Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de wereld, waaronder de Verenigde Staten, waar het goed is voor meer dan 780.000 doden per jaar. 1 Coronaire verkalking en aorta verkalking zijn kenmerken van atherosclerose en dienen als sterke voorspellers van cardiovasculaire gebeurtenissen. 2- 4 Twee belangrijke types van vasculaire calcificatie zijn gemeld bij volwassenen: intima verkalking, geassocieerd met atherosclerose, en mediale (ook bekend als Monckeberg) verkalking, geassocieerd met chronische nierziekte en diabetes 5 intima verkalking optreedt in de setting van lipide-accumulatie en macrofagen. infiltratie in de vaatwand. 5,6 mediale wand verkalking optreedt onafhankelijk van intimale verkalking, lokaliseert elastine vezels of gladde spiercellen en is niet geassocieerd met lipide afzetting of macrofaag infiltratie. 5,7,8 Studies over de moleculaire mechanismen vanvasculaire calcificatie hebben vertrouwd op basis van cellen en dierlijke modelsystemen. Knaagdier modellen voor atherocalcific ziekte zijn deficiënte muizen in beide apolipoproteïne E (ApoE) 9,10 of low-density lipoprotein receptor (LDLR) 11 gevoed een vetrijk dieet, terwijl de modellen voor de mediale verkalking onder andere muizen met matrix Gla proteïne (MGP) deficiëntie 12 of ratten die uremie ontwikkelen op bijna totale nefrectomie (de 5 / 6e nefrectomie model) of door blootstelling aan een hoge-adenine dieet. 13

Hier wordt het model van mediale vasculaire calcificatie geassocieerd met MGP deficiëntie gericht op. MGP is een extracellulair eiwit dat aderverkalking remt. 12 Mutaties in het MGP gen geïdentificeerd in Keutel syndroom, een zeldzame menselijke ziekte gekenmerkt door diffuse kraakbeen verkalking naast brachytelephalangy, gehoorverlies, en perifere pulmonale stenose. 14-18 Hoewel niet vaak waargenomen, 19concentrische verkalking van meerdere slagaders is beschreven in Keutel syndroom. 20 Common polymorfismen in de humane MGP-gen worden geassocieerd met een verhoogd risico op coronaire calcificaties, 21-23 terwijl hogere niveaus van circulerende uncarboxylated, biologisch inactief MGP cardiovasculaire mortaliteit voorspellen. 24 In tegenstelling tot mensen met Keutel syndroom, MGP-deficiënte muizen ontwikkelen ernstige vasculaire fenotype bestonden uit spontane wijdverbreide aderverkalking vanaf twee weken oud en sterven 6-8 weken na de geboorte door aortaruptuur. 12

Unlike ApoE - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet, dat intimale vasculaire calcificatie met geassocieerde macrofaag geïnduceerde inflammatie ontwikkelen, MGP - / -. Muizen ontwikkelen mediale vasculaire calcificatie in afwezigheid van macrofaag infiltratie 11,25 Hoewel deze bevindingen suggereren verschillende onderliggende stimuli voor intimal en mediale verkalking, er overlap in de signalering mechanismen die beide vormen van calcificatie. 26 meerdere signaleringsroutes geïdentificeerd die bijdragen tot vasculaire calcificatie inclusief inflammatoire mediatoren zoals tumor necrosis factor-α en IL-1 en pro-osteogene factoren bemiddelen zoals Notch, Wnt, en bot morfogenetisch eiwit (BMP) signalering. 27,28 Deze signaalroutes verhogen expressie van de transcriptiefactoren runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) en osterix, die op hun beurt expressie van bot-gerelateerde eiwitten verhogen ( bijv., osteocalcine, sclerostine en alkalische fosfatase) in de vasculatuur die calcificatie bemiddelen 28-30 Wij en anderen hebben aangetoond dat de vasculaire calcificatie waargenomen in ApoE - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet en de spontane vasculaire calcificatie waargenomen in MGP - / - muizen zijn allemaal afhankelijk van het bot morfogenetische proteïne (BMP) signaling, en het is deze route die gericht hier. 11,25,31 BMPs potente osteogene factoren die nodig zijn voor botvorming en is bekend dat verhoogde expressie vertonen in menselijke atherosclerose. 32-34 In vitro studies hebben BMP signaaltransductie betrokken bij het ​​reguleren de expressie van osteogene factoren zoals Runx2. 35-37 Overexpressie van het ligand BMP, BMP-2, versnelt de ontwikkeling van vasculaire calcificatie in ApoE-deficiënte muizen die een vetrijke dieet. 38 Bovendien is het gebruik van specifieke remmers zoals BMP signalering als LDN-193189 (LDN) 39,40 en / of ALK3-Fc voorkomt de ontwikkeling van vasculaire calcificatie bij beide LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet en MGP-deficiënte muizen 11,25.

Vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van vasculaire calcificatie. 30,41,42 De mediale vasculaire calcificatie die ontstaat in MGP-deficiënte muizen karakmerkt door een transdifferentiatie van VSMC een osteogene fenotype. Verlies van MGP resulteert in verminderde expressie van VSMC markers waaronder myocardin en alfa gladde spieren actine, met een daarmee gepaard gaande stijging van de osteogene merkers zoals Runx2 en osteopontine. Deze veranderingen samen met de ontwikkeling van vasculaire calcificatie. 25,43,44

Aorta calcificatie en ontsteking bij muizen worden kenmerkend bepaald met gebruikmaking histochemische technieken zoals alkalische fosfatase activiteit vroege calcificatie en osteogene activiteit, von Kossa en alizarine rood kleuring voor late calcificatie en immunohistochemische protocollen die macrofaag eiwit markers (bijv. Targeten, CD68, F4 / 80, Mac-1, MAC-2, MAC-3). 9,45 echter deze standaard beeldvormende technieken vereisen verwerking van de aorta weefsel in doorsneden, die tijdrovend en onvolmaakte door steekproefvertekening en zijn beperkt in hun vermogen om ontsteking en calcificat kwantificerenion in de gehele aorta. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gehele aorta en middelgrote aderverkalking en macrofaag accumulatie gebruikmaking nabij infrarood fluorescentie (NIR) moleculaire beeldvorming ex vivo. Ook wordt een werkwijze voor het oogsten en het kweken van primaire aorta VSMC's van muizen en induceren van de verkalking van murine en menselijke VSMC's in vitro om de moleculaire mechanismen van vasculaire calcificatie bepalen. Deze technieken de onderzoeker zowel in vivo en in vitro methoden voor het bestuderen atherocalcific ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studies met muizen werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Huisvesting en alle procedures waarin muizen in deze studie beschreven, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van Massachusetts General Hospital (Subcommissie onderzoek Animal Care). Alle procedures werden uitgevoerd met zorg om het lijden te minimaliseren.

1. Bereiding van reagentia

  1. Near-Infrared Fluorescentie beeldvorming van Whole aorta
    Opmerking:. A-bisfosfonaat verkregen, nabij-infrarood fluorescente imaging probe kan worden gebruikt om osteogene activiteit in de vasculatuur markeren door te binden aan hydroxyapatiet 46,47 A-cathepsine geactiveerde fluorescente beeldvorming probe kan als een marker voor macrofaag proteolytische activiteit en elastolytische dienen de vasculatuur. 9 Om de gelijktijdige overdracht van zowel fluorescerende probes mogelijk, is het belangrijksondes die spectraal verschillend zijn gebruikt. De notatie calcium NIR wordt gebruikt om de verkalking specifieke nabij-infrarood fluorescente imaging probe en cathepsine NIR de cathepsine activiteit specifieke nabij infrarood fluorescerende afbeeldingssonde geven geven.
    1. Bereid de oplossingen van calcium NIR en cathepsine NIR. Volgens protocollen van de fabrikant, voeg 1,2 ml van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de injectieflacon met 24 nmol calcium NIR of cathepsine NIR en schud voorzichtig.
      Opmerking: Volgens de fabrikant, eenmaal opgelost in PBS, calcium NIR en cathepsine NIR oplossingen stabiel gedurende 14 dagen bij bewaring in het donker bij 2-8 ° C.
  2. Isolatie en verkalking van Muizen Aorta VSMCs
    1. Aorta Spijsvertering Oplossing:
      1. Bereid een verse oplossing (~ 3-5 ml per aorta geoogst) met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 175 U / ml type 2 collagenase en 1,25 U / ml elastase. Steriliseer de oplossing wet een 0,22 urn vacuüm aangedreven filtersysteem en houden van de oplossing op ijs tot gebruik.
    2. Cell Media:
      1. Supplement 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.
    3. Verkalking Media:
      1. Verkalking Media A (NaPhos; gebruikt in muizen cellijnen):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volume indien nodig) met 10% foetaal runderserum, 2 mM natriumfosfaat, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.

          OF
      2. Verkalking Media B (βGP / Asc / DEX; gebruikt in zowel de muis of menselijke cellijnen):
        1. Supplement 100-500 ml DMEM (volume indien nodig) met 10% foetaal runderserum, 10 mM β-glycerofosfaat dinatrium, 50 ug / ml L-ascorbinezuur, 10nM dexamethason, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Verwarm de media tot 37 ° C vóór gebruik.

2. Staart Vein Injection

  1. Vóór injectie in de staartader, verwarm de muizen onder een milde warmtelamp gedurende 5 min.
  2. Restrain de muis in een buis knaagdier houder. Ontsmet de staart met een alcoholdoekje.
  3. Maken gebruik van een 30 G naald voor injectie in de staartader. Staartaders zijdelings gelegen.
    1. Breng een zachte hoeveelheid voorwaartse druk op de spuit als de naald wordt voortbewogen in de staart. De ader wordt geopend zodra de weerstand tegen injectie niet meer aanwezig.
    2. Injecteer een volume van 100 pi calcium NIR en / of 100 pl cathepsine NIR constante hoeveelheid. Aan het einde van de injectie, na een 5 seconden pauze, trekken de naald.
  4. Oogst de aorta (zie paragraaf 3) 3-24 uur na de injectie.

3. Mouse Dissection

  • Euthanaseren muis met 200 mg / kg intraperitoneaal pentobarbital injectie.
  • Leg het dier in rugligging op de dissectie board en te stabiliseren door taping elke poot aan de raad. Met behulp van een dissectiemicroscoop en kleine scharen, maak een middellijn incisie uitstrekt vanaf de onderbuik naar de bovenste thorax.
  • Trek de huid met een tang en verwijder het buikvlies, het openbaren van de buikorganen. Verwijder de gastro-intestinale organen, het verzorgen van de aorta niet te doorsnijden.
  • Voeg een laterale incisie in de voorste diafragma en blijven de incisie in de buik. Gebruik dissectie scharen, laat de ribbenkast door snijden door de zijkanten van de ribben en het verwijderen van het zachte weefsel hechtende de superieure deel van het borstbeen. Verwijder de ribbenkast, het openbaren van de longen.
  • Laat het hart op zijn plaats in eerste instantie (om hulp bij het identificeren en het ontleden van de proximale aorta) en verwijder voorzichtig de longen. Verwijder de thymus, luchtpijp en slokdarm met zorg, ensuring dat de aorta intact blijft.
  • Het gebruik van rechte fijne tang en micro-ontleden schaar, verwijder het zachte weefsel rondom de aorta van de darmbeenvertakking aan de aortaboog, het betalen van zorgvuldige aandacht bij het ​​verwijderen van de peri-aorta vet (figuur 1A). Verwijder het achtergebleven vet en weke delen rondom de grote takken van de aortaboog (dwz brachiocephalicus, halsslagader en subclavian slagaders, figuur 1B).
    Opmerking: Het is belangrijk om het vet uit de aorta verwijderen omdat vet het achtergrondsignaal kan verhogen bij het uitvoeren fluorescentiebeeldvorming.
  • Verwijder het hart uit de borstholte, voorzichtig los te maken van de proximale aorta, en gooi. Doorsnijden de distale aorta naar de iliacale bifurcatie. Met behulp van een insuline naald injecteren normale fysiologische zoutoplossing in de aorta van de aortaboog te wassen resterende bloedcellen. Maak de aorta, samen met de aortaboog schepen, volledig te verwijderenuit het lichaam.
  • Plaats de aorta in fysiologische zoutoplossing op ijs tot klaar voor beeldvorming.
  • 4. Aorta Imaging

    1. Afbeelding aorta ex vivo direct na de oogst van nabij-infrarood fluorescentie reflectie beeldvorming. 25
      1. Stel de fluorescentie imager op het juiste multichannel golflengten fluorescentiesignaal intensiteiten kwantificeren van de aorta's van calcium NIR en cathepsine NIR-geïnjecteerde muizen zoals eerder beschreven. 25 Volgens de fabrikant, kan calcium NIR worden opgewekt door ~ 650-678 nm licht met een maximale emissie in de ~ 680-700 nm bereik. Cathepsine NIR kan worden opgewekt door ~ 745-750 nm licht met een maximale emissie bij ~ 770 nm.

    5. Isolatie van primaire muizen Aorta vasculaire gladde spiercellen

    1. De stappen 3,1-3,7 zoals hierboven beschreven.
    2. Plaats aorta in koude HBSS tot dissecties voltooid. snijd zorgvuldig weg elke remaining periaortic vet en zacht weefsel, waardoor alleen de aorta.
    3. Onder een steriele weefselkweek kap, overdracht van de aorta naar de aorta Digestion Solution in 35 mm x 10 mm weefselkweek gerechten. Plaats in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder zacht intermitterende schommelen. Na de vertering, de aorta vertonen een uitgerekt of gerafeld uiterlijk.
    4. Met de dissectie microscoop en een steriel pincet, verwijder de buitenste adventitia laag van de aorta terwijl de mediale laag intact. Een techniek voor het verwijderen van de adventitia om afpellen van de buitenste laag van de aorta aan één einde en verwijderen uit de onderliggende mediale laag als een sok opnieuw kan worden gepeld en verwijderd.
    5. Zodra de adventitia laag is verwijderd, plaats de resterende aorta in een nieuwe weefselkweekplaat met celkweekmedia en bewaar bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2-4 uur.
    6. Onder een steriele motorkap en met steriele 3 mm micro-dissectie schaar, knip de aorta in 1-2 mm breedringen.
    7. Plaats deze ringen in een nieuwe weefselkweekplaat met aorta verteringsoplossing en incubeer bij 37 ° C onder zacht intermitterende schommelen van 120 min. Pipetteer de oplossing op en neer meerdere keren tijdens de incubatie van cellen te resuspenderen.
    8. Voeg 5 ml warm celkweek media om de vertering oplossing en transfer naar een 15 ml conische buis.
    9. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g.
    10. Zuig het medium en resuspendeer cellen in het gewenste volume celkweekmedia (bijvoorbeeld 5 ml).
    11. Plaat de totale hoeveelheid geïsoleerde cellen uit elke aorta in een 25 cm 2 celkweek kolf en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Propageren cellen onder toepassing van standaardtechnieken, zoals eerder beschreven. 25,48 Tijdens de eerste 7-10 dagen incuberen de opslaglocatie 72-96 uur. Als de cellen te benaderen samenvloeiing, aanvullen media vaker (elke 48 uur).
      Opmerking: Het kan vele weken duren om een ​​voldoende qua groeienntity cellen.
    12. Eenmaal confluent passage cellen met trypsine dat wordt verwarmd tot 37 ° C.
      1. Voeg 0,5-1,0 ml trypsine aan elke cultuur kolf en incubeer gedurende 3-5 min; Tik zachtjes tegen de kolf elke 30-60 sec behoefte om cellen los van het oppervlak.
      2. Zodra de cellen los van de bodem van de kolf, voeg 10 ml celmedium de cellen in trypsine. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min. Zuig het medium en trypsine uit de cel pellet. Resuspendeer de cellen in de gewenste hoeveelheid verse celmedium (bijvoorbeeld 5-10 ml) en naar een nieuwe kolf (enkele cellen overgebracht naar een kamer dia).
    13. Bij de eerste passage van cellen, bevestigt de gladde spier cellijn met standaard technieken immunocytochemie, zoals eerder beschreven 49 onder gebruikmaking van een antilichaam gericht tegen α-gladde spier actine.

    6. inducerende verkalking van Gekweekte gladde spierenCellen

    1. Plaat cellen verkregen van 5.12 in een 6-wells formaat. Opmerking: Beginnend met 1 x 10 5 cellen / putje in een totaal volume van 2,0 ml celmedium per well aanbevolen.
    2. Sta cellen groeien in calcificatie Media A of B ten minste 7 dagen in een 6-well plaat formaat. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
    3. Verander cel media om de 48 uur.

    7. Het beoordelen van VSMC calcificatie Met behulp van de von Kossa Staining Method

    Opmerking:. De von Kossa werkwijze voor het meten extracellulaire matrix verkalking van weefsels of gekweekte cellen is gebaseerd op de vervanging van fosfaat gebonden calciumionen zilverionen 50 In aanwezigheid van licht en organische verbindingen, worden de zilverionen gereduceerd en gevisualiseerd als metallisch zilver. Eventueel niet-omgezet zilver wordt verwijderd door behandeling met natriumthiosulfaat 50 Het protocol voor von Kossa kleuring is als volgt.:

    1. Aspireren media van cel culture platen.
    2. Fix cellen door ze in 1 ml 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    3. Verwijder de formaline en was de gefixeerde cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
    4. Incubeer cellen in 1 ml van 5% zilvernitraatoplossing onder 60-100 W lamp voor 1-2 uur.
    5. Zuig het zilvernitraatoplossing en was met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
    6. Verwijderen gereageerde zilver door het plaatsen van de cellen in 1 ml van 5% natriumthiosulfaat (w / v) oplossing in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
    7. Spoel de cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Herhaal wast 3x. De von Kossa vlek is klaar voor de beeldvorming met standaard omgekeerde lichtmicroscoop.
    8. Optionele stap: tegenkleuring met 1 ml kernechtrood gedurende 5 min. Hierna gebruikt driemaal wassen met gedestilleerd water (5 min elk).

    OF

    8. Het beoordelen van VSMC verkalking met nabij-infrarood Fluorescent Imaging

    Noot: Net als het vermogenom verkalking te identificeren binnen muis aorta, calcium NIR gemakkelijk bindt calcific minerale afgezet door gekweekte cellen. Met behulp van deze techniek, fluorescentie microscopie en plaat lezers met een lange golflengte filters kunt beeld- en kwantificeren in vitro verkalking, respectievelijk. De lange emissiegolflengte van de calcium NIR voorziet in de gelijktijdige gebruik van lagere golflengte emitterende fluoroforen aan andere functies detecteren. Het protocol voor calcium NIR kleuring is als volgt:

    1. Zoals beschreven in paragraaf 1.1.1, voeg 1,2 ml 1x PBS om de flacon met 24 nmol van calcium NIR.
    2. Verdun de calcium NIR voorraad 1: 100 in de juiste verkalking of de controle media.
    3. Zuig cel media uit kweekplaten en te vervangen door de calcium NIR-bevattende kweekmedium.
    4. Incubeer de kweekplaten met calcium NIR media overnacht bij 37 ° C.
    5. Zuig de media uit de putjes en spoel de putten eenmaal met PBS.
      Opmerking: Op dit punt,de oorspronkelijke kweekmedium kan worden toegevoegd aan de putjes en de cellen kunnen rechtstreeks worden afgebeeld. Anders gaat u naar de onderstaande stappen.
    6. Fix cellen door ze in 1 ml 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    7. Verwijder de formaline en was de gefixeerde cellen met gedestilleerd water gedurende 5 minuten. Herhaal wast 3x.
    8. Optionele stap:. Voer immunofluorescentiekleuring of andere counterstains voor eiwitten van belang 8,9
    9. Afbeelding of op te sporen calcium NIR vlek met behulp van passende fluorescentie golflengten (bijvoorbeeld, kan calcium NIR worden opgewekt door 650-678 nm licht) en emissie filters (~ 680-700 nm).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aorta verkalking in MGP - / - en wild-type muizen werd gemeten met behulp van beeldvorming van calcium NIR fluorescentie. Geen calcium NIR signaal werd gedetecteerd in de aorta's van wild-type muizen, waaruit blijkt dat zij calcificatie (figuur 2). Een sterk calcium NIR signaal werd gedetecteerd in de aorta van MGP-deficiënte muizen, wat overeenkomt met geavanceerde vasculaire calcificatie. Weefselcoupes van aorta's van wild-type en MGP - / - muizen werden gekleurd met Alizarine rood 25 (figuur 3A - B), hetgeen de uitgebreide vasculaire calcificatie waargenomen MGP-deficiënte muizen zonder verkalking waargenomen in wild-type muizen. Om te bepalen of de vasculaire calcificatie geassocieerd met MGP-deficiëntie is afhankelijk BMP signalering, MGP - / - muizen werden behandeld met LDN, ALK3-Fc of voertuig beginnend op dag 1 van het leven. Deze muizen werden geïnjecteerd met calcium NIR op dag 27 enaorta's werden de volgende dag verzameld. Farmacologische remming van BMP signalering verminderd aorta verkalking gedetecteerd met calcium NIR (Figuur 2). Vergelijkbaar met de bevindingen calcium NIR, de aorta van LDN- en ALK3-Fc behandelde MGP - / - muizen hadden Alizarine rood kleuring verminderd calcium vergeleken met met drager behandelde MGP - / - muizen (Figuur 3B - D). Deze resultaten geven aan dat BMP-signalering wordt het vasculaire calcificatie waargenomen MGP - / - muizen.

    LDLR - / - muizen die een vetrijke dieet ontwikkelen zowel macrofagen ontsteking en verkalking van de vaatwand 11 Gelijktijdige injectie in de staartader van calcifieke en cathepsine-specifieke NIR probes in MGP -. / - Muizen werd uitgevoerd om te bepalen of de vasculaire calcificatie van MGP -deficiency wordt geassocieerd met macrofaag accumulatie LDLR 25 -. / - muizen gevoedeen vetrijke dieet en wildtype muizen werden gebruikt als positieve en negatieve controles, respectievelijk. Aorta's van wild-type muizen vertoonden vrijwel geen calcium NIR of cathepsine NIR-signaal, zoals verwacht (Figuur 4A). Co-gelokaliseerde calcium NIR en cathepsine NIR signalen die de aortaboog regio begunstigd waargenomen in de LDLR - / - muizen, wat wijst op een sterke associatie tussen infiltratie van macrofagen en vasculaire calcificatie in dit model van intimale atherosclerose. / - - Hoewel een diffuse sterke calcium NIR signaal in de aorta van MGP werd waargenomen muizen, de cathepsine NIR signaal niet verschilde van die van wild-type muizen. Deze bevindingen geven aan dat de vasculaire calcificatie in MGP deficiëntie optreedt in afwezigheid van macrofagen accumulatie. Om verder te bevestigen deze bevindingen, aorta's van wild-type MGP - / - en LDLR - / - muizen werden geoogst, doorgesneden en gekleurd met een antilichaam specifiek voor de macrofaag marker MAC-2 ( - / - muizen aangetoond overvloedige MAC-2 kleuring; Er was geen detecteerbare kleuring MAC-2 in de aorta van MGP - / - muizen, wat wijst op een afwezigheid van vasculaire macrofagen.

    Vasculaire calcificatie in vitro model werden VSMC aorta geïsoleerd van wild-type en MGP - / - muizen en gekweekt in high-fosfaathoudende media, volgens de hierboven beschreven protocol. Om de rol van MGP in moduleren verkalking van gekweekte VSMC bepalen, een adenovirus MGP (Ad.MGP) werd gebruikt voor MGP herstellen aorta VSMC van MGP - / - muizen. MGP-deficiënte VSMCs geïnfecteerd met een adenovirus tot expressie groen fluorescerend eiwit (Ad.GFP) werden gebruikt als controle. Bovendien, om het effect van het verwijderen MGP expressie van VSMC op latere verkalking bepalen, werden de aorta VSMC's van wild-type muizen behandeld met siRNA gericht tegen MGP (siMGP) of siRNA controle (sisc). Verkalking werd in gekweekte VSMC geïnduceerd door de cellen te kweken in calcificatie Media A gedurende 7 dagen. Vervolgens werden de cellen gefixeerd en gekleurd voor calcium met de von Kossa methode. Restauratie van MGP met Ad.MGP verminderde verkalking van MGP - / - VSMC's in vergelijking met adenovirus behandelde cellen (Figuur 5A - B, E) te controleren. Behandeling van wildtype aorta VSMCs met siMGP, resulterend in> 95% knockdown van MGP expressie, 25 verhoogde verkalking opzichte sisc-behandelde cellen (Figuur 5C - D, F). Deze resultaten geven aan dat dit in vitro model van VSMC calcificatie bootst de bevindingen MGP-deficiënte muizen en demonstreert dat MGP moduleert verkalking van gekweekte VSMC's.

    Een alternatieve methode voor het opsporen van verkalking van gekweekte VSMCs is met calcium NIR. Vasculaire calcificatie in V-model itro, menselijke kransslagader VSMC's werden aangekocht en gedurende 21 dagen in calcificatie Media B. Na de behandelingsperiode, verkalking werd geïdentificeerd met behulp van de calcium NIR methode en de kweken werden tegengekleurd met een custom-groene fluorescente probe 51 collageen en Hoechst kleurstof (1 ug / ml gedurende 5 minuten na fixatie in 10% formaline) (figuur 6). VSMC kernen werden waargenomen Hoechst blauwe fluorescentie door confocale microscopie (figuur 6A). Een vertegenwoordiger optische gedeelte wordt calcium NIR-gekleurd calcific mineralen binnen het collageen matrix geproduceerd door de VSMC's (figuur 6B). Driedimensionale reconstructies optische z-stacks illustreren de lagen die in cultuur als de VSMC op de bodem van de put produceren collageenmatrix waarin de gedeponeerde minerale calcific wordt ingevangen (Figuur 6C - D).

    re 1 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Figuur 1:. Representatieve Dissectie van de aorta van een wildtype muis (A) Een beeld van de thoracale en abdominale aorta uitstrekken naar de bekkenslagader bifurcatie afgebeeld na verwijdering van de bovenliggende organen en vet peri-aorta. (B) Een gerichte weergave van de aortaboog de ​​brachiocefale, linker halsslagader en de linker subclavia slagaders. Schaal bars = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2: Vasculaire calcificatie in MGP - / - muizen Afhankelijk BMP Signalering MGP - / - muizen werden met intraperitoneale (ip) injecties van ofwel ve. wordt verlaten, LDN-193.189 (LDN, 2,5 mg / kg / dag) of ALK3-Fc (2 mg / kg om de dag) en wild-type muizen werden behandeld met ip injecties voertuig beginnend op dag 1 van leven tot dag 28 . Op dag 27 werden muizen geïnjecteerd met calcium NIR via staartader. Aorta's werden geoogst op dag 28 en afgebeeld met nabij-infrarood fluorescentie. Afbeelding zijn bij dezelfde vergroting in vier panelen met de schaalbalk aangeeft 3 mm. Wildtype muizen aorta heeft calcium NIR signaal vertonen terwijl aorta van MGP - / - muizen een sterk signaal calcium NIR had. Vergeleken met met drager behandelde MGP - / - muizen, de aorta van MGP - / - muizen vertoonden behandeld met ofwel LDN of ALK3-Fc significant verminderd calcium NIR signalen. Dit cijfer is overgenomen uit referentie 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    3 "src =" / files / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Figuur 3: farmacologische remming van BMP Signalering Voorkomt aorta calcificatie bij MGP-deficiënte muizen Wild-type muizen werden behandeld met ip injecties van drager (A) en MGP - / - muizen werden behandeld met ofwel ip-injecties van drager (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / dag) of ALK3-Fc (D, 2 mg / kg om de dag) beginnend op dag 1 van leven tot dag 28. aorta's werden geoogst, doorgesneden en gekleurd voor calcium met alizarine rood. Beelden werden genomen op dezelfde vergroting in alle vier panelen met de schaal bar met vermelding van 400 pm. Vergelijkbaar met de calcium NIR signalen in figuur 2, de alizarine rood kleuring toont een zware calcificatie in de aorta's van met drager behandelde MGP - / - muizen. Verkalking is afgenomen in de aorta's van LDN- en ALK3-Fc-behandelde MGP - / - muizen. Dit cijfer is ontleend aanreferentie 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    . Figuur 4: gelijktijdige bepaling van Aorta calcificatie en infiltratie van macrofagen met calcium NIR en cathepsine NIR (A) wild-type MGP - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet werden geïnjecteerd met calcium NIR en cathepsine NIR via staartader injectie. Aorta's werden 24 uur later geoogst en beoordeeld met nabij-infrarood fluorescentie beeldvorming. Afbeeldingen op dezelfde vergroting met de schaalbalk aangeeft 3 mm. Wild-type muizen vertonen vrijwel geen aorta verkalking of macrofaag aanwezigheid. De aorta's van LDLR - / - muizen hebben uitgebreide calcificatie dat co-lokaliseert met macrofagen accumulatie. Daarentegen MGP - / - Muizen aorta calcificatie die optreedt in de afwezigheid van macrofaag infiltratie. (B) aorta's werden uit wild-type geoogst, MGP - / - en LDLR - / - muizen gevoed een vetrijk dieet. De aorta's werden doorgesneden en gekleurd voor macrofagen met een antilichaam specifiek voor MAC-2. Kernen werden gekleurd met DAPI. Het lumen oppervlak naar rechts in elk paneel. Beelden werden bij dezelfde vergroting in alle drie panelen met de schaalbalk 100 urn aangeeft. Zoals in het kader van (A), was er geen bewijs van macrofagen ophoping in de bloedvaten van MGP - / - muizen. Dit cijfer is een aangepaste versie van een figuur uit referentie 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    .jpg "/>
    . Figuur 5: MGP beschermt gekweekte VSMC van calcificatie Gekweekte aorta VSMC's werden geïsoleerd uit MGP - / - muizen geïnfecteerd met adenovirus hetzij GFP (A) of MGP (B). VSMC aorta geïsoleerd van wild-type muizen werden getransfecteerd met hetzij controle scrambled siRNA (C) of siRNA gericht MGP (D). Cellen werden gekweekt in calcificatie Media A gedurende 7 dagen en vervolgens gefixeerd en gekleurd met von Kossa. Beelden werden bij dezelfde vergroting in vier panelen (A - D) met de schaal balk die 200 urn. Serial gezichtsvelden werden gefotografeerd en gekwantificeerd voor calcium kleuring met behulp van het J software nadat achtergrond aftrekken (E en F), met foutbalken aangeeft SEM. Dit cijfer is een aangepaste versie van een figuur uit referentie 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 6
    Figuur 6:. Calcium NIR identificeert calcificatie in samenwerking met de extracellulaire matrix in vitro (A) Menselijke kransslagader VSMC gekweekt in calcificatie Media B gedurende 21 dagen werden geïdentificeerd door nucleaire kleuring met behulp van Hoechst kleurstof. (B) Een optische gedeelte verkregen door confocale microscopie van calcium NIR kleuring (rood) in combinatie met een groen-fluorescerend collageen probe toont gecalcificeerde minerale gehele collageenmatrix. Afbeeldingen A - B werden bij dezelfde vergroting van de schaal bar met vermelding van 10 micrometer. (C en D) Driedimensionale reconstructies tonen het invangen van calcifieke mineralen in tHij collageen matrix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Aderverkalking is een belangrijke risicofactor voor hart- en vaatziekten bij mensen en kunnen direct bijdragen aan de pathogenese van cardiovasculaire gebeurtenissen. 1,5,52 intima calciumafzetting in de dunne vezelige doppen van atherosclerose is voorgesteld om lokale biomechanische belasting bevorderen en zorgen plaquebreuk. 53,54 Mediale calcificatie effecten klinische resultaten door het verhogen van arteriële stijfheid, die cardiale hypertrofie kunnen veroorzaken en beïnvloeden de hartfunctie. 55 Derhalve begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculaire calcificatie zullen inzicht in menselijke ziekten en eventueel ook het identificeren van nieuwe doelen voor behandeling.

    Hier wordt een werkwijze voor het detecteren aorta calcificatie en macrofaag accumulatie in muismodellen van atherosclerose en vasculaire calcificatie gebruik NIRF beeldvorming beschreven. 9 Het is cruciaal om nauwkeurig injecteren NIRF agenten in de staartader. Dit is een techniek die aanzienlijke oefenen voordat beheersing bereikt vereist. 56 Bovendien is het belangrijk om alle peri-aorta vet van de aorta verwijderd, aangezien dit vet een autofluorescerende signaal op dezelfde golflengte als de calcium NIR en cathepsine kunnen veroorzaken NIR signalen. Het gebruik van NIRF agenten heeft veel belangrijke voordelen ten opzichte van standaard histologische methoden ter evaluatie van vasculaire calcificatie en ontsteking. In tegenstelling tot conventionele histologische technieken, deze middelen maken de kwantificering van gehele aorta calcificatie en macrofaag infiltratie. Bovendien bieden ze een gevoelige methode voor het detecteren van vroege veranderingen geassocieerd met de ontwikkeling van aorta calcificatie dan histologische kleuring en kunnen we mechanistische inzichten in eerdere stadia van de ziekte. 9 locaties vroege calcium NIR signaal geassocieerd met markers van botvorming waaronder verhoogde alkalische fosfatase activiteit als well als Runx2 en osteopontine genexpressie. Bovendien is het gelijktijdig gebruik van spectraal verschillende probes voor verkalking en cathepsine activiteit maakt kwantificering en associatie van de spatiotemporele progressie van zowel atheromateuze en calcific ziekte. 9

    Het identificeren van de ruimtelijke en temporele karakteristieken van vasculaire calcificatie en ontsteking aids in ons begrip van de onderliggende pathofysiologische mechanismen van vasculaire ziekte. Zo is het gebruik van NIRF middelen aangetoond dat bij modellen van intimale verkalking (ApoE - / - en LDLR - / - muizen op een vetrijk dieet), vasculaire calcificatie co-lokaliseert naar sites van macrofaag accumulatie (Figuur 4) en dat verkalking volgt de accumulatie van macrofagen tijdelijk. 9,11 Interessant is dat geen macrofagen accumulatie met cathepsine NIR werd ontdekt in de mediale vasculaire calcificatie in MGP-deficiënte muizen. 25 Dons, uit experimenten met gebruikmaking NIRF middelen, kan worden geconcludeerd dat hoewel macrofaag accumulatie geassocieerd met vasculaire intimale verkalking, is het niet vereist dat vasculaire calcificatie mediale.

    Vergelijkbaar met zijn rol in de beeldvorming en het bestuderen vaatziekte is NIRF imaging is gebruikt om aortakleplijden bestuderen. 47 aortakleplijden wordt gekenmerkt door lipide geladen macrofagen en gecalcificeerde laesies op de klep en vertoont vergelijkbare onderliggende moleculaire mechanismen en genetische determinanten atherosclerose . 57-59 aorta klep verkalking veroorzaakt aantasting van de folder functie en is de primaire oorzaak van de klinische aortastenose bij ouderen. De enige behandeling die momenteel beschikbaar zijn voor de symptomatische aortastenose is klepvervanging. Een beter begrip van de moleculaire mechanismen van aortakleplijden moet worden voorkomen dat de late-fase klinische complicaties progressieve aortaklep calcificatie. Benutting van NIRF agenten als moleculaire imaging-tools in dierlijke modellen biedt een gevoelige methode voor het bepalen van de aortaklep ziekte in de vroegste stadia. 60

    Standaardtechnieken visualiseren coronaire plaques hebben zich geconcentreerd op de ernst van de stenose, maar de meerderheid van acute coronaire syndromen gevolg van breuk van niet-stroombeperkende plaques. 6 Biologische processen binnen plaques, zoals ontsteking, dienen als betere voorspellers van plaque dan de mate van stenose. 61 In tegenstelling tot conventionele beeldvormende technieken, NIRF beeldvorming biedt de mogelijkheid om cellulaire activiteit (dat wil zeggen, macrofaag proteolytische activiteit met een matrix metalloproteïnase (MMP) activeerbare middel, proteolytische en elastolytische activiteit cathepsine NIR en osteogene activiteit te meten met calcium NIR). 9 Deze werkwijze voorziet derhalve gelijktijdige functionele en anatomische evaluatie van cardiovasculaire ziekte. NIRF beeldvorming maakt gebruik van excitation golflengten in het 650-900 nm bereik, die het voordeel van verhoogde penetratie heeft in vergelijking met licht bij een lagere golflengte, zodat meer diepte van de ziekteactiviteit laesies. 60 Er wordt ook verminderd autofluorescente achtergrondsignaal vaatweefsel in de buurt -Infrarood golflengtegebied. Hoewel dit protocol oog op de ontwikkeling van NIRF imaging ex vivo, NIRF beeldvorming is ook een nuttig platform voor longitudinale moleculaire beeldvorming in vivo. 9 NIRF beeldvorming in combinatie met intravitale microscopie, zouden toekomstige diagnostische toepassingen in mensen. 61 echter een beperking calcium NIR imaging lengterichting is dat de bisfosfonaat afgeleide probe mag zich af aan het fysiologische proces van verkalking. 62

    Cardiovasculaire calcificatie is een actief geregeld proces dat de transdifferentiatie van VSMC een osteogene fenotype omvat. 25,41,42 63 en heeft voldoende aantallen cellen per muis aorta verwezenlijkt in vitro studies (figuur 5) uitgevoerd. Een alternatieve meThOD voor VSMC isolatie niet enzymatische afbraak, maar veeleer de directe cultuur van geëxplanteerde aorta ringen te betrekken; Deze techniek is beschreven dat minder cellen dan de techniek gebruik enzymatische digestie verkregen. 63,64

    Twee verschillende verkalking media, hetzij βGP / Asc / DEX 65,66 of NaPhos, 25,43 beschreven die kunnen worden gebruikt om verkalking van VSMC induceren. Beide soorten media zijn gebruikt om murine VSMCs met vergelijkbaar succes te verkalken. Terwijl de verkalking medium dat βGP / Asc / DEX werd toegepast om menselijke VSMC's (figuur 6) verkalken, heeft het medium met NaPhos niet effectief verkalkende menselijke VSMC's in onze ervaring. Bovendien, 21 - kunnen 28 dagen van de cultuur van de menselijke VSMC's in verkalking Media B worden vereist voordat verkalking wordt gedetecteerd. Verkalking van wildtype VSMC's in vitro was verhoogd expressieniveau van MGP werd gereduceerd met siRNA en calcification werd verminderd MGP - / - VSMC bij MGP expressie werd hersteld (figuur 5). Deze bevindingen komen overeen met de aorta verkalking waargenomen MGP - / - muizen en suggereren dat deze in vitro werkwijze VSMC calcificatie dient als een bruikbaar model van in vivo calcificatie. Het is belangrijk op te merken echter dat er beperkingen zijn in het trekken van conclusies ten aanzien van intacte bloedvaten uit gekweekte VSMC's. Gekweekte VSMC's kunnen verliezen hun in vivo contractiele eigenschappen, met name bij hogere passages, naast de ontwikkeling veranderingen in genexpressie patronen, morfologie en stijfheid. 67-70 VSMC gekweekt in verkalkende media kan differentiëren tot een osteoblastische lijn voor calcificatie, maar niet vertonen een chondrocyte tussenproduct dat vaak in vivo wordt waargenomen. 71 daarom is het belangrijk dat mechanistische conclusies uit gekweekte cellen worden gevalideerd in in vivo systemen. Ope mogelijke methode van het overwinnen van deze beperking is om VSMC's in hun in vivo toestand te bestuderen met behulp van een beschaafde intact vat ring. 70

    Twee verschillende methoden voorgesteld voor het detecteren van verkalking van gekweekte VSMC, de von Kossa werkwijze (Figuur 5) en calcium NIR kleuring (figuur 6). Hoewel vaak gebruikt om te beoordelen voor calcificatie, is de von Kossa werkwijze enigszins beperkt door de beperkte specificiteit voor calciumkristallen. 50 Calcium NIR wordt ervaren specifiek voor calcificatie en is bijzonder voordelig doordat het zorgt voor gelijktijdige kleuring met extra spectraal verschillend fluorescent agenten. 9 Toekomstige toepassingen van dit protocol gebruik te maken van calcium NIR met aanvullende moleculaire probes kunnen belangrijke inzichten in de mechanismen van verkalking te bieden en kan de snelle beoordeling van kleine molecule remmers van VSMC verkalking in te schakelen in een high-throughput wijze, naar IDEntify potentiële nieuwe therapieën voor vasculaire calcificatie.

    Samengevat, cardiovasculaire calcificatie is een belangrijke risicofactor voor potentiële bijdrage aan klinische ziekte. Kennis van de mechanismen van cardiovasculaire verkalking en atherosclerotische -pathologie zowel dierlijke cellen gebaseerde modellen. Methoden ter beoordeling van calcificatie in in vivo, ex vivo en in vitro modellen zijn cruciaal voor ons begrip van hart-en vaatziekten te bevorderen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter