Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.
Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste orsaken till sjuklighet och dödlighet i världen, inklusive USA, där den står för över 780.000 dödsfall årligen. 1 Kranskärls förkalkning och aorta förkalkning är kännetecken av aterosklerotisk sjukdom och fungerar som starka prediktorer för kardiovaskulära händelser. 2- 4 Två huvudtyper av vaskulär förkalkning har rapporterats hos vuxna: intima förkalkning, i samband med ateroskleros och mediala (även känd som Mönckeberg) förkalkning associerad med kronisk njursjukdom och diabetes 5 intimal förkalkning sker i fastställandet av lipidackumulering och makrofager. infiltration i kärlväggen. 5,6 Medial vägg förkalkning sker oberoende av intimal förkalkning, lokaliserar till elastinfibrer eller glatta muskelceller, och är inte associerat med lipid nedfall eller makrofaginfiltration. 5,7,8 Studier på de molekylära mekanismerna förvaskulär förkalkning har förlitat sig på cellbaserade och djurmodellsystem. Gnagarmodeller för atherocalcific sjukdom inkluderar möss som saknar antingen apolipoprotein E (ApoE) 9,10 eller low-density lipoprotein-receptor (LDLR) 11 matas en fettrik kost, medan modeller för medial förkalkning inkluderar möss med matrix Gla protein (MGP) brist 12 eller råttor som utvecklar uremi antingen genom nästan total nefrektomi (den 5/6. nefrektomi modell) eller genom exponering för en hög-adenin diet. 13
Här är en modell av mediala vaskulär förkalkning i samband med MGP brist fokuserat på. MGP är ett extracellulärt protein som inhiberar arteriell förkalkning. 12 Mutationer i MGP-genen har identifierats i Keutel syndrom, en sällsynt sjukdom hos människor som kännetecknas av diffus brosk förkalkning förutom brachytelephalangy, hörselnedsättning, och perifer pulmonell stenos. 14-18 Även om det inte observeras ofta, 19koncentriska förkalkning av flera artärer har beskrivits i Keutel syndrom. 20 Vanliga polymorfismer i den humana MGP-genen är förknippade med ökad risk för kranskärls förkalkning, 21-23 medan högre cirkulerande nivåer av uncarboxylated, biologiskt inaktiva MGP förutsäga kardiovaskulär mortalitet. 24 Till skillnad från människor med Keutel syndrom, MGP-brist möss utvecklar en allvarlig vaskulär fenotyp bestående av spontan utbredd åderförkalkning börjar vid två veckors ålder och dör 6-8 veckor efter födseln på grund av aorta bristning. 12
Till skillnad från ApoE – / – och LDLR – / – möss som utfodrats en fettrik kost, som utvecklar intima vaskulär förkalkning med tillhörande makrofag-inducerad inflammation, MGP – / -. Möss utvecklar medial vaskulär förkalkning i frånvaro av makrofaginfiltration 11,25 Även dessa fynd tyder på olika underliggande stimuli för intimal och medial förkalkning, det finns en överlappning i de signalmekanismer som förmedlar båda formerna av förkalkning. 26 Flera signalvägar har identifierats som bidrar till vaskulär förkalkning inklusive inflammatoriska mediatorer, såsom tumörnekrosfaktor-α och IL-1 och pro-osteogena faktorer såsom Notch, Wnt, och benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering. 27,28 Dessa signaleringsvägar öka expression av transkriptionsfaktorer runt relaterade transkriptionsfaktor 2 (Runx2) och osterix, vilket i sin tur ökar expression av benrelaterade proteiner ( . t.ex. osteokalcin, sclerostin och alkalinfosfatas) i kärlsystemet som förmedlar förkalkning 28-30 Vi och andra har visat att vaskulär förkalkning observerades i ApoE – / – och LDLR – / – möss som utfodrats en fettrik kost och den spontana vaskulär förkalkning observerades i MGP – / – möss är alla beroende av benmorfogenetiskt protein (BMP) signaling, och det är denna väg som är inriktad på här. 11,25,31 BMPs är potenta osteogena faktorer som krävs för benbildning och är kända att uppvisa ökat uttryck i human ateroskleros. 32-34 In vitro studier har blandat in BMP-signalering i att reglera uttrycket av osteogena faktorer såsom Runx2. 35-37 uttryck~~POS=HEADCOMP av BMP-liganden, BMP-2, påskyndar utvecklingen av vaskulär förkalkning i ApoE-brist möss livnärde en fettrik kost. 38 Vidare användning av särskilda BMP signalering hämmare sådana som LDN-193.189 (LDN) 39,40 och / eller ALK3-Fc hindrar utvecklingen av vaskulär förkalkning i både LDLR – / – möss som utfodrats en fettrik kost och MGP-brist möss 11,25.
Vaskulära glatta muskelceller (VSMC) har en avgörande roll i utvecklingen av vaskulär förkalkning. 30,41,42 Den mediala kärl förkalkning som utvecklas i MGP-brist möss är kännetecknas av en transdifferentiering av VSMC till en osteogen fenotyp. Förlust av MGP resulterar i minskat uttryck av VSMC markörer inklusive myocardin och alfa glatt muskulatur aktin, med en åtföljande ökning av osteogena markörer som Runx2 och osteopontin. Dessa förändringar sammanfaller med utvecklingen av vaskulär förkalkning. 25,43,44
Aorta förkalkning och inflammation i möss normalt bedöms att använda histokemiska tekniker såsom alkalisk fosfatasaktivitet för tidig förkalkning och osteogen aktivitet, von Kossa och Alizarin röd färgning för sent förkalkning, och immunohistokemiska protokoll som riktar makrofag proteinmarkörer (t ex., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 dessa standardavbildningstekniker kräver behandling av aortavävnader i tvärsnitt, vilket är tidskrävande och ofullkomliga som beror på urvalet bias, och är begränsade i sin förmågan att kvantifiera inflammation och calcificatjon i hela aorta. Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera och kvantifiera hela aorta och medelstora åderförkalkning och makrofager ackumulering utnyttjar nära infraröda fluorescerande (NIR) molecular imaging ex vivo. Vidare tillhandahålles en metod för att skörda och odling primära aorta VSMC från möss och inducera förkalkning av murina och humana VSMC in vitro för att bestämma de molekylära mekanismerna bakom vaskulär förkalkning. Dessa tekniker ger utredaren med både in vivo och in vitro metoder för att studera atherocalcific sjukdom.
Åderförkalkning är en viktig riskfaktor för kardiovaskulär sjukdom hos människor och kan direkt bidra till patogenesen av kardiovaskulära händelser. 1,5,52 Intimal kalcium nedfall i de tunna fiber lock av aterosklerotisk sjukdom har föreslagits att öka den lokala biomekaniska stress och bidra till plackbristning. 53,54 Medial förkalkning effekter kliniska resultat genom att öka artärstelhet, som kan framkalla hjärthypertrofi och påverka hjärtfunktionen. 55 Därför att f?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
30 G needle | BD | 305106 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
Elastase | Sigma | E1250 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
Micro-dissecting spring scissors (13mm) | Roboz | RS-5676 | |
Micro-dissecting spring scissors (3mm) | Roboz | RS-5610 | |
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
Tissue culture plate (35mm x 10mm) | Falcon | 353001 | |
Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |