成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入
Summary
This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Abstract
培養心筋細胞がインビボ系に相補的な技術を使用して心筋細胞生物学を研究するために使用することができます。例えば、 インビトロ培養の純度とアクセシビリティは、生化学分析、ライブイメージング、および電気生理学を細かく制御を可能にします。心筋細胞の長期培養は、短期培養で完了することができない追加の実験的アプローチへのアクセスを提供しています。例えば、脱分化、細胞周期の再進入、および細胞分裂のインビトロ研究は、これまで主として長期培養においてより堅牢であると思われるラット心筋細胞に限定されています。しかし、トランスジェニックマウス系統とよく発達した疾患モデルの豊富なツールセットの利用可能性は、心臓研究のためのマウスのシステムは魅力的です。いくつかの報告は、成体マウスの心筋細胞の単離の存在するが、いくつかの研究は、それらの長期培養を実証します。ここで紹介する、ステップ・バイ・ステップ方式であります単離および成体マウスの心筋細胞の長期培養。まず、逆行ランゲンドルフ灌流を効率的に重力沈降精製を行っプロテアーゼ、と心を消化するために使用されます。単離後脱分化の期間の後、細胞は徐々に培養に付着し週間培養することができます。アデノウイルスの細胞溶解物を効率的に単離された心筋細胞を形質導入するために使用されます。これらの方法は、心臓の生物学を研究するために、シンプルでありながら強力なモデルシステムを提供します。
Introduction
培養心筋細胞は、しばしば、インビトロで十分に制御された環境における細胞の挙動を監視するために使用されます。例えば、形態学的、電気的、生化学的、または機械的な電池特性は、定義された培地中で1,2、および小分子薬剤、ペプチド、遺伝子調節、3または電気的刺激に応答して操作された基板上に研究することができる。4細胞の含有量ができますまた、定義された共培養を使用して制御される。5これらのインビトロ実験は、大きな薬物または遺伝子スクリーニングにおいて有用であり、心筋細胞の生物学に関わる研究の様々なタイプのためのインビボの方法で補います。
長期培養は、表現型の変化を達成するために長時間を必要とする実験的な道を可能にします。タイムリーな例は、脱分化、細胞周期に再進入し、細胞分裂は、典型的には、それ自体の上に検討されている成体哺乳類の心筋細胞の増殖、のものです週にveral日。ここで6,7、延長培養時間は、遺伝子操作、7,8-機能脱分化（ 例えば、筋節解体）9と、潜在的に転写脱分化を促進する。6その後の細胞周期の再入国と細胞分裂がさらに長い培養期間を必要とします分裂複数回の実験の目標である場合は特に、観察しました。心筋細胞周期の重要性は、既存の心筋細胞の脱分化と増殖は、ゼブラフィッシュおよび新生児マウスにおける心臓の再生を担うことが示されている心臓再生における最近のいくつかの重要な科学的な作品、の中心である。10月12日このように、可能性哺乳類の成体の心筋細胞に脱分化、細胞周期の再入国を刺激することは、人間の心臓の再生13-15で重要な問題のまま
I nは 、哺乳動物の心臓の細胞周期を研究するインビトロ実験筋細胞は、主に起因するマウスモデルと比較して、長期培養のが比較的容易に、ラットのソースを使用していた。16しかし 、マウス系は両方のin vitroおよびin vivoで有用である十分に特徴付けられたトランスジェニックツールや疾患モデルの豊富なリソースを提供していますプロトコル。例えば、Creをベース系統のトレースは、in vivoでの新生児マウスの心臓に心筋を再生するソースとして既存の心筋細胞の同定を可能にした。系譜トレース新生児マウス心筋細胞のin vitro試験において 、12は間質との相互作用の検討を有効にしています線維芽細胞との共培養による細胞。5しかし、その課題に、17ほとんど報告が成体マウスの心筋細胞の単離および長期的な文化の存在。18,19
単独での短期培養のための実行可能な成体マウス心筋細胞の単離は困難な作業であることが知られています。このprotocオールは、短期および長期の調査の両方に使用することができる成体マウスから実行可能な心筋細胞を達成する方法について順を追って説明します。このプロトコルを使用して単離された心筋細胞を効率的にアデノウイルスベクター週間20,21培養で形質導入することができます。これらの方法には、in vitroで心筋細胞生物学を研究するための強力なシステムを提供します。
本明細書に記載の方法は、ランゲンドルフ逆行性灌流のバリエーションを使用して、以前の作品からいくつかの要素に基づいています。18,22、いくつかのプロトコルは、短期培養および研究のための成体マウスの心筋細胞の単離に公開されているが、23-25 利点のこのプロトコルは、培養する能力孤立した心筋細胞の長期的です。これは、異所性遺伝子発現に関与すると、携帯リプログラミング戦略のように長期間を要する細胞プロセスの研究に有用であろう。
Protocol
Representative Results
Discussion
孤立した心筋細胞の全体的な健康状態は、このプロトコルのいくつかの重要な側面に依存します。まず、灌流に対する心臓の抽出から時間が重要であり、5分以内に行われるべきです。カルシウムの除去は、細胞間相互作用を解離するのに役立ちますが、負の細胞の健康、長期的に影響を与える可能性がある。29-32したがって、我々はそれが十分なEGTA（エチレングリコール四酢酸）キ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、（サンドラー財団によって部分的に資金提供）画期的な生物医学研究のためのUCSFプログラム、独立賞にNIH経路（R00HL114738）、およびエドワード・マリンクロット・ジュニア財団によって資金を供給されました。 JJは、NIH（T32HL007731）からポスドクフェローシップによってサポートされていました。著者は、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。この作品の内容について、単独で責任を負うものとします。
Materials
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. . Practical Methods in Cardiovascular Research. , (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
