This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.
Kültürlenmiş kardiyomiyositlerde vivo sistemler tamamlayıcı olan teknikler kullanılarak kardiyomiyosit biyolojisi okumak için kullanılabilir. Örneğin, in vitro kültür saflığı ve erişilebilirlik biyokimyasal analizler, canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji üzerinde hassas kontrol sağlar. kardiyomiyositlerinin uzun süreli kültür kısa vadeli kültürlerde tamamlanamaz ek deneysel yaklaşımlara erişim imkanı sunmaktadır. Örneğin, dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesinin in vitro soruşturma şimdiye kadar büyük ölçüde uzun vadeli kültüründe daha sağlam gibi görünen sıçan kardiyomiyositlerde, sınırlı olmuştur. Ancak, transgenik fare hatları ve iyi gelişmiş hastalık modellerinde zengin bir araç seti durumu kalp araştırma için fare sistemleri cazip kılmaktadır. çeşitli raporlar yetişkin fare kardiyomiyosit izolasyon bulunmasına rağmen, az sayıda çalışma uzun vadeli kültürünü göstermektedir. Burada yer alan, bir adım adım bir yöntemdiryetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun süreli kültür. İlk olarak, retrograd Langendorff perfüzyonu etkin gravite sedimantasyon, ardından arıtma için proteazlarla kalp sindirimi için kullanılır. farksızlaşma Aşağıdaki izolasyon bir süre sonra, hücreler giderek kültür tutunur ve hafta içinde kültürlenebilir. Adenovirüs, hücre lisatı etkin izole kardiyomiyositlerde transduse etmek için kullanılır. Bu yöntemler kalp biyoloji okumak için basit, ama güçlü bir model sistemi sağlar.
Kültürlü kardiyomiyositlerde sıklıkla in vitro iyi kontrollü bir ortamda hücre davranışlarını izlemek için kullanılır. Örneğin, morfolojik, elektrik, biyokimyasal veya mekanik hücre özellikleri, oluşturulmuş ortam içinde 1,2 ve küçük moleküllü ilaçlar, peptid, gen düzenlenmesi, 3 ya da elektriksel uyarıya tepki olarak tasarlanmış substratlar üzerinde incelenebilir. 4, hücresel içeriği olabilir Ayrıca, tanımlanan eş-kültür ile kontrol edilebilir. 5 Bu in vitro deneyler, büyük ilaç ya da genetik ekranlar yararlıdır ve kardiyomiyosit biyoloji içeren araştırmalar çeşitli in vivo yöntemlerinde tamamlar.
Uzun süreli kültür fenotipik değişim elde etmek için zaman uzun zaman gerektirebilir deneysel yollar sağlar. Zamanında bir örnek olduğunu dediferansiyasyon hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi genellikle üzerinde çalışılan se Erişkin memeli kardiyomiyosit çoğalması, biridirhaftaya veral gün. Burada 6,7, uzun kültür süresi, genetik manipülasyon, 7,8 işlevsel farklılaşma bozukluğunun (örneğin, sarkomerik demontaj) 9 ve potansiyel transkripsiyon dediferansiyonunu kolaylaştırır. 6 sonraki hücre döngüsü yeniden giriş ve hücre bölünmesi daha uzun kültür dönemleri gerektirmektedir bölünme birden mermi deneysel hedef, özellikle gözlemlemek. Kardiyomiyosit hücre döngüsünün önemi önceden mevcut kardiyomiyositlerinin farksızlaşma ve çoğalması zebrabalıkları ve neonatal farelerde kalp rejenerasyon sorumlu gösterilmiştir kalp rejenerasyon, birkaç yeni anahtar bilimsel çalışmalar için merkezi. 10-12 Böylece, olasılık memeli yetişkin kardiyomiyositlerde farksızlaşma ve hücre döngüsü yeniden giriş uyarmak için insan kalbi rejenerasyon 13-15 anahtar soruyu kalır
Ben n memeli kardiyo hücre döngüsünü okuyan in vitro deneylermiyositler ağırlıklı nedeni fare modelleri ile karşılaştırıldığında uzun dönem kültür göreceli kolaylığı, sıçan kaynakları kullanılmıştır. 16 Bununla birlikte, faregiller sistemlerinin her ikisi de, in vitro ve in vivo olarak yararlı olan, iyi karakterize transjenik araçları ve hastalık modellerinde zengin bir kaynak sunar protokoller. Örneğin, Cre tabanlı soy izleme in vivo yenidoğan fare kalbinde miyokard rejenere kaynağı olarak önceden varolan kardiyomiyositlerinin belirlenmesini sağladı. Soy-takip yenidoğan fare kardiyomiyositlerde 12 In vitro çalışmalar stromal ile etkileşimlerin inceleme sağlamıştır fibroblastlar ile ko-kültür yoluyla hücreler. 5 Ancak, onun zorluklar nedeniyle, 17 birkaç rapor yetişkin fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu ve uzun vadeli kültürü var. 18,19
yalnız kısa süreli kültür için geçerli yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu zor bir görev olduğu bilinmektedir. Bu protocol kısa vadeli hem de uzun vadeli soruşturma hem de kullanılabilir yetişkin farelerin canlı kardiyomiyositlerde ulaşmak için nasıl adım adım yönergeler sağlar. Bu protokolü kullanılarak izole kardiyomiyositlerde verimli adenoviral vektörlerin hafta boyunca 20,21 ve kültürlü kalıt edilebilir. Bu yöntemler, in vitro kardiyomiyosit biyolojisi okumak için güçlü sistem sağlar.
Burada tarif edilen yöntemler Langendorff retrograd perfüzyon varyasyonları kullanarak önceki eserlerinden çeşitli unsurları dayanmaktadır. 18,22 birkaç protokoller kısa süreli kültür ve çalışma, 23-25 avantajı için yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu yayınlanan olmasına rağmen Bu protokol kültürüne yeteneği izole kardiyomiyositlerde uzun vadeli olduğunu. Bu ektopik gen ekspresyonunu içeren ve hücre yeniden programlama stratejileri gibi uzun süreler gerektiren hücresel süreçlerin çalışmasında yararlı olacaktır.
İzole kardiyomiyositlerinin genel sağlık Bu protokolün birkaç önemli yönlerini bağlıdır. İlk olarak, perfüzyon kalp çıkartılmasından süresi önemli ve 5 dakika veya daha kısa sürede yapılmalıdır. Kalsiyum çıkarılması hücre-hücre etkileşimleri ayırmak yardımcı olur, ancak negatif hücre sağlığı uzun vadeli etkileyebilir. 29-32 Böylece, bu yeterli EGTA tarafından perfüzyon ilk birkaç dakika boyunca kalsiyum kaldırmak için (etilen glikol tetraasetik asit) şelasyon bulma…
The authors have nothing to disclose.
Bu proje (Sandler Vakfı tarafından kısmen finanse edilen) Atılım Biyomedikal Araştırma UCSF Programı, Bağımsızlık Ödülü NIH Pathway (R00HL114738) ve Edward Mallinckrodt Jr Vakfı tarafından finanse edildi. JJ NIH (T32HL007731) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Yazarlar mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir, bu işin, içeriklerinden sorumludur.
Equipment | |||
Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
NaCl | Sigma | S9888 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
Na2HPO4-7H2O | Fisher | S25837 | |
MgSO4-7H2O | Fisher | S25414 | |
Taurine | Sigma | 86329 | |
Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
HEPES | Fisher | BP310100 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
EGTA | Amresco | 0732-288 | |
Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
MEM | Corning | 15-010-CV | |
FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
Lab tape | VWR | 89097-990 | |
Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |