Summary

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Published: August 28, 2016
doi:

Summary

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Abstract

培養心筋細胞がインビボ系に相補的な技術を使用して心筋細胞生物学を研究するために使用することができます。例えば、 インビトロ培養の純度とアクセシビリティは、生化学分析、ライブイメージング、および電気生理学を細かく制御を可能にします。心筋細胞の長期培養は、短期培養で完了することができない追加の実験的アプローチへのアクセスを提供しています。例えば、脱分化、細胞周期の再進入、および細胞分裂のインビトロ研究は、これまで主として長期培養においてより堅牢であると思われるラット心筋細胞に限定されています。しかし、トランスジェニックマウス系統とよく発達した疾患モデルの豊富なツールセットの利用可能性は、心臓研究のためのマウスのシステムは魅力的です。いくつかの報告は、成体マウスの心筋細胞の単離の存在するが、いくつかの研究は、それらの長期培養を実証します。ここで紹介する、ステップ・バイ・ステップ方式であります単離および成体マウスの心筋細胞の長期培養。まず、逆行ランゲンドルフ灌流を効率的に重力沈降精製を行っプロテアーゼ、と心を消化するために使用されます。単離後脱分化の期間の後、細胞は徐々に培養に付着し週間培養することができます。アデノウイルスの細胞溶解物を効率的に単離された心筋細胞を形質導入するために使用されます。これらの方法は、心臓の生物学を研究するために、シンプルでありながら強力なモデルシステムを提供します。

Introduction

培養心筋細胞は、しばしば、インビトロで十分に制御された環境における細胞の挙動を監視するために使用されます。例えば、形態学的、電気的、生化学的、または機械的な電池特性は、定義された培地中で1,2、および小分子薬剤、ペプチド、遺伝子調節、3または電気的刺激に応答して操作された基板上に研究することができる。4細胞の含有量ができますまた、定義された共培養を使用して制御される。5これらのインビトロ実験は、大きな薬物または遺伝子スクリーニングにおいて有用であり、心筋細胞の生物学に関わる研究の様々なタイプのためのインビボの方法補います。

長期培養は、表現型の変化を達成するために長時間を必要とする実験的な道を可能にします。タイムリーな例は、脱分化、細胞周期に再進入し、細胞分裂は、典型的には、それ自体の上に検討されている成体哺乳類の心筋細胞の増殖、のものです週にveral日。ここで6,7、延長培養時間は、遺伝子操作、7,8-機能脱分化( 例えば、筋節解体)9と、潜在的に転写脱分化を促進する。6その後の細胞周期の再入国と細胞分裂がさらに長い培養期間を必要とします分裂複数回の実験の目標である場合は特に、観察しました。心筋細胞周期の重要性は、既存の心筋細胞の脱分化と増殖は、ゼブラフィッシュおよび新生児マウスにおける心臓の再生を担うことが示されている心臓再生における最近のいくつかの重要な科学的な作品、の中心である。10月12日このように、可能性哺乳類の成体の心筋細胞に脱分化、細胞周期の再入国を刺激することは、人間の心臓の再生13-15で重要な問題のまま

I nは 、哺乳動物の心臓の細胞周期を研究するインビトロ実験筋細胞は、主に起因するマウスモデルと比較して、長期培養のが比較的容易に、ラットのソースを使用していた。16しかし 、マウス系は両方のin vitroおよびin vivoで有用である十分に特徴付けられたトランスジェニックツールや疾患モデルの豊富なリソースを提供していますプロトコル。例えば、Creをベース系統のトレースは、in vivoでの新生児マウスの心臓に心筋を再生するソースとして既存の心筋細胞の同定を可能にした。系譜トレース新生児マウス心筋細胞のin vitro試験において 、12間質との相互作用の検討を有効にしています線維芽細胞との共培養による細胞。5しかし、その課題に、17ほとんど報告が成体マウスの心筋細胞の単離および長期的な文化の存在。18,19

単独での短期培養のための実行可能な成体マウス心筋細胞の単離は困難な作業であることが知られています。このprotocオールは、短期および長期の調査の両方に使用することができる成体マウスから実行可能な心筋細胞を達成する方法について順を追って説明します。このプロトコルを使用して単離された心筋細胞を効率的にアデノウイルスベクター週間20,21培養で形質導入することができます。これらの方法には、in vitroで心筋細胞生物学を研究するための強力なシステムを提供します。

本明細書に記載の方法は、ランゲンドルフ逆行性灌流のバリエーションを使用して、以前の作品からいくつかの要素に基づいています。18,22、いくつかのプロトコルは、短期培養および研究のための成体マウスの心筋細胞の単離に公開されているが、23-25 ​​利点のこのプロトコルは、培養する能力孤立した心筋細胞の長期的です。これは、異所性遺伝子発現に関与すると、携帯リプログラミング戦略のように長期間を要する細胞プロセスの研究に有用であろう。

Protocol

ここで説明するすべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校施設内動物の使用およびケア委員会によって承認されています。 注:簡単に言えば、マウスの胸部から心臓を取り出した後、冠動脈の逆行性灌流を効率的にコラゲナーゼおよびプロテアーゼXIVと細胞外マトリックスを消化するために使用されます。心室はその後、機械的に分離し、?…

Representative Results

野生型大人のICR(CD1)マウスの心臓は、一般的に成功したアイソレーション〜500,000百万〜1心筋細胞が得られます。すぐに分離した後、細胞は無傷のサルコメアとほとんど棒状の外観( 図3A)を維持し、心筋収縮を伴う機能的研究のために使用することができます。 (90%以上)の棒状の心筋細胞の高い割合は、効果的な灌流および消化の指標です。生存…

Discussion

孤立した心筋細胞の全体的な健康状態は、このプロトコルのいくつかの重要な側面に依存します。まず、灌流に対する心臓の抽出から時間が重要であり、5分以内に行われるべきです。カルシウムの除去は、細胞間相互作用を解離するのに役立ちますが、負の細胞の健康、長期的に影響を与える可能性がある。29-32したがって、我々はそれが十分なEGTA(エチレングリコール四酢酸)キ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、(サンドラー財団によって部分的に資金提供)画期的な生物医学研究のためのUCSFプログラム、独立賞にNIH経路(R00HL114738)、およびエドワード・マリンクロット・ジュニア財団によって資金を供給されました。 JJは、NIH(T32HL007731)からポスドクフェローシップによってサポートされていました。著者は、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。この作品の内容について、単独で責任を負うものとします。

Materials

Equipment
Heated water jacket Radnoti 158831
Circulating heated water bath, Isotemp Fisher Scientific 3013
Laboratory pump Watson-Marlow 323
Hemostats Exelta 63042-090
Tissue forceps VWR 470128034
Dumont #7 curved forceps FST 91197-00
Dumont #5 fine forceps FST 11251-20
Small dissection scissors VWR 470128034
Extra fine bonn scissors FST 14084-08
Fine spring scissors FST 91500-09
Name Company Catalog Number Comments
Materials
NaCl Sigma S9888
KCl Sigma P9541
Na2HPO4-7H2O Fisher S25837
MgSO4-7H2O Fisher S25414
Taurine Sigma 86329
Butane dione monoxime (BDM) Sigma B0753
HEPES Fisher  BP310100
Glucose Sigma G-7021
Insulin Novo Nordisk 393153
EGTA Amresco 0732-288
Protease, type XIV Sigma P5147
Collagenase II Worthington LS004176
MEM Corning 15-010-CV
FBS, heat inactivated JRS 43613
Primocin Invitrogen NC9141851
Ethyl Carbamate Alfa Aesar AAA44804-18
215 micron mesh Component supply U-CMN-215-A
20 G blunt ended needle Becton Dickinson 305183
20 G beveled needle Becton Dickinson 305176
Lab tape VWR 89097-990
Surgical tape 3M 1527-0
Silk suture, 7-0 Teleflex 15B051000
Mouse anti-alpha-actinin antibody Sigma A7811
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody Thermo Fisher A21121

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Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).

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