Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.
Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والأمراض في العالم، بما في ذلك الولايات المتحدة حيث تمثل ما يزيد عن 780،000 حالة وفاة سنويا. 1 التاجي تكلس الشرايين وتكلس الأبهر هي السمات المميزة لمرض تصلب الشرايين ويعمل تنبؤ قوية اعتبارا من أحداث القلب والأوعية الدموية. 2- تم الإبلاغ عن 4 نوعان رئيسيان من تكلس الأوعية الدموية لدى البالغين: تكلس باطنة، يرتبط مع تصلب الشرايين، وسطي (المعروف أيضا باسم منكيبيرغ) تكلس، ويرتبط مع مرض الكلى المزمن ومرض السكري يحدث 5 باطنة تكلس في الإعداد لتراكم الدهون والبلاعم. تسلل إلى جدار الوعاء الدموي يحدث 5،6 الإنسي تكلس جدار مستقل عن تكلس باطنة، يموضع للألياف الإيلاستين أو خلايا العضلات الملساء، وغير مقترن ترسب الدهون أو تسلل بلعم. 5،7،8 دراسات عن الآليات الجزيئية لوقد اعتمدت تكلس الأوعية الدموية على أنظمة نموذج قائم على الخلايا والحيوانات. وتشمل نماذج القوارض لمرض atherocalcific الفئران التي تعاني من نقص في أي ئي E (APOE) 9،10 أو منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني (LDLR) 11 تغذت على وجبات عالية الدهون، في حين تشمل نماذج للتكلس وسطي الفئران مع مصفوفة غلا البروتين (مجان) نقص 12 أو الفئران التي تعاني بولينا إما عن طريق استئصال الكلية شبه الكامل (نموذج استئصال الكلية 5/6) أو عن طريق التعرض لاتباع نظام غذائي عالي الأدينين 13
هنا، يركز نموذج من تكلس الأوعية الدموية وسطي المرتبطة نقص مجان جرا. مجان هو بروتين الخلية الذي يمنع تكلس الشرايين. وقد تم تحديد 12 الطفرات في الجين مجان في متلازمة Keutel، وهو مرض يصيب الانسان نادر يتصف تكلس الغضاريف منتشر بالإضافة إلى brachytelephalangy، فقدان السمع، وتضيق الرئوي الطرفية 14-18 على الرغم من عدم كثيرا ما لاحظت، 19وقد وصفت تكلس متحدة المركز الشرايين متعددة في متلازمة Keutel. وترتبط 20 الأشكال الشائعة في الجين مجان البشري مع خطر متزايد للتكلس الشريان التاجي، 21-23 بينما مستويات تداول أعلى من uncarboxylated، مجان غير نشط بيولوجيا تتوقع وفيات القلب والأوعية الدموية. 24 وخلافا للبشر مع متلازمة Keutel والفئران التي تعاني من نقص مجان تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية الشديدة التي تتكون من تلقاء أنفسهم تكلس الشرايين على نطاق واسع ابتداء من اسبوعين من العمر ويموت 6-8 أسابيع بعد الولادة بسبب تمزق الشريان الأورطي. 12
على عكس APOE – / – وLDLR – / – الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون، التي تنمي تكلس الأوعية الدموية باطنة مع المرتبطة التهاب الناجم عن بلعم، مجان – / – الفئران تطوير تكلس الأوعية الدموية وسطي في غياب تسلل بلعم 11،25 وعلى الرغم من وتشير هذه النتائج المحفزات الأساسية مختلفة لintimالقاعدة وتكلس وسطي، وهناك تداخل في آليات الإشارات التي تتوسط كلا أشكال تم تحديدها تكلس 26 مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في تكلس الأوعية الدموية بما في ذلك وسطاء التهابات مثل عامل نخر الورم α و IL-1 والعوامل المؤيدة للالمكونة للعظم مثل الشق، WNT، والبروتين المخلق للعظم (BMP) الإشارة. 27،28 تزيد هذه مسارات إشارات التعبير عن عوامل النسخ المتعلقة قزم عامل النسخ 2 (Runx2) وosterix، والتي بدورها تزيد من التعبير عن البروتينات ذات الصلة العظام ( . على سبيل المثال، أوستيوكالسين، sclerostin، والفوسفاتيز القلوية) في الأوعية الدموية التي تتوسط تكلس 28-30 نحن وغيرنا قد أظهرت أن تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في APOE – / – وLDLR – / – تغذية الفئران حمية عالية الدهون وعفوية تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان – / – الفئران وكلها تعتمد على البروتين المخلق للعظم (BMP) سيgnaling، وأنه هو هذا المسار تركز على هنا. 11،25،31 أفضل الممارسات الإدارية هي العوامل المكونة للعظم قوية المطلوبة لتكوين العظام، ومن المعروف أن تظهر زيادة التعبير في تصلب الشرايين البشرية. وقد تورط 32-34 في الدراسات المختبرية BMP الإشارات في تنظيم التعبير عن العوامل المكونة للعظم مثل Runx2. 35-37 overexpression من يجند BMP، BMP-2، ويسرع تطوير تكلس الأوعية الدموية في الفئران APOE التي تعاني من نقص تغذية نظام غذائي عالي الدهون. 38 وعلاوة على ذلك، فإن استخدام BMP محدد يشير مثبطات مثل هذه كما LDN-193189 (LDN) 39،40 و / أو ALK3-FC يمنع وضع تكلس الأوعية الدموية في كل من LDLR – / – الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون والفئران التي تعاني من نقص مجان 11،25.
الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء (VSMCs) دورا حاسما في تطوير تكلس الأوعية الدموية. 30،41،42 وتكلس الأوعية الدموية وسطي أن يتطور في مجان التي تعاني من نقص الفئران هو characterized من قبل transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. ويؤدي فقدان مجان في التعبير انخفض من علامات VSMC بما في ذلك myocardin وألفا الأكتين العضلات الملساء، مع ما يصاحب ذلك ارتفاع في علامات المكونة للعظم مثل Runx2 وosteopontin. وتتزامن هذه التغيرات مع تطور تكلس الأوعية الدموية. 25،43،44
وعادة ما يتم تقييمها تكلس الشريان الأورطي والتهاب في الفئران باستخدام تقنيات النسيجية مثل نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية للتكلس المبكر والنشاط عظمي المنشأ، فون كوسا والصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر في أواخر تكلس، والبروتوكولات المناعى التي تستهدف علامات البروتين بلعم (على سبيل المثال، CD68، F4 / 80، ماك-1، ماك-2، ماك-3). 9،45 ومع ذلك، هذه التقنيات التصوير القياسية تتطلب معالجة الأنسجة الأبهري في المقاطع العرضية، والتي هي مضيعة للوقت وغير كامل بسبب التحيز لأخذ العينات، وتقتصر في حياتهم القدرة على تحديد الالتهاب وcalcificatايون في الشريان الأورطي كله. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور وتحديد كله الأبهر والمتوسطة تكلس الشرايين وتراكم بلعم باستخدام الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) التصوير الجزيئي خارج الحي. كما قدم هو طريقة للحصاد وزراعة VSMCs الأبهر الأولية من الفئران وتحريض تكلس الفئران وVSMCs البشرية في المختبر من أجل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية تكلس. توفر هذه التقنيات المحقق مع كل من في الحي وفي أساليب المختبر لدراسة مرض atherocalcific.
تكلس الشرايين هو عامل خطر مهم للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في البشر ويمكن أن تسهم بصورة مباشرة في التسبب في أحداث القلب والأوعية الدموية. وقد اقترح 1،5،52 باطنة ترسب الكالسيوم في مباراة دولية ليفية رقيقة من مرض تصلب الشرايين لزيادة التوتر النشاط الحيوي…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB and TET), the Howard Hughes Medical Institute (TM), the Ladue Memorial Fellowship Award from Harvard Medical School (DKR), the START-Program of the Faculty of Medicine at RWTH Aachen (MD), the German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), the National Eye Institute (R01EY022746, ESB), the Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signaling in the Pathogenesis of Pulmonary and Systemic Vascular Diseases, PBY, KDB, and DBB), the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01AR057374, PBY), the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK082971, KDB and DBB), the American Heart Association Fellow-to-Faculty Award #11FTF7290032 (RM), and the National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL114805 and R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
30 G needle | BD | 305106 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | SAB2500963 | |
Chamber slide | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004176 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
Elastase | Sigma | E1250 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
Forceps, fine point | Roboz | RS-4972 | |
Forceps, full curve serrated | Roboz | RS-5138 | |
Formalin (10%) | Electron Microscopy Sciences | 15740 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
Human coronary artery smooth muscle cells | PromoCell | C-12511 | |
Insulin syringe with needle | Terumo | SS30M2913 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A-7506 | |
Micro-dissecting spring scissors (13mm) | Roboz | RS-5676 | |
Micro-dissecting spring scissors (3mm) | Roboz | RS-5610 | |
NIR, cathepsin (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Normal Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
Nuclear fast red | Sigma-Aldrich | N3020 | |
Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
Silver nitrate (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
Sodium thiosulfate | Sigma | S-1648 | |
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma | G9422 | |
Tissue culture flask, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
Tissue culture plate (35mm x 10mm) | Falcon | 353001 | |
Tissue culture plate, six-well | Falcon | 353046 | |
Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
Tube rodent holder | Kent Scientific | RSTR551 | |
Vacuum-driven filtration system | Millipore | SCGP00525 |