Summary

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Published: June 10, 2016
doi:

Summary

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

Abstract

גזע ובתאים מהלבלב המבוגר יכולים להיות מקור פוטנציאלי של תאי בטא דמוי טיפולי לטיפול בחולי סוכרת מסוג 1. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם תאי גזע מולידם להתקיים בלבלב המבוגר. אסטרטגיות מחקר באמצעות-לקס cre שושלת-התחקות בעכברים בוגרים הניבו תוצאות כי גם תמיכה או להפריך את הרעיון כי תאי הבטא ניתן להפיק מן הצינורות, מיקומו המשוער שבו אבות לבלב מבוגרים עשויים להימצא. Vivo ב אלה שיטות cre-לקס התחקות השושלת, לעומת זאת, לא יכול לענות על השאלות של התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב השושלת צורך להגדיר תא גזע. כדי להתחיל פונה פער הטכני הזה, אנחנו ממציאים מבחני מושבה 3 ממדים עבור אבות לבלב. זמן קצר לאחר הפרסום הראשוני שלנו, מעבדות אחרות שפותחו באופן עצמאי דומה, אך לא זהה, שיטה המכונית assay organoid. בהשוואה assay organoid, השיטה שלנו מעסיקהmethylcellulose, המהווה פתרונות צמיגים המאפשרים הכללת החלבונים תאים מטריקס בריכוזים נמוכים. המבחנים המכיל methylcellulose להתיר זיהוי קל וניתוחים של ובתאים ברמת התא בודד, אשר הם קריטיים כאשר אבות מהווים אוכלוסייה-משנה קטן, כמו במקרה של תאי גזע איבר רבים מבוגר. יחד, תוצאות מכמה מעבדות להפגין במבחנת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאים דמויים לבלב מעכברים. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים שני מבחני מושבה מבוסס methylcellulose לאפיין אבות לבלב עכבר; אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבונים תאי מטריקס murine והשני חלבון תאי מטריקס מלאכותי המכונה הידרוג'ל laminin. הטכניקות המוצגות כאן הן 1) דיסוציאציה של הלבלב ומיון של CD133 + Sox9 / EGFP + תאים ductal מעכברים בוגרים, 2) מניפולציה תא בודד של יםתאי orted, 3) מושבה אחת המנתח באמצעות immunostaining qRT-PCR ו כל ההר microfluidic, ו -4) דיסוציאציה של מושבות עיקריות לתוך תא בודד השעיות מחדש ציפוי לתוך מבחני מושבה משני להעריך התחדשות עצמית או בידול.

Introduction

הלבלב מורכב משלוש שושלות תאים עיקריות; תאים acinar להפריש אנזימי עיכול, צינוריות להפריש mucin להדוף פתוגנים ולהעביר אנזימי עיכול כדי במעיים, ותאי האנדוקרינית להפריש הורמונים, כולל אינסולין וגלוקגון, כי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז. במהלך ההתפתחות העוברית של הלבלב, תאי ductal מוקדם הם המקור של ובתאים תלת-עוצמה המסוגל והוליד שלושה שושלות של pancreata של בעלי חיים בוגרים 1,2. מכיוון שתאי גזע ובתאים מבוגרים, כגון תאי גזע ממוח העצם, כבר משמשים בהצלחה לטיפול במגוון מחלות 3, יש עניין רב במציאת תאי הגזע ועל מי שהגה בלבלב המבוגר. אם בידוד מניפולציה של תאי גזע ועל מי שהגה לבלב המבוגרים היו אפשריים, תאים אלה יכולים לשמש לטיפול במחלות כגון סוכרת מסוג 1, שבה תאי מפרישי האינסולין נהרסים על ידי אוטואימוניות.

<p class = "jove_content"> אם ובתאים תלת-עצמה עדיין קיימים צינוריות לבלב מבוגרות לאחר השלמת התפתחות עוברית היא שאלה התווכחה בכבדות בקהילה המדעית. בדיון זה, ושימוש in vivo cre-לקס השושלת-התחקות טכניקות, Inada ועמיתים לעבודה הראו כי תאי ductal בעכברים בוגרים שסומנו בסמן, anhydrase פחמתית השנייה, יכול מעוררים שלוש כל שושלות הלבלב 4. עם זאת, באמצעות סמנים ductal אחרים, כגון HNF1b 5 ו Sox9 2, זה היה להסיק כי תאים ductal אינם המקור העיקרי של תאי בטא בעכברים בוגרים.

לפני מספר שנים, הצענו כי עילת הדיון הנ"ל יכולה להיות בגלל החוסר, בתחום 6,7, של כלי אנליטיים מתאימים שיכול לשמש למדידת התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב שושלת צורך להגדיר תא גזע. טכניקת in vivo cre-לקס התחקות השושלת ציינההנ"ל יכול לספק ראיות קשר הצאצאים-אב ברמת אוכלוסייה. עם זאת, טכניקת התחקות בשושלת זו מוגבלת שביכולתה כדי להבחין אם ובתאים יחידים יכולים עצמי לחדש להתמיין שושלות מרובות. ניתוח מתא בודד חשוב כי אם אבות מונו-עוצמה כמה, כל אחד עם פוטנציאל באים ממשפחות שונות, נותחו יחד, הם עשויים להופיע באופן קולקטיבי יש יכולות בידול רב השושלת. בנוסף, תאי גזע הם בדרך כלל אוכלוסיית קטין של איבר בוגר. הפעילות של אוכלוסיית תא קטין יכולה להיות רעולה פנים על ידי האוכלוסייה הגדולה. לכן, תוצאה שלילית ממחקר האוכלוסייה אינה מעידה בהכרח על העדר תאי גזע. לבסוף, מעקב שושלת-לקס cre אינו מאפשר כרגע המדידה עצמית והתחדשות.

כדי להתחיל בהתמודדות טכנית הפער בתחום ביולוגיה של התא ובתאים הלבלב, המושבה 7-11 או organoid 12-15 </suמבחני p> באמצעות מערכות תרבות 3D תוכננו. שני מבחני מושבה עבור אבות לבלב פותחו במעבדה שלנו: אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבוני מטריקס murine התאיים (ECM) (ראה שיטות וציוד טבלה), והשני מכיל הידרוג'ל laminin, חלבון ECM מלאכותי מוגדר 7-11. ובתאים מעורבבים methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק. Methylcellulose הוא חומר אינרטי וצמיג ביולוגית מוכן סיבי עץ, ויש בו נעשה שימוש באופן שגרתי מבחני המושבה hematopoietic 16. את methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק מגביל את תנועתם של ובתאים יחידים, כך שהם לא יכולים מחדש המצרפי. עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תאים ובתאים לגדול להתמיין מושבה של תאים בחלל 3D. בהמשך למסורת של המטולוגים, תא ובתאים הלבלב כי היה מסוגל והוליד מושבה של תאים היה nאמד יחידת המושבה יוצרי הלבלב (PCFU). PCFUs, כאשר גדל ב assay המושבה ECM המכיל בעכברים, להצמיח מושבות פיברוזיס ששמם "טבעת" מושבות 7. עם תוספת של אגוניסט Wnt, R-spondin1, לתוך תרבות ECM המכיל בעכברים, כמה מושבות טבעת לההפך "צפוף" מושבות 7. במאמר זה, אלה שני סוגי מושבות הגדלים בתרבית ECM בעכברים הם יכונו "טבעת / צפופות" מושבות. כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבויות המכילות הידרוג'ל laminin, "האנדוקרינית / acinar" מושבות נוצרות 7.

שימוש יחיד מושבה ניתוחית, נמצא כי רוב מושבות טבעת / סמיך האנדוקרינית / acinar, או ממבוגר (2-4 בן חודש) 7,11 או צעיר (1 שבועות בן) 9 לבלב בעכברים, לבטא את כל השלושה סמני שושלת. הדבר מצביע על כך שרוב PCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. ב assay מושבת ECM המכיל בעכברים, PCFUs בעכברים הבוגר וחסון עצמי לחדש ולהרחיב כ -500,000 פעמים מעל 11 שבועות בתרבות 7. ECM Murine מועדף תומך התמיינות של תאים ductal על שושלות האנדוקרינית acinar, ואילו בנוכחות הידרוג'ל laminin, PCFUs murine מעודדים להבדיל מועדף לתאי האנדוקרינית acinar ופחות אל שושלת ductal 7,9,11. חשוב לציין, אינסולין + גלוקגון תאי-הורמונלית מונתה נוצר בתרבות הידרוג'ל laminin ולהפריש אינסולין בתגובה לגלוקוז גירוי במבחנה 7,9, דבר המצביע על בגרות פונקציונלית. הבידול תלת-השושלת 7,9 פוטנציאל ההתחדשות עצמית 11 של PCFUs הבודד אושר על ידי המיקרומניפולציה תא בודד, כלומר, culturing תא אחד לכל טוב עבור היווצרות מושבה. יחד, תוצאות אלו מספקים ראיות שיש עצמית חידוש,-poten תלתt, דמויי תאים ובתאים בלבלב בעכברים לאחר הלידה המציגות פעילויות בתרבות 3D.

מבחני PCFU murine המתואר במאמר זה לקוחים מתוך assay המושבה לפני המיועד ובתאים הבדיל מתאי גזע עובריים בעכברים (mESCs) 17. פרוטוקול זה מתועד בפירוט אחר פרסום יופיטר 18. הרכיבים וטכניקות התרבות נדרשו לבצע את assay מושבת ECM המכיל בעכברים עבור PCFUs המבוגר זהים עבור אבות נגזרות המסקלין 17,18. לכן, היבטים אלה של assay לא יחזור על עצמו כאן; במקום הנהלים הבאים יטופלו: 1) דיסוציאציה של הלבלב מבוגר ומיון תאים CD133 + Sox9 / EGFP + ductal, המעשירים PCFUs מעכברים בוגרים 7, 2) מניפולציה תא בודד של תאים ממוינים, 3)-מושבה אחת מנתח באמצעות qRT-PCR ו כל הר immunostaining, ו -4) דיסוציאציה של Colonie microfluidicים לתוך ההשעיה תא בודד מחדש ציפוי לתוך ECM בעכברים או מבחני המושבה הידרוג'ל laminin.

Protocol

הצהרה אתית: אנו דבקי הסטנדרטים האתיים מקובל מחקר כדי להבטיח את האיכות ואת היושרה של התוצאות. ניסויים בבעלי חיים נערכים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש ב העיר של תקווה. 1. כן השעית תא בודד מתוך למבוגרים Murin…

Representative Results

ניתן להעשיר תאי בוגרים ובתאי לבלב על ידי מיון תא מופעל קרינה (איור 1). שורת העכבר המהונדס Sox9 / EGFP משמשת כאן נוצרה הראשונה כתוצאה של פרויקט אטלס מוח GENSAT 19, ואת כתב EGFP נמצא תחת השליטה של כרומוזום חיידקים מלאכותי המכיל ~ 75 kb במעלה או ~ 150 kb רצפ?…

Discussion

מבחני מושבת לבלב המושבה אחת ניתוחי המתואר כאן נוצרו בהשראת מבחני מושבת hematopoietic המכיל methylcellulose אשר שחקו תפקיד מכריע בפענוח הביולוגיה של תאי אבות היווצרות דם בעשורים האחרונים 23. מבחנים אלה (איור 5), תאים ניתקים לבלב הם מצופים לתוך methylcellulose המכיל תקשורת חצ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לוסי בראון ואלכסנדר Spalla מהליבה Cytometry האנליטי של עיר של תקווה עבור סיוע במיון. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך ממכון ג'ייקובס יוסף י להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן קרן אוקסנרד ואלה פיצג'רלד קרן כדי HTK גם הודתה בהכרת תודה.

מימון: עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך מן יוסף י ג'ייקובסמכון להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן אוקסנרד קרן ואלה פיצג'רלד קרן כדי HTK גם הודו בהכרת תודה. מחקר מדווח בפרסום זה כלל את עבודות שבוצעו Core ההדמיה הדיגיטלי המיקרוסקופי Core Cytometry אנליטית האור הנתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30CA33572.

מחקר חסות: נותן החסות לא להשתתף בעיצוב המחקר, איסוף, ניתוח, או פרשנות של נתונים.

Materials

Murine ECM proteins (Matrigel) Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 354230 Stock kept at -20oC
Laminin Hydrogel Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) Stock kept at -20oC
Methylcellulose Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) 1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Mediatech (Manassas, VA, USA) 21-031-CV
Phosphate Buffered Saline Gibco (Grand Island, NY, USA) 15070-063
50mL Flacon Conical vial Corning Inc. (Corning, NY, USA) 352070
100mmx20mm Suspension culture dish Corning Inc. (Corning, NY, USA) 430591
Bovine Serum Albumin Sigma (St. Louis, MO, USA) A8412
Penicillin/Streptomycin Gibco (Grand Island, NY, USA) 15070-063
DNase1 Calbiochem (Darmstadt, Germany) 260913
Collagenase B Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) 11088831001 Stock kept at -20oC
Anti-mouse CD16/32 Biolegend (San Diego, CA, USA) 101310 low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control Biolegend (San Diego, CA, USA) 400522
Rat IgG1 κ Isotype Control eBioscience (San Diego, CA, USA) 13-4301-82
Anti-CD133-Biotin eBioscience (San Diego, CA, USA) 13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7 Biolegend (San Diego, CA, USA) 113812
Streptavidin-Allophycocyanin Biolegend (San Diego, CA, USA) 405207
4',6-Diamidino-2-phenylindole Invitrogen (Waltham, MA,  USA) 3571 Stock kept at -20oC
Anti-mucin 1 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Mediatech(Manassas, VA, USA) 10-092-CV
Fetal Bovine Serum Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) 101 Stock kept at -20oC
Tris Ethylenediaminetetraacetic acid TEKnova (Hollister, CA, USA) T0221
Rneasy Micro Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 74004
QuantiTec Reverse Transcription Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) 11753-100
Paraformaldehyde Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) SC-281692
Goat serum Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 005-000-121 Stock kept at -20oC
Donkey serum Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 0017-000-121 Stock kept at -20oC
Triton X-100 Sigma (St. Louis, MO, USA) T9284
Trypsin Sigma (St. Louis, MO, USA) T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen (Waltham, MA,  USA) 15575-020
Trypsin-EDTA Life Technologies (Waltham, MA, USA) 25200-056
Sterile Water Gibco (Grand Island, NY, USA) 15230-147 Molecular biology grade
Pasteur Pipette Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 13-678-8B
40um Filter Mesh Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 08-771-1
70 um filter mesh Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 08-771-2
TC Plate 96 Well Suspension Sarstedt 83.3924 (Previously 83.1835)
1cc Syringe Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 309659
10cc Syringe Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 301604
48.48 Dyanmic Array Chip Fluidigm (San Francisco, CA, USA) BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm (San Francisco, CA, USA) 85000800
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) 4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate Sigma (St. Louis, MO, USA) P7949
Glass Bottom Dish MatTek (Ashland, MA, USA) P35G-1.5-14-C 35 mm petri dish with glass bottom
Mouth Piece/ Rubber Tubing Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) MP-SET
Nicotinamide Sigma (St. Louis, MO, USA) N0636 Stock kept at -20oC
Vascular Endothelial Growth Factor R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 293-VE Stock kept at -80oC
Activin B R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 659-AB Stock kept at -80oC
Extendin 4 Sigma (St. Louis, MO, USA) E7144 Stock kept at -20oC
Rspondin-1 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 3474-RS Stock kept at -80oC
Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube Corning Inc. (Corning, NY, USA) 352054
PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2 Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 305196
PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2 Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate  Corning Inc. (Corning, NY, USA) 3473
Costar 96 Black Well Plate Corning Inc. (Corning, NY, USA) 3603 Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD  Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell Sorter Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)

References

  1. Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
  2. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  3. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
  4. Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
  5. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  6. Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells–recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
  7. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  8. Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
  9. Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
  10. Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
  11. Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  12. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
  13. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  14. Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
  15. Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
  16. Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
  17. Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
  18. Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
  19. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  20. Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
  21. Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
  22. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
  23. Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
  24. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  25. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
  26. Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
  27. Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).

Play Video

Cite This Article
Tremblay, J. R., LeBon, J. M., Luo, A., Quijano, J. C., Wedeken, L., Jou, K., Riggs, A. D., Tirrell, D. A., Ku, H. T. In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas. J. Vis. Exp. (112), e54016, doi:10.3791/54016 (2016).

View Video