Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Forkalkning af vaskulære glatte muskelceller og billeddannelse af aorta Forkalkning og Inflammation

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjerte-kar-sygdom er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed i verden, herunder USA, hvor den tegner sig for mere end 780,000 dødsfald årligt. 1 koronararterie forkalkning og aorta forkalkning er kendetegnende for aterosklerotisk sygdom og tjene som stærke prædiktorer for kardiovaskulære hændelser. 2- 4 To hovedtyper af vaskulær forkalkning er blevet rapporteret hos voksne: intima forkalkning, der er forbundet med åreforkalkning, og mediale (også kendt som Mönckeberg) forkalkning, der er forbundet med kronisk nyresygdom og diabetes fem af intima forkalkning sker i fastsættelsen af lipid ophobning og makrofag. infiltration i karvæggen. 5,6 Medial væg forkalkning sker uafhængigt af intimal forkalkning, lokaliseres til elastin fibre eller glatte muskelceller, og er ikke forbundet med lipidafsætning eller makrofag infiltration. 5,7,8 Undersøgelser på de molekylære mekanismer ivaskulær forkalkning har påberåbt sig cellebaserede og dyr modelsystemer. Gnavermodeller for atherocalcific sygdom omfatter mus deficiente i enten apolipoprotein E (ApoE) 9,10 eller low-density lipoprotein receptor (LDLR) 11 tilført en kost med højt fedtindhold, mens modeller for mediale forkalkning indbefatter mus med matrix Gla protein (MGP) mangel 12 eller rotter, der udvikler uræmi enten ved næsten total nefrektomi (5 / 6th nefrektomi modellen) eller ved udsættelse for en høj-adenin kost. 13

Her er modellen af ​​mediale vaskulær kalcifikation forbundet med MGP-mangel fokuseret på. MGP er et ekstracellulært protein, som inhiberer arteriel forkalkning. 12 mutationer i MGP genet er blevet identificeret i Keutel syndrom, en sjælden menneskelig sygdom karakteriseret ved diffus brusk forkalkning udover brachytelephalangy, høretab, og perifer pulmonal stenose. 14-18 Selvom ikke ofte observeret, 19koncentrisk forkalkning af flere arterier er blevet beskrevet i Keutel syndrom. 20 Fælles polymorfier i den humane MGP genet er forbundet med øget risiko for koronar arterie forkalkning, 21-23 mens højere cirkulerende niveauer af uncarboxylated, biologisk inaktivt MGP forudsige kardiovaskulær mortalitet. 24 I modsætning til mennesker med Keutel syndrom, MGP-deficiente mus udvikler en alvorlig vaskulær fænotype bestående af spontan udbredt arteriekalcifikation begyndende ved to ugers alderen og dø 6-8 uger efter fødslen på grund af aorta- brud. 12

I modsætning ApoE - / - og LDLR - / - mus fodret med en kost med højt fedtindhold, som udvikler intimale vaskulær kalcifikation med tilhørende makrofag-induceret inflammation, MGP - / -. Mus udvikler medial vaskulær kalcifikation i fravær af makrofaginfiltration 11,25 Selvom disse resultater tyder forskellige underliggende stimuli til Intimal og mediale forkalkning, der er overlapning i signaleringsmekanismer som medierer begge former for forkalkning. 26 Multiple signalveje er blevet identificeret, der bidrager til vaskulær kalcifikation herunder inflammatoriske mediatorer, såsom tumornekrosefaktor-α og IL-1 og pro-osteogene faktorer såsom Notch, Wnt, og knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering. 27,28 Disse signalveje forøge ekspression af transkriptionsfaktorer runt-relateret transkriptionsfaktor 2 (Runx2) og osterix, som igen øger ekspression af knoglerelaterede proteiner ( . f.eks osteocalcin, sclerostin, og alkalisk phosphatase) i vaskulaturen, der medierer forkalkning 28-30 Vi og andre har vist, at vaskulær kalcifikation observeret i ApoE - / - og LDLR - / - mus fodret med en kost med højt fedtindhold og den spontane vaskulær kalcifikation observeret i MGP - / - mus er alle afhængige af knoglemorfogenetisk protein (BMP) signaling, og det er denne vej, der er fokuseret på her. 11,25,31 BMP'er er potente osteogene faktorer, der kræves for knogledannelse og er kendt for at udvise forøget ekspression i human aterosklerose. 32-34 In vitro-undersøgelser har impliceret BMP-signalering i regulering ekspressionen af osteogene faktorer såsom Runx2. 35-37 Overekspression af BMP ligand, BMP-2, accelererer udviklingen af vaskulær kalcifikation i ApoE-deficiente mus fodret med en diæt med højt fedtindhold. 38 Endvidere er anvendelsen af specifikke BMP signalering inhibitorer, som LDN-193.189 (LDN) 39,40 og / eller alk3-Fc forhindrer udviklingen af vaskulær kalcifikation i både LDLR - / - mus fodret med en kost med højt fedtindhold og MGP-manglende mus 11,25.

Vaskulære glatte muskelceller (VSMC) har en afgørende rolle i udviklingen af vaskulær forkalkning. 30,41,42 Den mediale vaskulær forkalkning der udvikler sig i MGP-mangel mus er karakputerstyret ved en transdifferentiering af VSMC'er til et osteogent fænotype. Tab af MGP resulterer i nedsat ekspression af VSMC markører herunder myocardin og alfa glatmuskelactin, med en samtidig stigning i osteogene markører, såsom Runx2 og osteopontin. Disse ændringer falder sammen med udviklingen af vaskulær kalcifikation. 25,43,44

Aorta forkalkning og inflammation hos mus er typisk vurderet ved anvendelse histokemiske metoder, såsom alkalisk phosphatase aktivitet for tidlig forkalkning og osteogen aktivitet, von Kossa og alizarinrødt farvning for sent forkalkning, og immunohistokemiske protokoller, der er målrettet makrofag proteinmarkører (f.eks., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Men disse standard billeddannende teknikker kræver behandling af aorta væv i tværsnit, hvilket er tidskrævende og ufuldkommen på grund af prøveudtagning bias, og er begrænset i deres evne til at kvantificere inflammation og calcification i hele aorta. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at visualisere og kvantificere hele aorta og mellemstore arteriekalcifikation og makrofag akkumulering udnytte nær-infrarødt fluorescerende (NIR) molekylær billeddannelse ex vivo. Der tilvejebringes også en fremgangsmåde til høstning og dyrkning primære aortiske VSMC fra mus og inducere forkalkning af murine og humane VSMC in vitro for at bestemme de molekylære mekanismer, der ligger vaskulær kalcifikation. Disse teknikker giver investigator med både in vivo og in vitro metoder til at studere atherocalcific sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studier med mus blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Boliger og alle procedurer, der involverer mus er beskrevet i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg af Massachusetts General Hospital (Underudvalget om Forskning Animal Care). Alle procedurer blev udført med omhu for at minimere lidelser.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Near-Infrared Fluorescence Imaging of Whole Aortas
    Bemærk: a. Bisphosphonat-afledt, nær-infrarødt fluorescerende imaging probe kan anvendes til at markere osteogen aktivitet i vaskulaturen ved binding til hydroxyapatit 46,47 En cathepsin-aktiverede fluorescerende imaging probe kan tjene som en markør for makrofag proteolytiske og elastolytisk aktivitet i vaskulaturen. 9 for at muliggøre den samtidige anvendelse af både fluorescerende prober, er det vigtigtat bruge prober, der er spektralt adskilte. Notationen calcium NIR vil blive anvendt til at angive forkalkning-specifikke nær-infrarødt fluorescerende imaging probe og cathepsin NIR at angive cathepsin aktivitetsspecifikke nær-infrarødt fluorescerende billeddannelse probe.
    1. Forbered opløsningerne af calcium NIR og cathepsin NIR. I henhold til producentens protokoller, tilsættes 1,2 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til hætteglasset indeholdende 24 nmol calcium NIR eller cathepsin NIR og rystes forsigtigt.
      Bemærk: Ifølge producenten, når rekonstitueret med PBS, de calcium NIR og cathepsin NIR løsninger forblive stabil i 14 dage ved opbevaring i mørke ved 2-8 ° C.
  2. Isolering og Forkalkning af murint Aorta VSMC
    1. Aorta Fordøjelse Løsning:
      1. Forbered en frisk opløsning (~ 3-5 ml per aorta høstet) med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende 175 U / ml type 2 collagenase og 1,25 U / ml elastase. Sterilisere opløsningen wed et 0,22 um vakuum-drevet filtreringssystem og holde opløsningen på is indtil brug.
    2. Celle Medier:
      1. Supplement 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder / ml penicillin, og 100 ug / ml streptomycin. Varm medierne til 37 ° C før brug.
    3. Forkalkning Medier:
      1. Forkalkning Media A (NaPhos; anvendes i muse cellelinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volumen efter behov) med 10% føtalt bovint serum, 2 mM natriumphosphat, 100 enheder / ml penicillin, og 100 ug / ml streptomycin. Varm medierne til 37 ° C før brug.

          ELLER
      2. Forkalkning Media B (βGP / ASC / DEX; bruges i enten mus eller humane cellelinjer):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volumen efter behov) med 10% føtalt bovint serum, 10 mM β-glycerophosphat-dinatrium, 50 ug / ml L-ascorbinsyre, 10nM dexamethason, 100 enheder / ml penicillin, og 100 ug / ml streptomycin. Varm medierne til 37 ° C før brug.

2. haleveneinjektion

  1. Før hale injektion, varme musene under en mild varmelampe i 5 min.
  2. Begrænse musen i en holder rør gnaver. Desinficer halen med en spritserviet.
  3. Udnyt en 30 G nål til hale vene injektion. Halevenerne er placeret lateralt.
    1. Påfør en blid mængde fremadrettet tryk på sprøjten, når nålen føres frem i halen. Den vene er adgang, når modstanden mod injektionen er ikke længere til stede.
    2. Injicer et volumen på 100 pi calcium NIR og / eller 100 pi cathepsin NIR med en konstant hastighed. Ved afslutningen af ​​injektionen, efter en 5 sek pause, trække nålen.
  4. Høst aorta (se afsnit 3) 3-24 timer efter injektion.

3. Mus Dissektion

  • Aflive mus med en 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital injektion.
  • Læg dyret liggende på dissektion bord og stabilisere ved at tape hver pote til bestyrelsen. Brug af et dissektionsmikroskop og en lille saks, lave en midtlinjeincision strækker sig fra den nedre del af maven til den øvre thorax.
  • Skrælle huden med pincet og fjern peritoneum, afslører abdominale organer. Fjern de gastrointestinale organer, pas på ikke at transektere aorta.
  • Foretag en lateral incision i den forreste membran og fortsætte snittet hen over maven. Brug af dissektion saks, frigive brystkassen ved at skære gennem siderne af ribberne og fjernelse af blødt væv klæbende til den overlegne del af brystbenet. Fjern brystkassen, afslører lungerne.
  • Lad hjertet på plads i begyndelsen (til hjælp med at identificere og dissekere den proksimale aorta) og fjern forsigtigt lungerne. Fjern thymus, luftrør, og spiserøret med omhu, ensuring at aorta forbliver intakt.
  • Brug lige fin pincet og mikro-dissekere saks, fjern det bløde væv omkring aorta fra bækkenforgreningen til aortabuen, meget opmærksom, når du fjerner peri-aorta fedt (figur 1A). Fjern de resterende fedt og blødt væv, der omgiver de store grene af aortabuen (dvs., brachiocephale, carotis communis og subclavia arterier, figur 1 B).
    Bemærk: Det er vigtigt at fjerne fedt fra aorta fordi fedt kan øge baggrundssignalet, når der udføres fluorescensafbildning.
  • Tag hjertet fra brysthulen, omhyggeligt afmontere det fra den proksimale aorta, og kassér. Transekt den distale aorta ved bækkenforgreningen. Ved anvendelse af en insulin nål injiceres normal saltvandsopløsning i aorta fra aortabuen at udvaske resterende blodceller. Tag aorta sammen med aortabuen fartøjer, helt at fjerne detfra kroppen.
  • Placer aorta i normal saltvandsopløsning på is indtil klar til billeddannelse.
  • 4. Aorta Imaging

    1. Billede aorta ex vivo umiddelbart efter høst af nær-infrarød fluorescens reflektans billeddannelse. 25
      1. Indstil fluorescens imager på passende multikanal bølgelængder at kvantificere fluorescens signalintensiteter fra aorta hos calcium NIR og cathepsin NIR-injicerede mus, som tidligere beskrevet. 25 Ifølge producenten, kan calcium NIR exciteres ved ~ 650-678 nm lys med en maksimal emission på ~ 680-700 nm. Cathepsin NIR kan ophidset af ~ 745-750 nm lys med en maksimal emission ved ~ 770 nm.

    5. Isolering af primære murine Aorta Vaskulære glatte muskelceller

    1. Udfør trin 3,1-3,7 som beskrevet ovenfor.
    2. Placer aorta i koldt HBSS indtil dissektioner er fuldført. Skær forsigtigt væk enhver remaining periaortic fedt og blødt væv, så kun aorta.
    3. Under en steril vævskultur hætte, overføre aorta til aorta Digestion Solution i 35 mm x 10 mm vævskulturskåle. Sted i en inkubator ved 37 ° C i 30 minutter under forsigtig intermitterende vuggende. Efter fordøjelse, aorta udviser en strakt eller flosset udseende.
    4. Med dissektion mikroskop og steril pincet, fjern den ydre adventitiale lag af aorta og samtidig holde den mediale lag intakt. En teknik til fjernelse adventitia er at skrælle væk det ydre lag af aorta i den ene ende og fjerne den fra det underliggende mediale lag som en sok kan skrælles tilbage og fjernes.
    5. Når adventitiale lag er blevet fjernet, placeres de resterende aorta til en ny vævskulturskål med celledyrkningsmedier og opbevares ved 37 ° C med 5% CO2 i 2-4 timer.
    6. Under en steril hætte og bruge sterile 3 mm mikro-dissektion saks, klippe aorta i 1-2 mm brederinge.
    7. Placer disse ringe i en ny vævskulturskål med aorta Digestion Solution og inkuberes ved 37 ° C med forsigtig intermitterende rocking i 120 minutter. Pipetteres opløsningen op og ned flere gange under denne inkubation for at resuspendere cellerne.
    8. Der tilsættes 5 ml varm celledyrkningsmedier til fordøjelsen opløsning og overføres til et 15 ml konisk rør.
    9. Centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g.
    10. Aspireres medierne og resuspender cellerne i det ønskede volumen af celledyrkningsmedier (f.eks 5 ml).
    11. Plate hele mængden af isolerede celler fra hvert aorta i en 25 cm 2 cellekultur kolbe og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2. Udbrede celler ved anvendelse af standardteknikker, som beskrevet tidligere. 25,48 I de første 7-10 dages inkubation ændre medierne hver 72-96 time. Efterhånden som cellerne nærmer konfluens, genopbygge medier oftere (hver 48 timer).
      Bemærk: Det kan tage mange uger at vokse en tilstrækkelig betingelseNTITY af celler.
    12. Når sammenflydende, passage celler med trypsin, der er opvarmet til 37 ° C.
      1. Tilsættes 0,5-1,0 ml trypsin til hver kultur kolbe og inkuberes i 3-5 min; bankes let på siden af ​​kolben hver 30-60 sek efter behov for at frigøre celler fra overfladen.
      2. Når cellerne løsnes fra kolbens bund, der tilsættes 10 ml celle medier til cellerne i trypsin. Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 5 min. Aspireres medierne og trypsin fra cellepelleten. Resuspender cellerne i den ønskede mængde frisk celle medier (f.eks, 5-10 ml) og overføres til en ny kolbe (med nogle celler overføres til et kammer objektglas).
    13. Ved den første passage af celler, bekræfter glatte muskelceller afstamning med standard immuncytokemi teknikker, som tidligere beskrevet, 49 under anvendelse af et antistof rettet mod α-glatmuskelactin.

    6. inducerende Forkalkning af dyrkede glatte muskulaturCeller

    1. Plate celler opnået fra 5,12 i en 6-brønds format. Bemærk: Begyndende med 1 x 10 5 celler / brønd i et samlet volumen på 2,0 ml cellemedier pr anbefales godt.
    2. Tillad celler til at vokse i Forkalkning Media A eller B i mindst 7 dage i en 6-brønds pladeformat. Cellerne inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
    3. Skift celle medier hver 48 timer.

    7. Vurdering af VSMC Forkalkning Brug af von Kossa Staining Method

    Bemærk:. Von Kossa metode til måling ekstracellulær matrix forkalkning af væv eller dyrkede celler er baseret på substitution af fosfat-bundne calciumioner med sølvioner 50 I nærværelse af lette og organiske forbindelser, er sølvionerne reduceret og visualiseres som metallisk sølv. Eventuelt uomsat sølv fjernes ved behandling med natriumthiosulfat 50 Protokollen for von Kossa-farvning er som følger.:

    1. Aspirer medier fra celle culture plader.
    2. Fix celler ved at anbringe dem i 1 ml 10% formalin ved stuetemperatur i 20 min.
    3. Fjern formalin og vask fikserede celler med destilleret vand i 5 minutter.
    4. Cellerne inkuberes i 1 ml 5% sølvnitratopløsning under en 60-100 W pære til 1-2 timer.
    5. Aspirer sølvnitratopløsning og vask med destilleret vand i 5 min.
    6. Fjerne uomsat sølv ved anbringelse af cellerne i 1 ml 5% natriumthiosulfat (w / v) opløsning i destilleret vand i 5 minutter.
    7. Skyl celler med destilleret vand i 5 minutter. Gentag vasker 3x. Von Kossa pletten er klar til billeddannelse med standard inverteret lysmikroskop.
    8. Eventuelt trin: modfarve med 1 ml af nuklear fast red i 5 minutter. Følge dette med tre vaske med destilleret vand (5 min hver).

    ELLER

    8. Vurdering VSMC Forkalkning med Near-infrarød Fluorescent Imaging

    Bemærk: Ligner sin evneat identificere forkalkning inden muse aorta, calcium NIR let binder calcific mineral deponeret af dyrkede celler. Ved hjælp af denne teknik, fluorescerende mikroskopi og plade læsere med lange bølgelængde filtre kan billede og kvantificere in vitro forkalkning, hhv. Den lange bølgelængde emission af calcium NIR giver mulighed for samtidig anvendelse af lavere bølgelængde udsender fluoroforer til påvisning af andre funktioner. Protokollen for calcium NIR-farvning er som følger:

    1. Som beskrevet i afsnit 1.1.1, tilsættes 1,2 ml 1x PBS til hætteglasset indeholdende 24 nmol calcium NIR.
    2. Fortynd calcium NIR stamopløsning 1: 100 i de relevante forkalkning eller kontrolmedium.
    3. Aspirer celle medier fra dyrkningsplader og erstatte med calcium NIR-holdige dyrkningsmedier.
    4. Inkubér dyrkningspladerne med calcium NIR medier natten over ved 37 ° C.
    5. Aspireres mediet fra brøndene og vask brøndene en gang med PBS.
      Bemærk: På dette tidspunkt,den oprindelige dyrkningsmedium kan tilsættes til brøndene, og cellerne kan afbildes levende. Ellers gå videre til nedenstående trin.
    6. Fix celler ved at anbringe dem i 1 ml 10% formalin ved stuetemperatur i 20 min.
    7. Fjern formalin og vask fikserede celler med destilleret vand i 5 minutter. Gentag vasker 3x.
    8. Valgfri trin:. Udfør immunfluorescensfarvning eller andre counterstains for proteiner af interesse 8,9
    9. Billede eller opdage calcium NIR pletten med passende fluorescens excitationsbølgelængder (f.eks kan calcium NIR blive ophidset af 650-678 nm lys) og emission filtre (~ 680-700 nm).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aorta forkalkning i MGP - / - og vildtype-mus blev målt ved anvendelse billeddannelse af calcium NIR fluorescens. Nr calcium NIR signal blev påvist i aorta fra vildtypemus, hvilket indikerer fravær af forkalkning (figur 2). En stærk calcium NIR signal blev påvist i aorta fra MGP-deficiente mus, hvilket er konsistent med avanceret vaskulær kalcifikation. Vævssnit af aorta fra vildtype og MGP - / - mus blev farvet med Alizarin red 25 (figur 3A - B), hvilket bekræfter den omfattende vaskulær kalcifikation observeret i MGP-deficiente mus med nogen påvist i vildtypemus forkalkning. For at bestemme om det vaskulære forkalkning forbundet med MGP-mangel er afhængig af BMP-signalering, MGP - / - mus blev behandlet med LDN, alk3-Fc eller vehikel begyndende på dag 1 af livet. Disse mus blev injiceret med calcium NIR på dag 27 ogaorta blev høstet den følgende dag. Farmakologisk hæmning af BMP signalering reduceret aorta forkalkning detekteret med calcium NIR (figur 2). Svarende til resultaterne med calcium NIR, aorta hos LDN- og alk3-Fc-behandlede MGP - / - mus havde reduceret Alizarin rød plet for calcium i forhold til bærerbehandlede MGP - / - mus (figur 3B - D). Disse resultater indikerer, at BMP-signalering er påkrævet til den vaskulær kalcifikation observeret i MGP - / - mus.

    LDLR - / - mus fodret en diæt med højt fedtindhold udvikle både makrofag inflammation og forkalkning af arterievæggen 11 Samtidig haleveneinjektion af calcific og cathepsin-specifikke NIR prober i MGP -. / - Mus blev udført for at bestemme, om den vaskulære forkalkning af MGP -deficiency er forbundet med makrofag akkumulation 25 LDLR -. / - mus fodreten kost med højt fedtindhold og vildtypemus blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Aorta fra vildtypemus udviste næsten ingen calcium NIR eller cathepsin NIR signal, som forventet (figur 4A). Co-lokaliserede calcium NIR og cathepsin NIR signaler, stillede aortabuen region blev observeret i LDLR - / - mus, hvilket indikerer en stærk sammenhæng mellem makrofaginfiltration og vaskulær kalcifikation i denne model af intimal aterosklerose. Selv om der blev observeret en diffus og stærk calcium NIR signal i aorta hos MGP - / - mus, cathepsin NIR signalet var ikke forskellig fra den af vildtypemus. Disse fund indikerer, at den vaskulære kalcifikation i MGP-mangel forekommer i fravær af makrofag akkumulation. For yderligere at bekræfte disse resultater, aorta fra vildtype, MGP - / -, og LDLR - / - mus blev høstet, snittet og farvet med et antistof specifikt for den makrofag markør MAC-2 ( - / - mus demonstrerede rigelige MAC-2-farvning; der var ingen detekterbar MAC-2-farvning i aorta hos MGP - / - mus, hvilket indikerer et fravær af vaskulære makrofager.

    At modellere vaskulær kalcifikation in vitro, blev aortiske VSMC isoleret fra vildtype- og MGP - / - mus og dyrkes i høj phosphat indeholdende medier, ved anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor. For at bestemme den rolle, MGP i modulering forkalkning af dyrkede VSMC blev et adenovirus der udtrykker MGP (Ad.MGP) bruges til at gendanne MGP i aorta VSMC fra MGP - / - mus. MGP-deficiente VSMC inficeret med et adenovirus, der udtrykker grønt fluorescerende protein (Ad.GFP) blev anvendt som kontrol. Desuden at bestemme virkningen af ​​at fjerne MGP ekspression fra VSMC ved efterfølgende forkalkning blev aortiske VSMC fra vildtypemus behandlet med siRNA rettet mod MGP (siMGP) eller kontrol siRNA (SISC). Forkalkning blev induceret i dyrkede VSMC ved at dyrke cellerne i Forkalkning Media A i 7 dage. Celler blev efterfølgende fikseret og farvet for calcium ved anvendelse af von Kossa-metoden. Restaurering af MGP med Ad.MGP reducerede forkalkning af MGP - / - VSMC'er forhold til at styre adenovirus-behandlede celler (figur 5A - B, E). Behandling af vildtype-aorta VSMC med siMGP, hvilket resulterer i> 95% knockdown af MGP ekspression, 25 øget forkalkning sammenlignet med SISC-behandlede celler (figur 5C - D, F). Disse resultater indikerer, at denne in vitro model af VSMC forkalkning efterligner resultaterne i MGP-deficiente mus og viser, at MGP modulerer forkalkning af dyrkede VSMC.

    En alternativ metode til påvisning af forkalkning af dyrkede VSMC er med calcium NIR. For at modellere vaskulær forkalkning i v itro, humane koronararterie VSMC blev indkøbt og dyrket i 21 dage i Forkalkning Media B. Efter behandlingsperioden, forkalkning blev identificeret ved anvendelse af calcium NIR fremgangsmåde og kulturerne blev modfarvet med en brugerdefineret grønt-fluorescerende collagen sonde 51 og Hoechst farvestof (1 ug / ml i 5 minutter efter fiksering i 10% formalin) (figur 6). VSMC kerner blev observeret med blå Hoechst fluorescens ved konfokal mikroskopi (figur 6A). Et repræsentativt optisk afsnit viser calcium NIR-farvede calcific mineral i collagenmatrix produceret af VSMC (figur 6B). Tredimensionale rekonstruktioner af optiske z-stakke illustrerer lag oprettet i kultur som de VSMC på bunden af brønden producerer en collagenmatrix, hvor den deponerede calcific mineral indfanges (figur 6C - D).

    re en "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Repræsentant Dissektion af en aorta fra et Wild-typen Mouse (A) Et billede af thorax og abdominale aorta strækker sig til den fælles iliaca arterie forgrening er afbildet efter fjernelse af de overliggende organer og peri-aorta fedt. (B) Et målrettet visning af aortabuen med brachiocephale, venstre fælles carotis, og venstre subclavia arterier. Scale barer = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: vaskulær kalcifikation i MGP - / - mus er afhængig af BMP Signaling MGP - / - mus blev behandlet med intraperitoneal (ip) injektioner af enten ve. tøjets, LDN-193.189 (LDN, 2,5 mg / kg / dag), eller alk3-Fc (2 mg / kg hver anden dag) og vildtype-mus blev behandlet med IP injektioner af køretøjet begynder på dag 1 af livet indtil dag 28 . På dag 27 blev musene injiceret med calcium NIR via halevenen. Aortas blev høstet på dag 28 og filmede med nær-infrarød fluorescens. Billeder er på samme forstørrelse i alle fire paneler med skalaen bar angiver 3 mm. Wild-type mus aorta ikke udviser calcium NIR-signal, mens aorta fra MGP - / - mus havde en stærk calcium NIR signal. Sammenlignet med vehikelbehandlede MGP - / - mus, aorta hos MGP - / - udviste mus behandlet med enten LDN eller alk3-Fc signifikant reduceret calcium NIR signaler. Dette tal er taget fra henvisning 25. Klik her for at se en større version af dette tal.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Figur 3: Farmakologisk Inhibering af BMP Signaling Forhindrer Aorta Forkalkning i MGP-manglende mus vildtypemus blev behandlet med IP injektioner af vehikel (A) og MGP - / - mus blev behandlet med enten ip injektioner af bæreren (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / dag), eller alk3-Fc (D, 2 mg / kg hver anden dag) begyndende på dag 1 af livet indtil dag 28. Aortas blev høstet, snittet og farvet for calcium med alizarinrødt. Billeder blev taget på samme forstørrelse i alle fire paneler med skalaen bar angiver 400 um. Svarende til calcium NIR signaler i figur 2 Alizarin rødfarvning demonstrerer en tung byrde forkalkning i aorta hos bærerbehandlede MGP - / - mus. Forkalkning er faldet i aorta hos LDN- og alk3-Fc-behandlede MGP - / - mus. Dette tal er taget frareferere 25. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    . Figur 4: samtidig bestemmelse af aorta Forkalkning og makrofaginfiltration med Calcium NIR og Cathepsin NIR (A) vildtype, MGP - / -, og LDLR - / - mus fodret med en kost med højt fedtindhold blev injiceret med calcium NIR og cathepsin NIR via injektion i halevenen. Aortas blev høstet 24 timer senere og vurderes med nær-infrarød fluorescens billeddannelse. Billeder er med samme forstørrelse med skalastangen indikerer 3 mm. Vildtypemus udviser næsten ingen aorta forkalkning eller makrofag tilstedeværelse. Aorta fra LDLR - / - mus har omfattende forkalkning, der co-lokaliserer med makrofag akkumulation. I modsætning hertil MGP - / - Mus har aorta forkalkning, der forekommer i fravær af makrofaginfiltration. (B) Aortas blev høstet fra vildtype, MGP - / -, og LDLR - / - mus fodret med en kost med højt fedtindhold. Disse aorta blev snittet og farvet til makrofager med et antistof specifikt for MAC-2. Kerner blev farvet med DAPI. Den lumenale overflade er mod højre i hvert panel. Billeder blev taget på samme forstørrelse i alle tre paneler med skalaen bar angiver 100 um. Svarende til resultaterne i (A), der var ingen tegn på makrofag akkumulation i aorta hos MGP - / - mus. Dette tal er en modificeret udgave af en figur fra henvisning 25. Klik her for at se en større version af dette tal.

    .jpg "/>
    . Figur 5: MGP Beskytter Dyrkede VSMC fra Forkalkning Dyrkede aorta VSMC blev isoleret fra MGP - / - mus og inficeret med adenovirus, der udtrykker enten GFP (A) eller MGP (B). Aorta VSMC isoleret fra vildtype-mus blev transficeret med enten kontrol scrambled siRNA (C) eller siRNA targeting MGP (D). Celler blev dyrket i Forkalkning Media A i 7 dage og efterfølgende fikseret og farvet med von Kossa. Billeder blev taget på samme forstørrelse i alle fire paneler (A - D) med skalaen bar angiver 200 um. Serielle synsfelter blev fotograferet og kvantificeret for calcium farvning hjælp billede J softwaren efter baggrund subtraktion (E og F), med fejlsøjler angiver SEM. Dette tal er en modificeret udgave af en figur fra henvisning 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6:. Calcium NIR Identificerer Forkalkning i samarbejde med den ekstracellulære matrix in vitro (A) Humane kranspulsåren VSMC dyrket i Forkalkning Media B i 21 dage blev identificeret ved nuklear farvning hjælp Hoechst farvestof. (B) Et optisk sektion opnået ved konfokal mikroskopi af calcium NIR-farvning (rød) kombineret med en grøn-fluorescerende collagen probe viser calcific mineral hele collagenmatrix. Images A - B blev taget på samme forstørrelse med skalaen bar angiver 10 um. (C og D) Tre-dimensionelle rekonstruktioner viser indfangning af calcific mineral inden than kollagen matrix. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Arteriel forkalkning er en vigtig risikofaktor for hjerte-kar-sygdom hos mennesker og kan bidrage direkte til patogenesen af kardiovaskulære hændelser. 1,5,52 intima calcium deposition i de tynde fibrøse hætter af aterosklerotisk sygdom er blevet foreslået at øge den lokale biomekanisk stress og bidrage til plaque ruptur. 53,54 Medial forkalkning påvirkninger kliniske resultater ved at øge arteriel stivhed, som kan fremkalde hjertehypertrofi og påvirke hjertefunktionen. 55 Derfor forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for vaskulær forkalkning vil give vigtig indsigt i human sygdom og potentielt identificere nye mål for terapi.

    Her er en metode til påvisning af aorta forkalkning og makrofag akkumulation i murine modeller af åreforkalkning og vaskulære forkalkning udnytte NIRF imaging beskrevet. 9 Det er afgørende at præcist injicere NIRF agenter i halevenen. Dette er en teknik, der kræver betydelig praksis, før der opnås beherskelse. 56 Desuden er det vigtigt at fjerne alle de peri-aorta fedt fra aorta, da dette fedt kan forårsage en autofluorescerende signal ved den samme bølgelængde som calcium NIR og cathepsin NIR signaler. Brugen af ​​NIRF agenter har mange vigtige fordele i forhold til standard histologiske metoder til vurdering af vaskulær forkalkning og inflammation. I modsætning til konventionelle histologiske teknikker, disse midler tillader kvantificering af hele aorta forkalkning og makrofag infiltration. Desuden giver de en mere følsom metode til påvisning af tidlige ændringer i forbindelse med udviklingen af aorta forkalkning end histologisk farvning og kan derfor tilbyde mekanistiske indsigt i tidligere stadier af sygdommen. 9 lokaliteter af tidlig calcium NIR signal er forbundet med markører for knogledannelse herunder øget alkalisk fosfatase aktivitet som well som Runx2 og osteopontin genekspression. Desuden samtidig anvendelse af spektralt adskilte prober til forkalkning og cathepsin aktivitet muliggør kvantificering og sammenslutning af den Spatiotemporal progression af både ateromatøs og calcific sygdom. 9

    Identifikation af rumlige og tidsmæssige karakteristika for vaskulære forkalkning og betændelse hjælpemidler i vores forståelse af de underliggende patofysiologiske mekanismer karsygdom. For eksempel har anvendelsen af NIRF agenter påvist, at i modeller af intimal forkalkning (ApoE - / - og LDLR - / - mus på en fedtrig kost), vaskulær kalcifikation co-lokaliseres til steder med makrofag akkumulering (figur 4) og at forkalkning følger akkumuleringen af makrofager timeligt. 9,11 Interessant ingen makrofag akkumulation med cathepsin NIR blev påvist i den mediale vaskulær kalcifikation fundet i MGP-manglende mus. 25 Tors, fra forsøg udnytte NIRF agenter, kan det konkluderes, at selv om makrofag akkumulation er associeret med vaskulær intima forkalkning, er det ikke nødvendigt for vaskulær mediale forkalkning.

    Svarende til dets rolle i billedbehandling og studere vaskulær sygdom, har NIRF billeddannelse blevet anvendt til at studere aortaklappen sygdom. 47 aortaklappen sygdom er præget af lipid-laden makrofag og forkalkede læsioner på ventilen og udviser tilsvarende underliggende molekylære mekanismer og genetiske determinanter såsom aterosklerose . 57-59 aortaklappen forkalkning forårsager svækkelse af folder funktion og er den primære årsag til klinisk aortastenose hos ældre. Den eneste behandling øjeblikket er til rådighed til symptomatisk aortastenose er ventil udskiftning. En bedre forståelse af de molekylære mekanismer i aortaklap sygdom er nødvendige for at forhindre sene kliniske komplikationer af progressiv aortaklappen forkalkning. Udnyttelse af NiRF agenter som molekylær billeddannelse værktøjer i dyremodeller giver en følsom metode til vurdering af aortaklappen sygdom på dens tidligste faser. 60

    Standardteknikker til at visualisere kranspulsåren plaques har fokuseret på sværhedsgraden af stenose, men størstedelen af akutte koronare syndromer skyldes brud af ikke-flow-begrænsende plaques. 6 Biologiske processer indenfor plaques, såsom inflammation, tjene som bedre forudsigelser af plaque ruptur end graden af stenose. 61 i modsætning til konventionelle billeddannelsesteknikker, NIRF billeddannelse giver mulighed for at måle cellulær aktivitet (dvs. makrofag proteolytisk aktivitet med en matrixmetalloproteinase (MMP) aktiverbar middel, proteolytisk og elastolytisk aktivitet med cathepsin NIR, og osteogen aktivitet med calcium NIR). 9 Denne metode giver derfor samtidig funktionel og anatomiske vurdering af hjertekarsygdomme. NIRF billedbehandling anvender excitation bølgelængder i 650 til 900 nm rækkevidde, som har den fordel, øget væv penetration i forhold til lys ved en lavere bølgelængde, hvilket sikrer en større grundig vurdering af sygdom læsioner. 60 Der er også reduceret autofluorescerende baggrund signal om karvæv i den nærmeste -Infrarød bølgelængdeområde. Selv om denne protokol fokuserer på brugen af NIRF imaging ex vivo, NIRF imaging repræsenterer også en nyttig platform for langsgående molekylær billeddannelse in vivo. 9 NIRF billeddannelse, når de kombineres med intravital mikroskopi, kan medføre fremtidige diagnostiske anvendelser i mennesker. 61 Men en begrænsning af calcium NIR imaging længderetningen er, at bisphosphonatet-afledte probe selv kan ændre den fysiologiske proces af forkalkning. 62

    Kardiovaskulær forkalkning er en aktivt reguleret proces, der involverer transdifferentiering af VSMC'er til et osteogent fænotype. 25,41,42 63 og har opnået tilstrækkeligt antal celler pr murine aorta at udføre in vitro-undersøgelser (figur 5). En alternativ migThOD for VSMC isolation ikke involverer enzymatisk fordøjelse men snarere direkte kultur af eksplanterede aortaringe; denne teknik er blevet rapporteret at give færre celler end den teknik udnytter enzymatisk nedbrydning. 63,64

    To forskellige forkalkning medier, enten med βGP / ASC / DEX 65,66 eller NaPhos, 25,43 beskrives som kan anvendes til at inducere forkalkning af VSMC. Begge typer af medier er blevet anvendt til calcify murine VSMC med tilsvarende succes. Mens forkalkning medier indeholdende βGP / Asc / DEX er blevet anvendt til calcify humane VSMC (figur 6), har medierne indeholdende NaPhos ikke været effektiv forkalkning humane VSMC i vores erfaringer. Desuden 21 - kan være nødvendig 28 dage af dyrkning af humane VSMC i Forkalkning Media B før forkalkning opdages. Forkalkning af vildtype-VSMC in vitro blev øget, når ekspressionsniveauer af MGP blev reduceret med siRNA og calcificatipå blev reduceret i MGP - / - VSMC når MGP ekspression blev gendannet (figur 5). Disse resultater stemmer overens med den aortiske forkalkning observeret i FUP - / - mus og foreslå, at denne in vitro-metode til VSMC forkalkning tjener som en nyttig model for in vivo forkalkning. Det er vigtigt at bemærke, at der er begrænsninger i at drage konklusioner med hensyn til intakte blodkar fra dyrkede VSMC. Dyrkede VSMC kan miste deres in vivo kontraktile egenskaber, især ved højere passager, ud over at udvikle ændringer i genekspression mønstre, morfologi og stivhed. 67-70 VSMC dyrket i forkalkning medier skelner til en osteoblastiske afstamning før forkalkning, men ikke udviser en chondrocytisk mellemprodukt, der ofte observeres in vivo. 71 Det er derfor vigtigt, at mekanistiske konklusioner dyrkede celler valideres i in vivo-systemer. Påe potentiel metode til at overvinde denne begrænsning er at studere VSMC i deres in vivo tilstand vha en dyrket intakt kar ring. 70

    To forskellige fremgangsmåder er præsenteret til detektering forkalkning af dyrkede VSMC, von Kossa-metoden (figur 5) og calcium NIR-farvning (figur 6). Selv om de anvendes hyppigt til at vurdere for forkalkning, er von Kossa-metoden noget begrænset af dens reducerede specificitet for calcium krystaller. 50 Calcium NIR føles at være specifikt for forkalkning og er særlig fordelagtig, idet den giver mulighed for samtidig farvning med yderligere spektralt distinkt fluorescerende agenter. 9 Fremtidige anvendelser af denne protokol udnytte calcium NIR med supplerende molekylære prober kan give et vigtigt indblik i mekanismerne i forkalkning og kan muliggøre hurtig vurdering af småmolekyleinhibitorer af VSMC forkalkning i en high-throughput måde, til IDEntify potentielle nye behandlinger for vaskulær forkalkning.

    Sammenfattende kardiovaskulær forkalkning er en vigtig risikofaktor for og potentiel bidragyder til klinisk sygdom. Kendskab til de mekanismer, hjerte-kar-forkalkning og aterosklerotisk sygdom er afhængig af både dyr og cellebaserede modeller. Metoder til vurdering forkalkning i in vivo, ex vivo, og in vitro modeller er afgørende for at fremme vores forståelse af hjertekarsygdomme.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    Forkalkning af vaskulære glatte muskelceller og billeddannelse af aorta Forkalkning og Inflammation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter