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Biology

अलगाव, संस्कृति और वयस्क माउस cardiomyocytes के पारगमन

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Abstract

संवर्धित cardiomyocytes तकनीक है कि इन विवो प्रणालियों के पूरक हैं का उपयोग कर cardiomyocyte जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पवित्रता और इन विट्रो संस्कृति की पहुंच जैव रासायनिक विश्लेषण, लाइव इमेजिंग, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर ठीक नियंत्रण सक्षम बनाता है। cardiomyocytes के लंबे समय तक संस्कृति अतिरिक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि अल्पावधि संस्कृतियों में पूरा नहीं किया जा सकता है प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, dedifferentiation, कोशिका चक्र पुनः प्रवेश, और कोशिका विभाजन की इन विट्रो जांच इस प्रकार अब तक काफी हद तक चूहे cardiomyocytes है, जो लंबे समय तक संस्कृति में अधिक मजबूत होना प्रकट करने के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। हालांकि, ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और अच्छी तरह से विकसित रोग मॉडल की एक समृद्ध toolset की उपलब्धता माउस सिस्टम हृदय अनुसंधान के लिए आकर्षक बनाते हैं। हालांकि कई रिपोर्टों वयस्क माउस cardiomyocyte अलगाव के मौजूद हैं, कुछ अध्ययनों से उनके दीर्घकालिक संस्कृति प्रदर्शित करता है। यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि हैवयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव और लंबी अवधि संस्कृति। सबसे पहले, प्रतिगामी Langendorff छिड़काव कुशलता proteases के साथ दिल, गुरुत्वाकर्षण अवसादन शुद्धि के बाद पचाने के लिए प्रयोग किया जाता है। dedifferentiation निम्नलिखित अलगाव की अवधि के बाद, कोशिकाओं को धीरे-धीरे संस्कृति को देते हैं और सप्ताह के लिए संवर्धित किया जा सकता है। Adenovirus सेल lysate कुशलता से अलग cardiomyocytes transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन विधियों हृदय जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं।

Introduction

संवर्धित cardiomyocytes अक्सर इन विट्रो में एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में सेल व्यवहार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। उदाहरण के लिए, रूपात्मक बिजली, जैव रासायनिक, यांत्रिक या सेल गुण इंजीनियर substrates पर अध्ययन किया जा सकता है, परिभाषित मीडिया में 1,2, और छोटे अणु दवाओं, पेप्टाइड्स, जीन विनियमन, 3 या बिजली की उत्तेजना के जवाब में। 4 सेलुलर सामग्री सकते हैं यह भी परिभाषित सह संस्कृतियों का उपयोग कर नियंत्रित किया जाए। 5 ये इन विट्रो प्रयोगों बड़ी दवा या आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोगी होते हैं और cardiomyocyte जीव विज्ञान से जुड़े जांच के विभिन्न प्रकारों के लिए विवो तरीकों में पूरक हैं।

लंबे समय तक संस्कृति प्रयोगात्मक रास्ते है कि बढ़ाया समय की अवधि की आवश्यकता होती है प्ररूपी परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है। एक समय पर उदाहरण वयस्क स्तनधारी cardiomyocyte प्रसार, जहां dedifferentiation, कोशिका चक्र पुनः प्रवेश, और कोशिका विभाजन आम तौर पर खत्म अध्ययन किया है एसई का हैसप्ताह के दिनों veral। 6,7 इधर, बढ़ाया संस्कृति समय आनुवंशिक हेरफेर, 7,8 कार्यात्मक dedifferentiation (जैसे, sarcomeric disassembly) 9 और संभावित ट्रांसक्रिप्शनल dedifferentiation की सुविधा। 6 इसके बाद सेल चक्र पुनः प्रवेश और कोशिका विभाजन भी अब संस्कृति अवधि की आवश्यकता है निरीक्षण करने के लिए, खासकर अगर विभाजन के कई दौर प्रयोगात्मक लक्ष्य कर रहे हैं। Cardiomyocyte सेल चक्र के महत्व को इस प्रकार हृदय उत्थान, जहां dedifferentiation और पूर्व मौजूदा cardiomyocytes के प्रसार zebrafish और नवजात चूहों में दिल के उत्थान के लिए जिम्मेदार दिखाया गया है में हाल ही में कई प्रमुख वैज्ञानिक कार्यों के लिए केंद्रीय है। 10-12, संभावना स्तनधारी वयस्क cardiomyocytes में dedifferentiation और सेल चक्र पुनः प्रवेश प्रोत्साहित करने के लिए मानव हृदय उत्थान 13-15 में एक महत्वपूर्ण सवाल बना हुआ है

मैं n विट्रो प्रयोगों स्तनधारी हृदय के सेल चक्र का अध्ययनmyocytes मुख्य रूप से माउस मॉडल की तुलना में लंबे समय तक संस्कृति की उनके रिश्तेदार आसानी के कारण चूहे स्रोतों का इस्तेमाल किया है। 16 हालांकि, murine सिस्टम अच्छी तरह से विशेषता ट्रांसजेनिक उपकरण और रोग मॉडल है कि दोनों में इन विट्रो और इन विवो में उपयोगी होते हैं के एक अमीर संसाधन की पेशकश प्रोटोकॉल। उदाहरण के लिए, Cre पर आधारित वंश अनुरेखण विवो में नवजात माउस दिल में मायोकार्डियम regenerating के एक स्रोत के रूप में पूर्व मौजूदा cardiomyocytes की पहचान के लिए सक्षम है। 12 में इन विट्रो वंश का पता लगाया नवजात माउस cardiomyocytes की पढ़ाई stromal के साथ बातचीत की परीक्षा के लिए सक्षम है fibroblasts के साथ सह संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं। 5 हालांकि, इसकी चुनौतियों की वजह से, कुछ रिपोर्टों 17 वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव और लंबी अवधि संस्कृति के लिए मौजूद हैं। 18,19

अकेले अल्पकालिक संस्कृति के लिए व्यवहार्य वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव एक चुनौती भरा काम हो जाता है। इस protocराजभाषा कैसे वयस्क चूहों कि दोनों अल्पकालिक के साथ ही लंबी अवधि की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से व्यवहार्य cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए पर कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग cardiomyocytes कुशलता adenoviral वैक्टर 20,21 और हफ्तों के लिए सुसंस्कृत साथ ट्रांसड्यूस जा सकता है। इन तरीकों में इन विट्रो में cardiomyocyte जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं।

इस के साथ साथ वर्णित विधि पिछले कार्यों Langendorff प्रतिगामी छिड़काव के रूपांतरों का उपयोग करने से कई तत्वों पर आधारित हैं। 18,22 हालांकि कई प्रोटोकॉल अल्पकालिक संस्कृति और अध्ययन, 23-25 ​​के लाभ के लिए वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है इस प्रोटोकॉल संस्कृति करने की क्षमता अलग cardiomyocytes लंबी अवधि है। इस सेलुलर अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति से जुड़े और इस तरह सेलुलर reprogramming रणनीतियों में के रूप में समय की विस्तारित अवधि के, की आवश्यकता होती है प्रक्रियाओं के अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं यहाँ रेखांकित कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति, सैन फ्रांसिस्को द्वारा अनुमोदित किया गया है।

नोट: संक्षेप में, माउस छाती से दिल निकालने के बाद, कोरोनरी प्रतिगामी छिड़काव कुशलता कोलैजिनेज़ और प्रोटीज XIV साथ बाह्य मैट्रिक्स को पचाने के लिए प्रयोग किया जाता है। निलय तो अलग कर रहे हैं, यंत्रवत् अलग और एक एकल कक्ष निलंबन में फ़िल्टर। गुरुत्वाकर्षण अवसादन cardiomyocytes, जो अपने उच्च घनत्व से fibroblasts और endothelial कोशिकाओं की तरह stromal कोशिकाओं से अलग हो रहे हैं अलग करने के लिए किया जाता है। शुद्ध cardiomyocytes laminin लेपित polystyrene पर हफ्तों के लिए सभ्य और adenovirus जीन वैक्टर साथ transduced जा सकता है।

1. cardiomyocyte अलगाव

  1. बफ़र, सर्जिकल स्टेशन और छिड़काव उपकरण तैयार
    1. टैब के अनुसार buffers और मीडिया तैयारLe 1।
    2. नहाने के पानी घूम चालू करें, इनपुट तापमान सेट ऐसी है कि गर्म पानी जैकेट के उत्पादन में 37 सेल्सियस के तापमान तक पहुँचता है।
    3. 70% इथेनॉल के साथ निस्तब्धता द्वारा स्वच्छ छिड़काव प्रणाली। तो बाँझ पानी के कई संस्करणों के साथ निस्तब्धता द्वारा सिस्टम से इथेनॉल के सभी निशान को हटा दें।
    4. छिड़काव बफर (तालिका 1) के साथ छिड़काव सिस्टम लोड। सबसे पहले नाली के पानी की व्यवस्था से है, तो छिड़काव बफर के 2 संस्करणों के साथ फ्लश। फिर छिड़काव बफर ऐसी है कि गर्मी जैकेट के भीतरी स्तंभ छिड़काव बफर से भर जाता है के साथ मृत स्थान को भरने, लेकिन debubbling चैम्बर खाली है।
      सुझाव: सुनिश्चित करें कोई हवाई बुलबुले debubbling चैम्बर नीचे लाइन में मौजूद हैं। अड़ियल बुलबुले को दूर, सभी stopcocks संलग्न हैं और दबाव कुछ सेकंड के लिए लाइन के अंदर निर्माण करने के लिए अनुमति देने के लिए। फिर, कम पानी निकलने की टोंटी को रिहा आउटलेट से जेट करने के लिए उच्च दबाव छिड़काव बफर अनुमति; तेजी से प्रवाह और turbulencई में मदद मिलेगी बुलबुले कि छिड़काव दुकान के पास फंस गए हैं बेदखल।
    5. सुई के साथ एक सिरिंज तैयार महाधमनी केन्युलेशन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। 1 मिलीलीटर छिड़काव बफर के साथ भरा सिरिंज के लिए एक 18 जी कुंद सुई संलग्न। हवा के बुलबुले निकालें और प्रयोगशाला टेप के साथ विदारक miscroscope प्रकाशक के एक हाथ करने के लिए सिरिंज विधानसभा तय कर लो।
      सुझाव: एक beveled सुई से एक कुंद एंडेड सुई बनाने के लिए, तार कटर के साथ सुई शाफ्ट आड़ा काट। फिर एक sanding पत्थर के साथ टिप टिप सान जब तक फ्लैट है।
      ध्यान दें: केन्युलेशन के दौरान सुई से महाधमनी की फिसलन को कम करने के लिए, एक रेजर ब्लेड का उपयोग केन्युलेशन सुई की शाफ्ट मोटा हो जाना। केंद्र और ऊपरी शाफ्ट से सुई सुरक्षित है, तो आगे और पीछे सुई शाफ्ट की लंबी अक्ष को सीधा उस्तरा देखा जबकि घूर्णन तक कई खांचे सुई की नोक शाफ्ट के 1 सेमी के भीतर बनाया गया है। एक नया उस्तरा करने के लिए स्विच जब ब्लेड सुस्त हो जाता है।
    6. जगह एक साफविदारक माइक्रोस्कोप के नीचे पेट्री डिश केन्युलेशन के दौरान दिल को रोकने के लिए। प्रकाशक हाथ ऐसी है कि प्रवेशनी की नोक देखने क्षेत्र के किनारे के पास है स्थिति है, लेकिन विच्छेदन में बाधा डालने नहीं। सुनिश्चित करें प्रवेशनी की नोक पेट्री डिश के रिम के नीचे है।
      नोट: मदद करने के लिए विच्छेदन के दौरान दिल को स्थिर, एक छोटी सी (~ 5 - 7 सेमी 2) जगह पेट्री डिश में 215 माइक्रोन जाल के वर्ग। दिल इस जाल पर रखा जाता है, यह रपट और यांत्रिक हेरफेर के दौरान दिल का घूर्णन को कम करने के घर्षण पैदा करेगा।
    7. प्रवेशनी सुई के हब के आसपास ढीली डबल overhand समुद्री मील महाधमनी के securement के लिए इस्तेमाल किया जा करने के साथ 2 टांके बाँधो।
  2. दिल निष्कर्षण और नलिका
    1. intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से हेपरिन (5 आइयू / जी शरीर के वजन) प्रशासन। हेपरिन दिल को प्रसारित करने की अनुमति देने के लिए 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. intraperitoneal इंजेक्षन द्वारा माउस anesthetize20% एथिल carbamate (2 मिलीग्राम एथिल carbamate / जी शरीर के वजन) के आयन। बारीकी से निरीक्षण करें जब तक माउस गहरी संज्ञाहरण के तहत है (लगभग 3 - 5 मिनट)।
      नोट: गहरी संज्ञाहरण दोनों पैर की अंगुली चुटकी और कार्निया सजगता की कमी से इसकी पुष्टि की है। माउस 8 से गहरी संज्ञाहरण तक पहुँच नहीं है तो - 10 मिनट, तो एथिल carbamate की अतिरिक्त खुराक प्रशासन। हालांकि संज्ञाहरण के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाएं चूहों के बीच अलग अलग होंगे, असफलता अपमानित एथिल carbamate है, जो गहरी संज्ञाहरण छीन सकता है के बाद भी दोहराया खुराक का संकेत हो सकता पहली खुराक पर गहरी संज्ञाहरण प्रवेश करने के लिए। गिरावट को रोकने के लिए, प्रत्येक उपयोग करने से पहले एथिल carbamate के एक ताजा समाधान तैयार है।
    3. सर्जिकल टेप के साथ प्रत्येक अंग प्राप्त करके सर्जरी मंच करने के लिए माउस को स्थिर। 70% इथेनॉल के एक उदार राशि के साथ चीरा क्षेत्र कीटाणुरहित। पैट एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ सूखी।
    4. सिर्फ उरोस्थि के नीचे ऊतक संदंश के साथ त्वचा लिफ्ट। छोटे कैंची के साथ एक पार्श्व चीरा, अपरोक्ष काटनेत्वचा और पेट ऊ।
    5. hemostats का प्रयोग धीरे उरोस्थि के माध्यम से ribcage उठा। छोटे विच्छेदन कैंची का प्रयोग, axillae की ओर एक वी आकार में चीरा विस्तार। पहली पसली के माध्यम से कट और प्रत्येक पक्ष पर डायाफ्राम पंचर।
    6. hemostats के साथ ribcage उठा और छोटे आईरिस कैंची का उपयोग पूरी तरह से डायाफ्राम आड़ा काट करने के लिए आगे बढ़ें। दिल पंचर करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    7. ribcage rostrally जुड़ी hemostats और जल्दी का उपयोग कर वापस लेना लेकिन ध्यान से दोनों पक्षों पर axillae की ओर ribcage के माध्यम से काटने से वि आकार चीरा विस्तार। पूरी तरह से ribcage के मध्यम वर्ग वापस लेना और जगह में पकड़ से जुड़ी hemostats लेट गया।
    8. पेरीकार्डियम ठीक संदंश का उपयोग निकालें।
    9. जबकि धीरे घुमावदार संदंश का उपयोग दिल उठाने, नसों और धमनियों दिल से जुड़ी आड़ा काट। तुरंत ठंडा छिड़काव बफर में दिल की जगह मांसपेशियों के संकुचन को धीमा करने के लिए।
    10. के तहत एक पेट्री डिश में दिल की जगहएक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (215 माइक्रोन जाल का एक छोटा सा टुकड़ा पर जगह विच्छेदन के दौरान स्थिर करने में मदद करने के लिए)। किसी भी अतिरिक्त गैर-हृदय के ऊतकों को ठीक आईरिस कैंची का उपयोग ट्रिम। सावधानी बरतें जब महाधमनी के पास काटने।
    11. brachioencephalic धमनी के पास महाधमनी आड़ा काट, और देखभाल नहीं बुलबुले या ऊतक मलबे उद्घाटन दर्ज बताने के लिए।
    12. बर्फ के ठंडे छिड़काव बफर कि इस तरह के तरल स्तर प्रवेशनी के उद्घाटन से ऊपर उठकर के साथ दिल से युक्त पेट्री डिश भरें। प्रवेशनी पर महाधमनी म्यान ऐसी है कि टिप सिर्फ महाधमनी वाल्व के लिए बाहर का है।
      सुझाव: हवा का आवेश के जोखिम को कम करने के लिए, थोड़ा संभावित हवाई बुलबुले जो प्रवेशनी के अंत में विकसित हो सकता है हटाने के लिए आदेश में केन्युलेशन से पहले प्रवेशनी पर सिरिंज दबाना। इसके अतिरिक्त, समाधान की सतह के नीचे प्रवेशनी की नोक और महाधमनी रखने के बुलबुले का परिचय करते हुए महाधमनी म्यान से बचने के लिए।
    13. स्लाइड एक पूर्व बंधे 7-0 रेशम सीवन नीचेकेन्युलेशन सुई और स्थिति अभी सुई की नोक से ऊपर की शाफ्ट। ठीक संदंश के साथ परिणय सूत्र में मजबूत करनी होगी। सिर्फ पहली ऊपर रखा एक दूसरे सीवन के साथ इस चरण को दोहराएँ।
      नोट: यह सुनिश्चित करें सुई की नोक से पहले और कस के बाद महाधमनी वाल्व के ऊपर अभी भी है।
    14. धीरे-धीरे कोरोनरी वाहिका के माध्यम से छिड़काव बफर के 0.5 मिलीलीटर बेदखल करने के लिए सिरिंज दबाना।
      नोट: यदि केन्युलेशन सफल रहा था, रक्त वाहिका कोरोनरी छोड़ने और पृष्ठीय नसों और धमनियों से बाहर पूलिंग देखे जा जाएगा।
      महत्वपूर्ण: वक्ष गुहा के उद्घाटन के समय (विशेष रूप से, डायाफ्राम puncturing) छिड़काव प्रारंभिक hypoxic जोखिम को कम करने और अस्तित्व और पृथक cardiomyocytes के स्वास्थ्य को अधिकतम करने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए। आदर्श रूप में, इस बार 5 मिनट से कम होना चाहिए।
  3. छिड़काव
    नोट: प्रतिगामी छिड़कावउपकरण आसानी से एक मानक प्रयोगशाला बेंच पर एक स्वच्छ वातावरण में संचालित या एक लामिना का प्रवाह हुड में रखा बाँझपन अधिकतम करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, छिड़काव के बाद पूरा हो गया है, काम लामिना का प्रवाह के तहत प्रदूषण को कम करने के लिए किया जाना चाहिए।
    1. धीरे लेकिन दृढ़ता से धीरे-धीरे आगे और पीछे घुमा द्वारा सिरिंज (बाँझ दस्ताने का उपयोग) से प्रवेशनी हब को हटा दें। सिरिंज के बंद केन्युलेशन सुई खींच जबकि, धीरे धीरे आदेश छिड़काव के दौरान हवा के बुलबुले को रोकने के लिए सुई हब में छिड़काव बफर बाहर निकालें।
    2. छिड़काव आउटलेट बंदरगाह के नीचे से recirculating पकड़ ट्यूब निकालें और बर्बादी पकड़ बीकर के साथ बदलें। Luer एडाप्टर है कि छिड़काव आउटलेट बंदरगाह के लिए तय हो गई है करने के लिए सुई हब संलग्न (आंकड़े 1, 2) पानी जैकेट पर, जबकि पंप सबसे कम सेटिंग पर चल रहा है (15 आरपीएम, ~ 6 मिलीग्राम / मिनट)।
      सुझाव: जब Luer एडाप्टर के लिए सुई हब जोड़ने, टपकता छिड़काव बफर चुनाव करने की अनुमतिआदेश में सुई हब में तरल करने के लिए nect बुलबुले शुरू करने से बचें।
    3. recirculation बिना दिल छिड़कना तक छिड़काव बफर के 8 मिलीलीटर इनलेट नली से aspirated किया गया है।
      नोट: छिड़काव बफर की मात्रा इस कदम पर इनलेट नली से aspirated छिड़काव प्रणाली के लिए 7 मिलीलीटर की एक मृत मात्रा हो जाती है, दिल के माध्यम से पंप छिड़काव बफर के 15 मिलीलीटर की कुल दे रही है।
    4. छिड़काव बफर से इनलेट ट्यूब निकालें। अनुमति दें हवा प्रणाली के मृत मात्रा की तुलना में कम समय के लिए प्रवेश से aspirated किया जाना है।
      नोट: इस चरण में aspirated हवा की मात्रा कोरोनरी वाहिका (कदम 1.3.7 देखें) में प्रवेश करने से हवा को रोकने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
    5. इनलेट ट्यूब पाचन बफर (तालिका 1) में रखें, बस ट्यूब के नीचे से ऊपर। धीरे-धीरे फ़ीड और इनलेट ट्यूब पर्याप्त मात्रा निकालना ट्यूब overfilling से बचने के लिए अनुमति देते हैं।
    6. कल्पना और बीच एयर बबल का पालन करेंछिड़काव बफर और पाचन बफर के रूप में यह गर्मी जैकेट के माध्यम से यात्रा करता है। गर्मी जैकेट के केंद्र में छिड़काव बफर के स्तर का निरीक्षण एक बार एयर बबल de-बुदबुदाती चैम्बर पहुंचता है ड्रॉप करने के लिए शुरू करते हैं। एक बार जब पाचन बफर de-बुदबुदाती कक्ष तक पहुँच जाता है, गर्मी जैकेट में तरल के स्तर स्थिर रहेगा।
      महत्वपूर्ण: छिड़काव बफर का स्तर बहुत कम आ जाता है, आउटलेट पानी निकलने की टोंटी को बंद करने और वेंट पानी निकलने की टोंटी खोलते हैं। (- आउटलेट बंदरगाह ऊपर 5 इंच 3) स्तर एक आरामदायक स्तर तक वृद्धि करने की अनुमति दें। फिर, छिड़काव पंप बंद करो और वेंट पानी निकलने की टोंटी बंद करें। आउटलेट बंदरगाह पानी निकलने की टोंटी खोलें और छिड़काव पंप को पुनः आरंभ।
    7. समाधान दिल से उभर देखो। छिड़काव बफर के अंतिम दिल छोड़ देता है और पाचन बफर दिल के माध्यम से घूम शुरू होता है, स्पष्ट रूप से हल्के भूरे रंग बदलने कोलैजिनेज़ की उपस्थिति के कारण मनाया जाएगा।
    8. पाचन बफर के साथ दिल छिड़कना15 मिनट - लगभग 10 के लिए। दिल के रूप में कोलेजन अपमानित किया जाता है slouching शुरू हो जाएगा और यह यांत्रिक समर्थन खो देता है।
  4. यांत्रिक हदबंदी और शोधन
    1. संदंश और एक सूखी पेट्री डिश में जगह के साथ प्रवेशनी से दिल निकालें। जल्दी ठीक आईरिस कैंची का उपयोग अतिरिक्त निलय ऊतक ट्रिम। एक ताजा पेट्री डिश युक्त छिड़काव बफर धोने के लिए निलय स्थानांतरण। एक बाँझ हुड के लिए पेट्री डिश ले जाएँ और एक ताजा, सूखी पेट्री डिश के लिए निलय हस्तांतरण।
    2. गर्मी जैकेट से पाचन बफर के 7.5 मिलीलीटर लीजिए और 1 एम 2 CaCl के 2.8 μl जोड़ने के लिए, उलटा द्वारा मिश्रण। पेट्री डिश में निलय को 2 CaCl साथ पाचन बफर के 3 मिलीलीटर - 2 जोड़े।
      नोट: सीए 2 की एकाग्रता 300 700 माइक्रोन से उठाया है
    3. जल्दी, ठीक संदंश के साथ निलय ऊतक triturate इतना है कि सबसे टुकड़े छोटे से कम 1 मिमी 3 रहे हैं। जोड़े रहनेपेट्री डिश में अलग निलय करने के लिए कदम 1.3.2 से सीए 2 पूरक पाचन बफर हैैं और कोमल आंदोलन के द्वारा मिश्रण।
    4. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पेट्री डिश रखें। पेट्री डिश हर 2 मिनट आंदोलन जब तक पर्याप्त cardiomyocytes (नीचे नोट देखें) ऊतक से जारी किया गया है।
      नोट: ऊष्मायन की लंबाई की आवश्यकता हो सकती प्रयोग की जरूरतों के हिसाब से पाचन की डिग्री ठीक धुन करने के लिए समायोजित किया जाना है। आम तौर पर, अब ऊष्मायन बार उपज और शुद्धता बढ़ाने के लिए, लेकिन सेल लगाव और जीवित रहने की दर को कम कर सकता है। 5 - 10 मिनट आम तौर पर एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है (~ 5 - दिल प्रति 10 x 10 5 कोशिकाओं)।
    5. पेट्री डिश एक लामिना का प्रवाह हुड के लिए वापस हस्तांतरण। एक हस्तांतरण पिपेट एक 45 डिग्री के कोण पर कटौती का प्रयोग, धीरे ऊतक पिपेट आगे अलग कर देना।
    6. एक शंकु में 215 माइक्रोन जाल गुना और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार पर पकड़ के लिए बाँझ दस्ताने का प्रयोग करें। विंदुकजाल पर अलग ऊतक निलंबन और छानना 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में पलायन करने की अनुमति देते हैं। जाल के माध्यम से पेट्री डिश से cardiomyocytes धोने के लिए, पहली छानना के साथ संयोजन के पूर्व गर्म रोक बफर (तालिका 1) के 7.5 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
      नोट: सीए 2 अंतिम 1.1 मिमी के लिए उठाया है और स्टॉप बफर में अंतिम 2.5% FBS प्रोटीज गतिविधि neutralizes।
    7. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार सेल निलंबन स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    8. ध्यान से एक हस्तांतरण पिपेट इस तरह से सतह पर तैरनेवाला हटाने है कि केवल 50 - समाधान के 100 μl कोशिकाओं से ऊपर बनी हुई है। पूर्व गर्म, equilibrated संस्कृति मीडिया (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर जोड़ें और कोमल उलटा द्वारा मिश्रण। cardiomyocytes 15 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
      सुझाव: शुद्धता बढ़ाने के लिए, कदम 1.4.8 के रूप में वांछित दोहराएँ।
    9. 100 μl ओ - ध्यान से एक हस्तांतरण पिपेट कि इस तरह के केवल 50 के साथ सतह पर तैरनेवाला हटानेएफ समाधान कोशिकाओं से ऊपर बनी हुई है।

2. cardiomyocyte संस्कृति

  1. प्री-कोट ऊतक कोशिकाओं चढ़ाना करने से पहले 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर laminin (10 माइक्रोग्राम / एमएल) और दुकान के साथ पेट्री डिश संस्कृति का इलाज। बस, चढ़ाना करने से पहले टिशू कल्चर प्लेट से laminin समाधान aspirate। सदस्य या पीबीएस के साथ एक बार धो लें, तो गैर adsorbed laminin दूर करने के लिए अवशिष्ट तरल aspirate।
  2. पर्याप्त पूर्व गरम, equilibrated संस्कृति मीडिया, वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए कोमल उलटा द्वारा मिश्रण जोड़ें। (- 20 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी आम तौर पर 5) प्लेट संस्कृति बर्तन में वांछित कोशिकाओं की एकाग्रता। cardiomyocyte अलगाव की उपज का आकलन करने के लिए, एक खुर्दबीन के नीचे घनत्व की जाँच करके hemacytometer या परीक्षण प्लेट के माध्यम से कोशिकाओं की गिनती। प्रोटोकॉल के इस स्तर पर 1.0 x 10 6 कोशिकाओं - एक वयस्क माउस दिल आम तौर पर 0.5 प्रदान करता है।
    सुझाव: अगर 96 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर, एक 1000 μl micropip का उपयोगएक टिप एक 45 डिग्री के कोण पर कटौती के साथ ette बल कतरनी के कारण सेल नुकसान को कम करने के लिए। विंदुक टिप ऐसी है कि यह सेल निलंबन के इंजेक्शन के दौरान अच्छी तरह से नीचे छू रहा है क्रम में बुलबुले की शुरूआत करने के लिए कम से कम रखें।
  3. 5% सीओ 2 और 95% नमी के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए तुरंत सेल संस्कृति पकवान ले जाएँ। के रूप में अम्लीकरण को रोकने की जरूरत मीडिया बदलें: हर 1 - सेल घनत्व के आधार पर 5 दिनों के लिए। पहले 3 दौरान संस्कृति पकवान की हैंडलिंग न्यूनतम - 6 दिन सेल संस्कृति की सतह के लिए कुर्की की सुविधा के लिए।
    नोट: जब कोशिकाओं को पूरी तरह संलग्न नहीं किया है मीडिया परिवर्तन के दौरान सेल अशांति को कम करने के लिए, एक आधा मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। धीरे-धीरे मीडिया aspirate जबकि सिर्फ मीडिया की सतह के नीचे विंदुक टिप रखे हुए हैं। फिर धीरे धीरे सिर्फ संस्कृति पकवान की दीवार के खिलाफ मीडिया की सतह से ऊपर विंदुक टिप रखकर अतिरिक्त मीडिया जोड़ें।
  4. cardiomyocytes की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, जाँचbrightfield माइक्रोस्कोपी के तहत आकृति विज्ञान। हौसले से अलग cardiomyocytes brightfield रोशनी के तहत तेज, अलग किनारों के साथ एक मोटे तौर पर छड़ी के आकार आकृति विज्ञान (चित्रा 2) बनाए रखें।
    नोट: trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं को धुंधला द्वारा व्यवहार्यता की पुष्टि करें।
  5. cardiomyocyte अलगाव की पवित्रता का आकलन करने के लिए, सेल आकृति विज्ञान cardiomyocytes की पहचान के लिए जाँच करें। Hoescht 33342 के साथ नाभिक दाग कुल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए।
    नोट: cardiomyocytes उनकी विशेषता आकृति विज्ञान (छड़ी के आकार का) और आकार के द्वारा गैर-cardiomyocytes से पहचाना जा सकता है (लगभग 100 - 200 सुक्ष्ममापी लंबाई में)। वैकल्पिक रूप से, हौसले से पृथक cardiomyocytes ऐसे अल्फा-actinin 26 (चित्रा -3 सी, डी) या हृदय ट्रोपोनिन टी 27 के रूप में cardiomyocyte विशेष मार्कर, के लिए सकारात्मक दाग होगा

3. Adenovirus साथ जीन पारगमन

  1. एडीनोवायरस सेल lysate तैयार स्थापित मीटर का उपयोगethods। 21 एडीनोवायरस उत्पादक कोशिकाओं 10 से सेल lysate का उपयोग कर cardiomyocytes transduce। अलगाव के बाद दिन 0 या दिन 1 पर, ध्यान से cardiomyocytes युक्त मीडिया को सेल lysate जोड़ें।
    ध्यान दें: एक उच्च अनुमापांक एडीनोवायरस तैयारी लगभग 48 में मजबूत अभिव्यक्ति को प्राप्त होगा - 72 घंटा। प्रयोगात्मक डिजाइन सूट करने के संक्रमण की बहुलता को समायोजित करें।

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Representative Results

एक जंगली प्रकार वयस्क आईसीआर (CD1) माउस दिल को आम तौर पर एक सफल अलगाव से 500,000 से 1 लाख करने के लिए cardiomyocytes अर्जित करता है। इसके तत्काल बाद अलगाव के बाद, कोशिकाओं को बरकरार sarcomeres के साथ एक ज्यादातर छड़ के आकार उपस्थिति (चित्रा 3 ए) को बनाए रखने और कार्यात्मक cardiomyocyte सिकुड़ना शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। छड़ के आकार cardiomyocytes (90% से ऊपर) के एक उच्च प्रतिशत प्रभावी छिड़काव और पाचन का एक संकेत है। व्यवहार्य cardiomyocytes बड़ा हो जाएगा (~ 100 - लंबाई में 200 माइक्रोन) और brightfield रोशनी (चित्रा 3 ए) के तहत एक तेज बाहरी झिल्ली दिखाई देते हैं। ऐसे अल्फा-actinin के रूप में cardiomyocyte विशेष sarcomeric मार्कर, के लिए Immunostaining, एक अलग sarcomeric बैंडिंग पैटर्न (चित्रा -3 सी) में परिणाम होगा। रूपात्मक विश्लेषण और DAPI के साथ परमाणु धुंधला के साथ संयोजन के रूप में, immunostaining अलग cardiomyocytes की पवित्रता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। FIBRओब्लास्ट्स सिर्फ अलगाव के बाद छोटे और गोल हो जाएगा, लेकिन जल्दी से देते हैं और सेल संस्कृति प्लास्टिक पर पतली फैल जाएगा, इस प्रकार cardiomyocytes से सतही भेद सक्षम करने से।

छड़ के आकार cardiomyocytes के कम प्रतिशत एक असफल अलगाव का एक संकेत है। यह एक विफलता से परिणाम जल्दी महाधमनी cannulate करने के बाद दिल जानवर से निकाला जाता है सकते हैं। अक्षम छिड़काव, हवा का आवेश या उदाहरण के लिए गलत केन्युलेशन के कारण भी आकृति विज्ञान और cardiomyocytes की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं।

संस्कृति में कई दिनों के बाद, cardiomyocytes एक गोल आकृति विज्ञान (चित्रा 3 बी) मान। 1 के भीतर - 2 सप्ताह, जीना cardiomyocytes सब्सट्रेट के लिए देते हैं और प्रसार (चित्रा 3 डी, ई) शुरू करते हैं। मृत कोशिकाओं trypan नीले शामिल किए जाने से पहचाना जा सकता है। एक सफल अलगाव और संस्कृति को लाइव कार्डियो लगभग 50% निकलेगा1 सप्ताह के बाद myocytes। ऐसे fibroblasts उनकी proliferative क्षमता की वजह से इन कोशिकाओं को बाद में संस्कृति की एक उच्च प्रतिशत का परिणाम देगा के रूप में गैर cardiomyocytes, द्वारा संदूषण। यह गुरुत्वाकर्षण sedimentations की संख्या बढ़ रही है और / या पूर्व चढ़ाना के माध्यम से शुद्धता बढ़ाने के लिए करने से बचा जा सकता है। 28

72 घंटा (चित्रा 3E) - adenovirus साथ पारगमन 48 के भीतर मजबूत जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Adenovirus सीरोटाइप 5 coxackie-adenovirus रिसेप्टर के उच्च अभिव्यक्ति के कारण इन विट्रो में वयस्क माउस cardiomyocytes transducing में कुशल है, लेकिन इस्तेमाल मीडिया के प्रकार पर निर्भर हो सकता है। 20

आकृति 1
चित्रा 1. cardiomyocyte अलगाव उपकरण और उपकरण। (ए) सर्जिकल उपकरणों माउस निकालने के लिए इस्तेमालदिल और ऊपर से नीचे तक महाधमनी cannulate: hemostats, ऊतक संदंश, घुमावदार संदंश, Dumont # 5 ठीक संदंश, छोटे विदारक कैंची, ठीक आईरिस कैंची, ठीक निचोड़ कैंची (बी) Langendorff छिड़काव माउस दिल को पचाने के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली। । छिड़काव बफ़र्स इनलेट ट्यूब (1) छिड़काव पंप के माध्यम से aspirated कर रहे हैं (2) और गर्म पानी जैकेट पर पंप आउटलेट ट्यूब (3) इनलेट पोर्ट में के माध्यम से (4)। छिड़काव बफ़र्स तो केन्युलेशन छिड़काव आउटलेट बंदरगाह (5) है, जो एक पानी निकलने की टोंटी से जुड़ा हुआ है के साथ संलग्न सुई से बाहर गर्म पानी जैकेट से गरम कर रहे हैं के रूप में वे सर्पिल ग्लास ट्यूब, debubbling कक्ष के माध्यम से यात्रा, और। नीचे शंक्वाकार ट्यूब छिड़काव buffers, जो इनलेट ट्यूब के माध्यम से फिर से वितरित कर रहे हैं फैल जाती है। दबाव बंदरगाह (6), अनुपालन बंदरगाह (7) और वेंट (8) रहने के क्रम में एक निरंतर प्रवाह की दर बनाए रखने के लिए छिड़काव के दौरान बंद कर दिया। पानी जैकेट एक घूम पानी स्नान वीं के माध्यम से प्रवेश करने से गरम किया जाता हैई जैकेट इनलेट (9) और आउटलेट (10) बंदरगाहों। एक अंगूठी स्टैंड एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में गर्म पानी जैकेट (लाल अकड़न, बैंगनी शंक्वाकार ट्यूब रैक के नीचे काले आधार) धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 छिड़काव प्रणाली के योजनाबद्ध अवलोकन। के रूप में पांडुलिपि में करने के लिए भेजा छिड़काव उपकरण के महत्वपूर्ण भागों में चिह्नित कर रहे हैं। छिड़काव बफर के प्रवाह की दिशा तीर द्वारा संकेत दिया है। नोट महाधमनी प्रवेशनी की स्थिति है, जो की नोक, पारदर्शी महाधमनी के माध्यम से दिखाई जानी चाहिए यह सुनिश्चित करने महाधमनी वाल्व से ऊपर रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. पृथक वयस्क माउस cardiomyocytes। Cardiomyocytes Laminin-लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें प्रोटोकॉल के साथ साथ के रूप में वर्णित पर पृथक और वरीयता प्राप्त थे। (ए) हौसले से पृथक cardiomyocytes, वरीयता प्राप्त लगभग 8000 कोशिकाओं / 2 सेमी। ध्यान दें कि हौसले से पृथक, व्यवहार्य cardiomyocytes लगभग दिखाई रॉड तेज किनारों (सफेद नोक) के साथ आकार का है। हालांकि, cardiomyocytes brightfield के तहत एक फैलाना बाहरी झिल्ली लग गए हैं कि मर चुके हैं। संस्कृति के पहले कई दिनों के दौरान, cardiomyocytes एक गोल आकार (बी)। (सी) अल्फा-actinin (हरा) के लिए Immunostaining डी 1 के बाद अलगाव पर एक cardiomyocyte में विशेषता sarcomeric बैंडिंग का पता चलता है मान लेते हैं। परमाणु दाग ​​(DAPI) नीले रंग में दिखाया गया है। शीर्ष शो कम छवि में उल्लिखित क्षेत्र की छवि तेजी से बढ़ी है। (डी) (ई) brightfield और epifluorescent छवियों दिन 11 के बाद अलगाव एडीनोवायरस एक सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में एक GFP संवाददाता ले जाने के साथ transduced पर cardiomyocytes (दिखाने UT दक्षिण में रॉबर्ट जेरार्ड से एक उपहार)। प्रकोष्ठों में लगभग 18,000 कोशिकाओं / 2 सेमी वरीयता प्राप्त थे और सेल के अनुसार लगभग 800 पट्टिका के गठन इकाइयों (pfu) के संक्रमण की बहुलता का उपयोग कर 0 दिन पर transduced थे। स्केल सलाखों:। 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Cardiomyocyte अलगाव बफर (सीआईबी)
पत्रिका के तहत एक साफ बीकर ultrapure पानी की 900 मिलीलीटर जोड़ेंnetic क्रियाशीलता।
संकेत के रूप में तालिका में बफर घटकों को जोड़ने।
अंग मेगावॉट अंतिम सान्द्र (मिमी) 1X (छ / एल)
NaCl 58.44 120 7.013
KCl 74.55 5.4 0.403
ना 2 HPO4.7H 2 ओ 268.07 0.33 0.088
MgSO 4 .7H 2 ओ 246.48 0.5 0.123
बैल की तरह 125.1 30 3.753
BDM 101.1 10 1.011
HEPES 238.3 25 5.958
शर्करा 180.16 22 3.964
पीएच बुद्धि को समायोजित करेंघंटे 5 एम NaOH।
ultrapure पानी के साथ 1 एल मात्रा समायोजित करें।
बाँझ फिल्टर डब्ल्यू / 0.22 सुक्ष्ममापी वैक्यूम फिल्टर।
प्रति cardiomyocyte अलगाव बफर की लीटर 0.1 यू / एमएल इंसुलिन के 0.5 μl जोड़ें।
छिड़काव बफर
अंग अंतिम वॉल्यूम (एमएल)
सीआईबी - 200
EGTA (0.4M) 0.4 मिमी 0.2
कुल - 200
पाचन बफर
अंग अंतिम रकम
सीआईबी - 15 मिलीलीटर
CaCl2 (1 मी) 300सुक्ष्ममापी 4.5 μl
प्रोटीज XIV 0.2 मिलीग्राम / एमएल 3 मिलीग्राम
कोलेजिनेस द्वितीय 2.4 मिलीग्राम / एमएल 36 मिलीग्राम
कुल - 15 मिलीलीटर
बंद करो बफर
अंग अंतिम वॉल्यूम (एमएल)
छिड़काव बफर 95% 14.25
CaCl2 (1 मी) 1.5 मिमी 22.5
FBS 5% 0.75
कुल - 15 मिलीलीटर
संस्कृति मीडिया
अंग अंतिम % वॉल्यूम (एमएल)
सदस्य मीडिया 90% 90
FBS 10% 10
Primocin 0.2% 0.2
कुल 100% 100 मिलीलीटर
संस्कृति मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड से संतुलित करने की अनुमति दें।

तालिका 1: समाधान और बफ़र।

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Discussion

पृथक cardiomyocytes के समग्र स्वास्थ्य के इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण पहलुओं पर निर्भर करता है। सबसे पहले, छिड़काव करने के लिए दिल से निकासी के समय महत्वपूर्ण है और 5 मिनट या उससे कम समय में किया जाना चाहिए। कैल्शियम का हटाया जाना इस प्रकार सेल सेल बातचीत को अलग कर देना करने में मदद करता है, लेकिन नकारात्मक सेल स्वास्थ्य दीर्घकालिक प्रभाव कर सकते हैं। 29-32, हम इसे पर्याप्त EGTA द्वारा छिड़काव के शुरुआती कुछ मिनटों के दौरान कैल्शियम दूर करने के लिए मिल (एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड) केलेशन, 22 परन्तु जल्दी से पाचन और बाद के चरणों के दौरान कैल्शियम बहाल।

प्रोटीज XIV का उपयोग बहुत पाचन दक्षता अकेले collagenase की तुलना में बेहतर बनाता है। यह कोलैजिनेज़ बैच परिवर्तनशीलता के कारण विसंगति को कम कर देता 18,24 और गुरुत्वाकर्षण अवसादन दौरान जुदाई की सुविधा से cardiomyocytes की शुद्धता बढ़ जाती है। बहरहाल, अधिक पाचन संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए कुशल लगाव है, तो एक अच्छा संतुलन रहा रोकने जाएगाजबकि सेल लगाव और व्यवहार्यता को बनाए रखने सेल उपज और पवित्रता का अनुकूलन करने की आवश्यकता रहा है। इस प्रकार, proteases और पाचन की लंबाई की एकाग्रता प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, पाचन की एक डिग्री कम लगाव और cardiomyocytes के अस्तित्व में वृद्धि होगी। Trypsin का उपयोग कुछ cardiomyocyte अलगाव प्रोटोकॉल में सूचना दी गई है। 18 हालांकि, प्रोटीज यहां इस्तेमाल कॉकटेल के लिए trypsin के अलावा (कोलैजिनेज़ और प्रोटीज XIV) संस्कृति में cardiomyocytes के दीर्घकालिक व्यवहार्यता, शायद अधिक-पाचन या दरार के कारण कम कर देता है आवश्यक सतह और / या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की।

अलगाव के दौरान butanedione monoxime (BDM) के शामिल किए जाने के हृदय की मांसपेशियों के संकुचन को रोकता है, और इस तरह टर्मिनल contracture, ऊर्जा व्यय, और कैल्शियम विरोधाभास के कारण नकारात्मक परिणाम कम कर देता है। 29,33 हालांकि, हमारे अनुभव में, BDM के हटाने से पहले संस्कृति dedifferentiatio expeditesn और कोशिकाओं दो आयामों में संस्कृति के लिए अनुकूल करने की अनुमति देता है।

यह ध्यान रखें 2-डी संस्कृति है कि लंबी अवधि के रूपांतरों ऐसे सिकुड़ना के रूप में cardiomyocytes के कार्यात्मक पहलुओं को प्रभावित कर सकता महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, सिकुड़ना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों जल्द ही अलगाव, जब देशी sarcomeric संगठन अभी भी बरकरार है के बाद किया जाना चाहिए। इसके अलावा, किसी भी इन विट्रो प्रयोग के साथ के रूप में, संस्कृति में कोशिकाओं को इस तरह के त्रिदोषन या प्रतिरक्षा संकेत के रूप में विवो में मौजूद कुछ बाह्य प्रभाव पड़ता है, से रहित हैं। दूसरी ओर, परिभाषित सह संस्कृतियों cardiomyocytes और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। 5,34 इसके अतिरिक्त, इन विट्रो संस्कृति में संस्कृति मीडिया में परिभाषित आणविक संकेतों के साथ cardiomyocyte व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रयोग के समग्र लक्ष्यों को ध्यान से विचार किया और सीमाओं और इस संस्कृति प्रणाली के फायदे के खिलाफ तौला जाना चाहिए।

35 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि FBS और अन्य पशु व्युत्पन्न सीरा अज्ञात घटक है कि सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं शामिल । 36,37 FBS में वृद्धि कारकों की अच्छी तरह से सराहना की उपस्थिति के बावजूद, 38 cardiomyocyte यहाँ प्रस्तुत संस्कृतियों पैदा करना नहीं है। बल्कि, कोशिका चक्र ब्लॉक वयस्क माउस cardiomyocytes के एक लगातार संपत्ति होने की पूर्व vivo, विकास के प्रसवकालीन अवधि के दौरान अपने सेल चक्र से बाहर निकलें से बनाए रखा। 12,39 यह संपत्ति हृदय पुनर्योजी चिकित्सा, जहां के क्षेत्र में प्रमुख ब्याज की है लगता है एक proliferative phenotype के लिए वयस्क स्तनधारी cardiomyocytes के प्रत्यावर्तन एक भारी अपनाई लक्ष्य दिया गया है। 3,26,40-42 विशेष रूप से, यह स्पष्ट नहीं है कि वर्तमान में cardiomyocytes करने के लिए सेल चक्र फिर से दर्ज करने के लिए क्या डिग्री dedifferentiation की आवश्यकता है, लेकिन contributioकम रीढ़ में उत्थान के लिए dedifferentiation के एन अच्छी तरह से 43,44,10,11 इसके अलावा समर्थित है, dedifferentiation तेजी से cardiomyocyte प्रसार और myofibrillar disassembly 6,12,9 सहित स्तनधारी प्रणाली, कम से कम कार्यात्मक स्तर पर, में दिल उत्थान में मनाया जा रहा है इस प्रकार, संस्कृति में cardiomyocytes के भेदभाव के राज्य ध्यान से विचार किया जाना चाहिए और संग्राहक अनुसंधान लक्ष्यों की जरूरतों के अनुसार। जैसे, संस्कृति की स्थिति में संभावित आगे सीरम एकाग्रता, उपयोग परिभाषित सीरम के विकल्प या सीरम मुक्त मीडिया को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, वयस्क चूहे का आयोजन sarcomeres प्रदर्शन cardiomyocytes सीरम बिना सभ्य लंबी अवधि के थे, लेकिन इस तरह के fibroblast वृद्धि कारक, epidermal वृद्धि कारक है, और ट्राईआयोडोथायरोनिन रूप में वृद्धि कारकों परिभाषित मीडिया में इस्तेमाल किया गया। 45 यह कल्पना है कि इसी तरह के मीडिया योगों, या संभवतः अन्य ऐसे differenti से अनुकूलित के रूप में उन योगोंव्यावहारिक प्रोटोकॉल, 46 संस्कृति में अच्छी तरह से विभेदित वयस्क माउस cardiomyocytes कि अत्यधिक का आयोजन sarcomeric संरचनाओं प्रदर्शन को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक योगों भी प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है (जैसे अत्यधिक de-विभेदित cardiomyocytes के रूप में) अन्य phenotypes 6 हासिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है, लेकिन आगे के काम की आवश्यकता होगी।

Fibroblasts की भूमिका लंबी अवधि संस्कृति में नवजात माउस cardiomyocyte कोशिका चक्र 5 और वयस्क माउस cardiomyocyte भेदभाव (hypertrophic IL6 संकेत के माध्यम से) के नियंत्रण में फंसाया गया है। 19 इसलिए, संस्कृति में fibroblasts की विकास प्रयोगात्मक व्याख्याओं में लिए जिम्मेदार होना चाहिए । संस्कृति में fibroblasts के विकास के पूर्व चढ़ाना कदम के माध्यम से साइटोसिन arabinoside 19 (Arac) या जैसे यौगिकों सीमित विकास के अलावा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। 28 हालांकि, Arac भी cardiomyocytes के विकास, तो विकल्प को रोकना होगातरीकों cardiomyocyte कोशिका चक्र के विषय में अध्ययन में fibroblasts के विकास को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, प्रारंभिक cardiomyocyte पवित्रता गुरुत्वाकर्षण अवसादन कदम (1.4.8 देखें) दोहरा द्वारा बढ़ाया जा सकता है।

तरीकों के साथ साथ इन विट्रो प्रणाली है कि वयस्क स्तनधारी cardiomyocyte कोशिका चक्र नाकाबंदी की प्रकृति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं। इस तरह के चूहे या गिनी पिग के रूप में अन्य जीवों से प्राथमिक कोशिकाओं के विपरीत, प्राथमिक माउस cardiomyocytes ऐसे सीआरई आधारित वंश अनुरेखण तोड़े में मॉडल के रूप में शक्तिशाली और अच्छी तरह से विशेषता आनुवंशिक उपकरण, की एक धन की पेशकश, 47 को आसानी से करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पूर्व मौजूदा cardiomyocytes से ली गई कोशिकाओं की पहचान। 12,48 इसके अतिरिक्त, प्राथमिक वयस्क murine cardiomyocytes मूल निवासी विकास की स्थिति है कि सेल चक्र नाकाबंदी में परिणाम के अधीन कर दिया गया है, सेल लाइनों और विभेदित तों या IPSC कोशिकाओं 46 के विपरीत है, जो उनकी convenien के बावजूदसीई और बड़ी दवा स्क्रीन करने के लिए अनुकूलन क्षमता, 2 वयस्क cardiomyocyte सेल चक्र से बाहर निकलें की प्रकृति की जांच कर रहे प्रयोगों में सीमित उपयोगिता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल संस्कृति वयस्क माउस cardiomyocytes को अलग-थलग करने के लिए एक विश्वसनीय विधि और रूपरेखा। कई तरीकों पहले अल्पकालिक अध्ययन के लिए वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव का प्रदर्शन किया है, लेकिन आज तक, कुछ रिपोर्टों वयस्क चूहे cardiomyocytes के लंबी अवधि संस्कृति के लिए मौजूद हैं। 18,19 संस्कृति में सक्षम होना चाहिए वयस्क माउस cardiomyocytes बनाए रखने की क्षमता लंबे समय तक परीक्षा की आवश्यकता होती है प्रयोगात्मक शर्तों के तहत cardiomyocyte जीव विज्ञान की इन विट्रो अध्ययन। उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति एडीनोवायरस वैक्टर, जो आम तौर पर पूर्ण अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए कुछ दिनों की आवश्यकता का उपयोग कर चालाकी से किया जा सकता है। इसके बाद प्ररूपी परिवर्तन और विश्लेषण प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर समय की भी लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है। यहाँ प्रस्तुत तरीकों वयस्क माउस cardiom की संस्कृति की अनुमति देते हैंकई हफ्तों के लिए yocytes। इस तरह के सेल चक्र विनियमन से संबंधित उन के रूप में cardiomyocyte जीव विज्ञान में समझदारी सवाल, की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करना चाहिए।

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Acknowledgments

इस परियोजना के निर्णायक जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए UCSF कार्यक्रम (सैंडलर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित में भाग), एनआईएच मार्ग स्वतंत्रता पुरस्कार के लिए (R00HL114738), और एडवर्ड Mallinckrodt जूनियर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया। जे जे एनआईएच (T32HL007731) से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। लेखक इस काम है, जो जरूरी एनआईएच के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता की सामग्री के लिए पूरी तरह जिम्मेदार हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Heated water jacket Radnoti 158831
Circulating heated water bath, Isotemp Fisher Scientific 3013
Laboratory pump Watson-Marlow 323
Hemostats Exelta 63042-090
Tissue forceps VWR 470128034
Dumont #7 curved forceps FST 91197-00
Dumont #5 fine forceps FST 11251-20
Small dissection scissors VWR 470128034
Extra fine bonn scissors FST 14084-08
Fine spring scissors FST 91500-09
Name Company Catalog Number Comments
Materials
NaCl Sigma S9888
KCl Sigma P9541
Na2HPO4.7H2O Fisher S25837
MgSO4.7H2O Fisher S25414
Taurine Sigma 86329
Butane dione monoxime (BDM) Sigma B0753
HEPES Fisher  BP310100
Glucose Sigma G-7021
Insulin Novo Nordisk 393153
EGTA Amresco 0732-288
Protease, type XIV Sigma P5147
Collagenase II Worthington LS004176
MEM Corning 15-010-CV
FBS, heat inactivated JRS 43613
Primocin Invitrogen NC9141851
Ethyl Carbamate Alfa Aesar AAA44804-18
215 micron mesh Component supply U-CMN-215-A
20 G blunt ended needle Becton Dickinson 305183
20 G beveled needle Becton Dickinson 305176
Lab tape VWR 89097-990
Surgical tape 3M 1527-0
Silk suture, 7-0 Teleflex 15B051000
Mouse anti-alpha-actinin antibody Sigma A7811
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody Thermo Fisher A21121

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References

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अलगाव, संस्कृति और वयस्क माउस cardiomyocytes के पारगमन
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Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N.… More

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).

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