10 4 cellule / cm 2). Per valutare la resa di isolamento cardiomiociti, contare le cellule tramite emocitometro o test-plate controllando la densità al microscopio. Un cuore di topo adulto fornisce tipicamente 0,5 - 1,0 x 10 6 cellule in questa fase del protocollo.
    SUGGERIMENTO: Se si utilizza piastre a 96 pozzetti, utilizzare un micropip 1.000 mlette con una punta tagliata ad un angolo di 45 ° per ridurre al minimo i danni delle cellule a causa della forza di taglio. Posizionare la punta della pipetta tale che tocchi il fondo del pozzo durante l'espulsione di sospensione cellulare in modo da minimizzare l'introduzione di bolle.
  3. Spostare il piatto di coltura cellulare prontamente a un 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 e il 95% di umidità. Cambiare media come necessario per impedire l'acidificazione: ogni 1 - 5 giorni a seconda della densità cellulare. Minimizzare la manipolazione del piatto cultura durante i primi 3 - 6 giorni per facilitare il fissaggio su una superficie di coltura cellulare.
    NOTA: Per ridurre al minimo disturbo delle cellule durante i cambiamenti dei media quando le cellule non hanno pienamente attaccato, effettuare un cambio semi-media. Lentamente aspirare il supporto mantenendo la punta della pipetta appena sotto la superficie del supporto. Quindi aggiungere lentamente ulteriore supporto, mantenendo la punta della pipetta appena sopra la superficie del supporto contro la parete del piatto cultura.
  4. Per valutare la fattibilità di cardiomiociti, controllarela morfologia al microscopio campo chiaro. Appena cardiomiociti isolati mantengono una morfologia più o meno a forma di asta con taglienti, bordi distinti sotto illuminazione campo chiaro (Figura 2).
    NOTA: Confermare la vitalità colorando le cellule con trypan blu.
  5. Per valutare la purezza del isolamento cardiomiociti, controllare la morfologia delle cellule per identificare i cardiomiociti. Colorare i nuclei con Hoescht 33342 per identificare le cellule totali.
    NOTA: cardiomiociti possono essere identificati dai non cardiomiociti dalla loro morfologia caratteristica (rod-shaped) e dimensione (circa 100 - 200 micron di lunghezza). In alternativa, cardiomiociti isolati appena si macchia positivo per i marcatori specifici cardiomiociti, come alfa-actinina 26 (Figura 3C, D) o troponina cardiaca T. 27

3. trasduzione genica con Adenovirus

  1. Preparare adenovirus lisato cellulare utilizzando stabilito metodi. 21 trasdurre i cardiomiociti utilizzando lisato cellulare da cellule produttrici adenovirus 10. Il giorno 0 o 1 giorno dopo l'isolamento, aggiungere con cautela il lisato cellulare ai media che contiene i cardiomiociti.
    NOTA: Una preparazione adenovirus alto titolo raggiungerà forte espressione in circa 48-72 ore. Regolare la molteplicità di infezione per soddisfare il disegno sperimentale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Un tipo adulto selvaggio ICR (CD1) cuore del mouse produce tipicamente 500.000 a 1 milione di cardiomiociti da un isolamento di successo. Subito dopo l'isolamento, le cellule mantengono un aspetto prevalentemente a forma di asta (Figura 3A) con sarcomeri intatti e possono essere utilizzati per studi funzionali coinvolgono cardiomiociti contrattilità. Una percentuale elevata di cardiomiociti astiformi (superiori al 90%) è indice di perfusione efficace e la digestione. Cardiomiociti vitali saranno grandi (~ 100-200 micron di lunghezza) e sembrano avere una membrana esterna tagliente sotto illuminazione campo chiaro (Figura 3A). Immunocolorazione per i marcatori sarcomerici specifici cardiomiociti, come alfa-actinina, si tradurrà in un modello distinto bande sarcomerica (Figura 3C). In concomitanza con l'analisi morfologica e colorazione nucleare con DAPI, immunostaining può essere utilizzato per valutare la purezza dei cardiomiociti isolati. FIBRoblast sarà piccola e rotonda subito dopo l'isolamento, ma sarà subito attaccare e diffondersi sottile su plastica coltura cellulare, consentendo in tal modo distinzione facile da cardiomiociti.

Una bassa percentuale di cardiomiociti astiformi è un'indicazione di un isolamento senza successo. Ciò può derivare da una mancata cannulate rapidamente l'aorta dopo che il cuore viene estratto dall'animale. perfusione inefficiente, a causa di embolia gassosa o incannulamento errato, per esempio, può anche avere un impatto la morfologia e la vitalità delle cardiomiociti.

Dopo diversi giorni di cultura, i cardiomiociti assumono una morfologia arrotondata (Figura 3B). All'interno di 1 - 2 settimane cardiomiociti dal vivo attaccano al substrato e cominciano diffusione (Figura 3D, E). Le cellule morte possono essere identificati mediante l'inclusione trypan blue. Un isolamento e la coltura di successo produrrà circa il 50% cardio dal vivomiociti dopo 1 settimana. Contaminazione da non cardiomiociti, come i fibroblasti si tradurrà in una elevata percentuale di queste cellule in coltura successivi a causa della loro potenziale proliferativo. Ciò può essere evitato aumentando il numero di sedimentazioni gravità e / o tramite pre-placcatura per aumentare la purezza. 28

Trasduzione con adenovirus può essere utilizzato per ottenere una forte espressione genica in 48 - 72 ore (Figura 3E). Adenovirus sierotipo 5 è efficiente in trasduzione cardiomiociti di topo adulto in vitro a causa della elevata espressione del recettore coxackie-adenovirus, ma può dipendere dal tipo di supporto utilizzato. 20

Figura 1
Figura 1. Cardiomyocyte Isolamento attrezzature e strumentazioni. (A) Gli strumenti chirurgici usati per estrarre il mousecuore e cannulate l'aorta, da cima a fondo: hemostats, pinze dei tessuti, pinze curve, Dumont # 5 pinza sottile, piccole forbici dissezione, iris belle forbici, forbici spremere fini (b) Il sistema di perfusione Langendorff utilizzata per digerire il cuore del mouse. . buffer perfusione vengono aspirati attraverso il tubo di ingresso (1) dalla pompa di perfusione (2) e attraverso il tubo di uscita della pompa (3) nella porta di ingresso sulla camicia di acqua riscaldata (4). I buffer di perfusione sono riscaldati dal rivestimento acqua riscaldata mentre viaggiano attraverso il tubo di vetro a spirale, la camera debubbling, e poi esce l'ago incannulazione collegata alla porta di uscita di perfusione (5), che è collegata da un rubinetto. Il tubo conico sotto cattura i buffer di perfusione, che sono ri-fatta circolare attraverso il tubo di ingresso. La presa di pressione (6), porta compliance (7) e di sfiato (8) rimane chiuso durante la perfusione per mantenere una portata costante. La camicia d'acqua è riscaldata da un bagno di acqua circolante che entra attraverso thingresso e rivestimento (9) e (10) porte di uscita. Uno stand anello è utilizzato per contenere la giacca riscaldato l'acqua in posizione verticale (pinze rosse, base nera sotto il rack tubo conico viola). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Schema Panoramica del sistema di perfusione. Parti importanti del Apparato perfusione sono etichettati di cui al manoscritto. La direzione del flusso di tampone perfusione è indicato da frecce. Si noti il posizionamento della cannula aortica, la cui punta dovrebbe essere visibile attraverso l'aorta traslucido, assicurando è collocato al di sopra della valvola aortica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 3. Isolamento adulti mouse cardiomiociti. Cardiomiociti sono stati isolati e seminate su laminina-Coated 96 pozzetti, come descritto nel protocollo Qui. (A) cardiomiociti isolati di fresco, senza semi a circa 8.000 cellule / cm 2. Si noti che appena isolate, cardiomiociti vitali appaiono circa asta sagomati con spigoli vivi (freccia bianca). Tuttavia, cardiomiociti che sembrano avere una membrana esterna diffusa in campo chiaro sono morti. Durante i primi giorni di cultura, i cardiomiociti assumono una forma arrotondata (B). (C) immunocolorazione per alfa-actinina (verde) rivela caratteristiche bande sarcomerica in cardiomiociti in d1 post-isolamento. macchia nucleare (DAPI) mostrato in blu. Top spettacoli ingrandite immagine della regione delineato nell'immagine in basso. (D) (E) Brightfield e immagini epifluorescente mostrano cardiomiociti al giorno 11 post-isolamento trasdotte con adenovirus che trasporta un reporter GFP sotto il controllo di un promotore CMV ( un dono di Robert Gerard presso UT Southwestern). Le cellule sono state seminate a circa 18.000 cellule / cm 2 e sono state trasdotte il giorno 0 con una molteplicità di infezione di circa 800 unità formanti placca (PFU) per cellula. Barre di scala:. 50 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Buffer di isolamento cardiomiociti (CIB)
Aggiungere 900 ml di acqua ultrapura in un becher pulito sotto magagitazione magnetica.
Aggiungere i componenti del tampone nella tabella come indicato.
Componente MW Finale Conc (mm) 1X (g / l)
NaCl 58,44 120 7,013
KCl 74.55 5.4 0,403
Na 2 O 2 HPO4.7H 268,07 0,33 0,088
MgSO 4 .7H 2 O 246,48 0.5 0.123
Taurina 125.1 30 3.753
BDM 101.1 10 1.011
HEPES 238,3 25 5.958
Glucosio 180.16 22 3.964
Regolare il pH ingegnoh 5 M NaOH.
Regolare il volume di 1 litro con acqua ultrapura.
Filtro sterile w / 0,22 micron filtro a depressione.
Aggiungere 0,5 ml di 0,1 U / ml di insulina per litro di tampone isolamento cardiomiociti.
buffer di perfusione
Componente Finale Volume (ml)
CIB - 200
EGTA (0.4M) 0,4 mm 0.2
Totale - 200
buffer di digestione
Componente Finale Quantità
CIB - 15 ml
CaCl2 (1M) 300micron 4,5 ml
proteasi XIV 0,2 mg / ml 3 mg
collagenasi II 2,4 mg / ml 36 mg
Totale - 15 ml
buffer di stop
Componente Finale Volume (ml)
buffer di perfusione 95% 14.25
CaCl2 (1M) 1.5 mM 22.5
FBS 5% 0.75
Totale - 15 ml
Strumenti della cultura
Componente Finale % Volume (ml)
mezzi MEM 90% 90
FBS 10% 10
Primocin 0,2% 0.2
Totale 100% 100 ml
Consentire terreni di coltura equilibrare a 37 ° C, 5% di anidride carbonica.

Tabella 1: Soluzioni e tamponi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La salute generale dei cardiomiociti isolati dipende da diversi aspetti importanti di questo protocollo. In primo luogo, il tempo dall'estrazione cuore a perfusione è critica e deve essere eseguita in 5 minuti o meno. La rimozione di calcio aiuta a dissociarsi interazioni cellula-cellula, ma può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule a lungo termine. 29-32 Così, troviamo sufficiente per rimuovere il calcio durante i primi pochi minuti di perfusione di EGTA (acido tetraacetico glicole etilenico) chelazione, 22 ma rapidamente ripristino di calcio durante la digestione e fasi successive.

L'uso di proteasi XIV migliora notevolmente l'efficienza digestione rispetto alla collagenasi sola. Questo riduce incoerenza causa collagenasi variabilità batch, 18,24 e aumenta la purezza dei cardiomiociti, facilitando la separazione durante sedimentazione per gravità. Tuttavia, un eccesso di digestione impedisce l'attaccamento efficiente al substrato della cultura, così un equilibrio I multas necessario per ottimizzare il rendimento delle cellule e la purezza, pur mantenendo l'adesione cellulare e la vitalità. Così, la concentrazione di proteasi e la lunghezza di digestione può essere modificata per adattarsi obiettivi sperimentali. In generale, un minor grado di digestione migliorerà l'attaccamento e la sopravvivenza dei cardiomiociti. L'uso di tripsina è stata segnalata in alcuni protocolli di isolamento dei cardiomiociti. 18 Tuttavia, l'aggiunta di tripsina al cocktail proteasi usato qui (collagenasi e proteasi XIV) riduce la redditività a lungo termine dei cardiomiociti in coltura, forse a causa di un eccesso di digestione o di scissione di superfici essenziali e / o proteine ​​della matrice extracellulare.

L'inclusione di butanedione monoxime (BDM) durante l'isolamento inibisce la contrazione muscolare cardiaca, e riduce quindi conseguenze negative a causa di contrattura terminale, dispendio energetico, e il paradosso del calcio. 29,33 Tuttavia, nella nostra esperienza, la rimozione di BDM prima cultura accelera dedifferentiation e permette alle cellule di adattarsi alla cultura in due dimensioni.

E 'importante notare che gli adattamenti a lungo termine per la cultura 2-D può influenzare gli aspetti funzionali dei cardiomiociti, come la contrattilità. Così, gli esperimenti contrattilità e di elettrofisiologia devono essere eseguite subito dopo l'isolamento, quando l'organizzazione sarcomerica nativa è ancora intatta. Inoltre, come con qualsiasi esperimento in vitro, le cellule in coltura sono privi di certe influenze estrinseche presenti in vivo, come segnalazione umorale o immune. D'altra parte, co-culture definiti possono essere implementate per studiare le interazioni tra cardiomiociti e altri tipi di cellule. 5,34 Inoltre, la coltura in vitro possono essere utilizzati per studiare il comportamento cardiomiociti con segnali molecolari definiti nei terreni di coltura. Così, gli obiettivi generali della sperimentazione devono essere attentamente valutati e pesati contro i limiti e vantaggi di questo sistema di coltura.

35 Va osservato che FBS e altri sieri di derivazione animale contengono componenti sconosciute che possono influenzare fisiologia cellulare . 36,37 Nonostante la presenza molto apprezzato dei fattori di crescita in FBS, 38 le culture cardiomiociti qui presentate non proliferano. Piuttosto, il blocco del ciclo cellulare sembra essere una proprietà persistente cardiomiociti di topo adulto ex vivo, mantenuto dalla loro uscita ciclo cellulare durante il periodo perinatale dello sviluppo. 12,39 Questo è di grande interesse nel campo della medicina rigenerativa cardiaca, dove reversione dei cardiomiociti mammiferi adulti ad un fenotipo proliferativo è stato un obiettivo fortemente perseguito. 3,26,40-42 in particolare, è attualmente chiaro quale dedifferentiation laurea è richiesta per cardiomiociti di ri-entrare nel ciclo cellulare, ma il Apporton di dedifferentiation alla rigenerazione nei vertebrati inferiori è ben supportato 43,44,10,11 Inoltre, de-differenziazione è sempre più osservata nella proliferazione dei cardiomiociti e la rigenerazione cardiaca in sistemi di mammiferi, almeno a livello funzionale, tra cui lo smontaggio miofibrillare 6,12,9 Pertanto, lo stato di differenziazione dei cardiomiociti in coltura deve essere attentamente valutata e modulato secondo le esigenze degli obiettivi di ricerca. Come tale, le condizioni di coltura possono potenzialmente essere ulteriormente modificati per ridurre la concentrazione sierica, usare sostituti del siero definiti o mezzi privi di siero. Ad esempio, per adulti cardiomiociti di ratto espositrici sarcomeri organizzate sono state coltivate a lungo termine senza siero, ma fattori di crescita come il fattore di crescita dei fibroblasti, fattore di crescita epidermico, e triiodotironina sono stati utilizzati in supporto definito. 45 È concepibile che le formulazioni di mezzi simili, o potenzialmente altri formulazioni, come quelli adattato da Differentiprotocolli ation, 46 possono essere utilizzati per mantenere ben differenziati cardiomiociti adulti mouse in cultura che mostrano strutture sarcomeric altamente organizzati. Formulazioni alternative possono anche essere sviluppate per raggiungere altri fenotipi (come cardiomiociti altamente de dissociati) 6 a seconda delle esigenze dell'esperimento, ma saranno necessari ulteriori lavori.

Il ruolo dei fibroblasti è stato implicato nel controllo della neonatale del mouse cardiomiociti ciclo cellulare 5 e topo adulto cardiomiociti differenziazione (attraverso ipertrofica segnalazione IL6) in coltura a lungo termine. 19 Di conseguenza, la crescita dei fibroblasti in coltura deve essere contabilizzata in interpretazioni sperimentali . La crescita dei fibroblasti in coltura può essere controllata mediante aggiunta di crescita limitare composti come citosina arabinoside 19 (AraC) o attraverso passaggi pre-placcatura. 28 Tuttavia, AraC sarà anche inibire la crescita dei cardiomiociti, in modo alternativometodi dovrebbero essere utilizzati per controllare la crescita dei fibroblasti in studi riguardanti il ​​ciclo cellulare cardiomiociti. Nel protocollo qui descritto, la purezza dei cardiomiociti iniziale può essere migliorata ripetendo il passo la gravità di sedimentazione (vedi 1.4.8).

I metodi qui forniscono un sistema in vitro che possono essere utilizzati per studiare la natura di mammiferi adulti blocco del ciclo cellulare cardiomiociti. A differenza di cellule primarie di altri organismi, come ratto o cavia, cardiomiociti di topo primari offrono una vasta gamma di potenti e ben caratterizzati strumenti genetici, come il lignaggio Cre-based tracciamento modelli knock-in, 47 che possono essere utilizzati in modo semplice identificare le cellule derivate da cardiomiociti preesistenti. 12,48 Inoltre, adulto primaria cardiomiociti murini sono stati sottoposti alle condizioni native sviluppo che risultano in blocco del ciclo cellulare, a differenza di linee cellulari e ES differenziate o cellule IPSC 46 che, nonostante la loro convenience e adattabilità alle grandi schermi di droga, 2 possono avere un'utilità limitata in esperimenti di sondare la natura di uscita del ciclo cellula adulta cardiomiociti.

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per isolare e cultura cardiomiociti adulti mouse. Diversi metodi hanno già dimostrato l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto per lo studio a breve termine, ma fino ad oggi, pochi rapporti esistere della cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti mouse. 18,19 La capacità di mantenere cardiomiociti di topo adulto nella cultura dovrebbe consentire lo studio in vitro della biologia cardiomiociti in condizioni sperimentali che richiedono esame a lungo termine. Ad esempio, l'espressione genica può essere manipolato utilizzando vettori di adenovirus, che richiedono in genere un paio di giorni per raggiungere la piena espressione. Le successive modifiche fenotipiche e analisi possono richiedere periodi di tempo più lunghi a seconda degli obiettivi sperimentali. I metodi qui presentati consentono la cultura del cardiom di topo adultoyocytes per diverse settimane. Ciò dovrebbe fornire un potente sistema per la ricerca di domande prudenti in biologia cardiomiociti, quali quelli relativi alla regolazione del ciclo cellulare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Questo progetto è stato finanziato dal Programma UCSF per Breakthrough Ricerca Biomedica (finanziato in parte dalla Fondazione Sandler), il NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), e la Fondazione Edward Mallinckrodt Jr.. JJ è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal NIH (T32HL007731). Gli autori sono gli unici responsabili del contenuto di questo lavoro, che non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Heated water jacket Radnoti 158831
Circulating heated water bath, Isotemp Fisher Scientific 3013
Laboratory pump Watson-Marlow 323
Hemostats Exelta 63042-090
Tissue forceps VWR 470128034
Dumont #7 curved forceps FST 91197-00
Dumont #5 fine forceps FST 11251-20
Small dissection scissors VWR 470128034
Extra fine bonn scissors FST 14084-08
Fine spring scissors FST 91500-09
Name Company Catalog Number Comments
Materials
NaCl Sigma S9888
KCl Sigma P9541
Na2HPO4.7H2O Fisher S25837
MgSO4.7H2O Fisher S25414
Taurine Sigma 86329
Butane dione monoxime (BDM) Sigma B0753
HEPES Fisher  BP310100
Glucose Sigma G-7021
Insulin Novo Nordisk 393153
EGTA Amresco 0732-288
Protease, type XIV Sigma P5147
Collagenase II Worthington LS004176
MEM Corning 15-010-CV
FBS, heat inactivated JRS 43613
Primocin Invitrogen NC9141851
Ethyl Carbamate Alfa Aesar AAA44804-18
215 micron mesh Component supply U-CMN-215-A
20 G blunt ended needle Becton Dickinson 305183
20 G beveled needle Becton Dickinson 305176
Lab tape VWR 89097-990
Surgical tape 3M 1527-0
Silk suture, 7-0 Teleflex 15B051000
Mouse anti-alpha-actinin antibody Sigma A7811
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody Thermo Fisher A21121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  2. Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
  3. Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497, (7448), 249-253 (2013).
  4. Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20, (1), 104-112 (2015).
  5. Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, (2), 233-244 (2009).
  6. Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5, (9), e12559 (2010).
  7. Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19, (10), 1175-1187 (2005).
  8. Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
  9. Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117, (Pt 15), 3295-3306 (2004).
  10. Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464, (7288), 601-605 (2010).
  11. Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464, (7288), 606-609 (2010).
  12. Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331, (6020), 1078-1080 (2011).
  13. Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140, (23), 4683-4690 (2013).
  14. Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116, (1), 35-45 (2015).
  15. Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
  16. Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
  17. Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279, (1), H429-H436 (2000).
  18. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80, (3), 132-134 (1993).
  19. Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202, (3), 891-899 (2005).
  20. Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5, (9), 765-772 (2003).
  21. Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2, (5), 1236-1247 (2007).
  22. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57, (6), 327-335 (2007).
  23. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
  24. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271, (3), H1250-H1255 (1996).
  25. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61, (1), 93-101 (2011).
  26. Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286, (10), 8644-8654 (2011).
  27. Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267, (13), 9269-9274 (1992).
  28. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
  29. Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61, (4), 560-569 (1987).
  30. Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14, (7), 397-412 (1982).
  31. Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97, (2), 411-432 (1979).
  32. Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45, (1), 123-127 (2000).
  33. Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105, (4), 638-643 (1989).
  34. Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5, (6), 150038 (2015).
  35. Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101, (6), 660-667 (2000).
  36. Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18, (8), 1509-1518 (2014).
  37. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128, (1), 376-382 (1985).
  38. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22, (5), 1294-1300 (2006).
  39. Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
  40. Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103, (42), 15546-15551 (2006).
  41. Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7, (279), 279ra38 (2015).
  42. Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99, (11), 2644-2654 (1997).
  43. Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365, (2), 339-349 (2012).
  44. Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10, (2), e0116068 (2015).
  45. Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26, (5), 464-470 (1990).
  46. Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89, (1), 20-25 (2001).
  48. Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, (8), 970-974 (2007).
Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).More

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter