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Medicine

संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और महाधमनी कड़ा हो जाना और सूजन की इमेजिंग की हड्डी बन जाना

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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जहां यह सालाना 780,000 से अधिक लोगों की मृत्यु के लिए खातों हृदय रोग दुनिया में रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण, संयुक्त राज्य अमेरिका सहित है। 1 कोरोनरी धमनी कड़ा हो जाना और महाधमनी कड़ा हो जाना atherosclerotic रोग की पहचान कर रहे हैं और हृदय की घटनाओं के रूप में मजबूत भविष्यवक्ताओं सेवा करते हैं। 2- , intimal कड़ा हो जाना atherosclerosis के साथ जुड़े हैं, और औसत दर्जे का कड़ा हो जाना, क्रोनिक किडनी रोग और मधुमेह के साथ जुड़े (के रूप में भी जाना जाता है Mönckeberg) 5 अंत: कड़ा हो जाना लिपिड संचय और मैक्रोफेज की सेटिंग में होता है: 4 दो संवहनी कड़ा हो जाना के मुख्य प्रकार वयस्कों की रिपोर्ट में किया गया है। पोत दीवार में घुसपैठ। 5,6 औसत दर्जे का दीवार कड़ा हो जाना के आणविक तंत्र पर intimal कड़ा हो जाना की स्वतंत्र रूप से होता है, इलास्टिन फाइबर या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए localizes, और लिपिड बयान या बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के साथ संबद्ध नहीं है। 5,7,8 अध्ययनसंवहनी कड़ा हो जाना सेल आधारित और पशु मॉडल प्रणाली पर भरोसा किया है। Atherocalcific रोग के लिए कृंतक मॉडल, या तो apolipoprotein ई (ApoE) 9,10 या कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) 11 एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया में चूहों की कमी शामिल है, जबकि औसत दर्जे का कड़ा हो जाना के लिए मॉडल मैट्रिक्स Gla प्रोटीन के साथ चूहों में शामिल हैं (एमजीपी) की कमी 12 या चूहों कि या तो पास कुल nephrectomy (5/6 nephrectomy मॉडल) द्वारा या एक उच्च adenine आहार के लिए जोखिम के यूरीमिया विकसित करना। 13

इधर, औसत दर्जे का संवहनी एमजीपी की कमी के साथ जुड़े कड़ा हो जाना के मॉडल पर ध्यान केंद्रित किया है। एमजीपी एक बाह्य प्रोटीन है कि धमनी कड़ा हो जाना रोकता है। एमजीपी जीन में म्यूटेशन 12 Keutel सिंड्रोम, एक दुर्लभ मानव रोग brachytelephalangy के अलावा फैलाना उपास्थि कड़ा हो जाना द्वारा विशेषता, सुनवाई हानि, और परिधीय फेफड़े के एक प्रकार का रोग में पहचान की गई है। 14-18 हालांकि नहीं अक्सर मनाया, 19कई धमनियों का कड़ा हो जाना गाढ़ा Keutel सिंड्रोम में वर्णित किया गया है। मानव एमजीपी जीन में 20 आम बहुरूपताओं कोरोनरी धमनी कड़ा हो जाना के लिए बढ़ा खतरा, 21-23 के साथ जुड़े रहे uncarboxylated, जैविक रूप से निष्क्रिय एमजीपी के उच्च स्तरों घूम हृदय मृत्यु दर की भविष्यवाणी करते हुए। 24 मनुष्य के विपरीत Keutel सिंड्रोम के साथ, एमजीपी की कमी चूहों की उम्र के दो सप्ताह में शुरू करने और जन्म के बाद 6-8 सप्ताह मर महाधमनी फटने के कारण सहज व्यापक धमनी कड़ा हो जाना से मिलकर एक गंभीर संवहनी phenotype का विकास। 12

ApoE के विपरीत - / - और LDLR - / - चूहों एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया, जो जुड़े मैक्रोफेज प्रेरित सूजन के साथ intimal संवहनी कड़ा हो जाना विकसित करने, एमजीपी - / -। चूहों बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के अभाव में औसत दर्जे का संवहनी कड़ा हो जाना विकसित 11,25 यद्यपि इन निष्कर्षों Intim के लिए अलग अंतर्निहित उत्तेजनाओं का सुझावअल और औसत दर्जे का कड़ा हो जाना, वहाँ संकेतन तंत्र है कि कड़ा हो जाना। 26 एकाधिक संकेत दे रास्ते पहचान की गई है के दोनों रूपों है कि इस तरह के ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α और आईएल -1 और समर्थक osteogenic कारकों के रूप में सूजन मध्यस्थों सहित संवहनी कड़ा हो जाना करने के लिए योगदान मध्यस्थता में ओवरलैप है इस तरह के पायदान, wnt, और हड्डी morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेत है। 27,28 के रूप में ये संकेत दे रास्ते प्रतिलेखन कारक छोटा सा व्यक्ति से संबंधित प्रतिलेखन कारक 2 (Runx2) और osterix, जो बारी में हड्डी से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने की अभिव्यक्ति (वृद्धि । जैसे, osteocalcin, sclerostin, और क्षारीय फॉस्फेट) वाहिका कि कड़ा हो जाना मध्यस्थता में 28-30 हम और दूसरों को दिखा दिया है कि संवहनी कड़ा हो जाना ApoE में मनाया - / - और LDLR - / - चूहों एक उच्च वसा वाले आहार और सहज तंग आ गया संवहनी कड़ा हो जाना में एमजीपी मनाया - / - चूहों सब हड्डी morphogenetic प्रोटीन पर निर्भर (बीएमपी) signaling, और यह इस मार्ग है कि यहाँ पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। 11,25,31 BMPs शक्तिशाली osteogenic हड्डी गठन के लिए आवश्यक कारक हैं और मानव atherosclerosis में वृद्धि की अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है। 32-34 में इन विट्रो अध्ययन के विनियमन में बीएमपी सिगनल फंसा है ऐसे Runx2 के रूप में osteogenic कारकों की अभिव्यक्ति। बीएमपी ligand के 35-37 overexpression, बीएमपी -2, एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया ApoE की कमी चूहों में संवहनी कड़ा हो जाना का विकास इसके अलावा इस तरह के संकेत अवरोधकों विशिष्ट बीएमपी के उपयोग accelerates। 38, LDN-193189 (LDN) के रूप में 39,40 और / या ALK3-एफसी दोनों LDLR में संवहनी कड़ा हो जाना के विकास को रोकता - / - चूहों एक उच्च वसा वाले आहार और एमजीपी की कमी चूहों तंग आ 11,25।

संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) संवहनी कड़ा हो जाना के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका औसत दर्जे का संवहनी कड़ा हो जाना कि में विकसित करता है। 30,41,42 एमजीपी की कमी चूहों चरित्र हैएक osteogenic phenotype के लिए VSMCs की एक transdifferentiation द्वारा terized। myocardin और अल्फा चिकनी पेशी actin सहित VSMC मार्कर की कमी आई है अभिव्यक्ति में एमजीपी परिणामों की हानि, ऐसे Runx2 और osteopontin के रूप में osteogenic मार्कर में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ। इन परिवर्तनों संवहनी कड़ा हो जाना के विकास के साथ मेल खाना। 25,43,44

महाधमनी कड़ा हो जाना और चूहों में सूजन आम तौर पर इस तरह के जल्दी कड़ा हो जाना और osteogenic गतिविधि, देर से कड़ा हो जाना के लिए वॉन Kossa और Alizarin लाल धुंधला के लिए alkaline फॉस्फेट गतिविधि और immunohistochemical प्रोटोकॉल है कि बृहतभक्षककोशिका प्रोटीन मार्कर (जैसे। लक्ष्य के रूप में histochemical तकनीक का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं, CD68, F4 / 80, मैक-1, मैक-2, मैक-3)। 9,45 हालांकि, इन मानक इमेजिंग तकनीक के पार वर्गों में महाधमनी के ऊतकों के प्रसंस्करण, जो नमूना पूर्वाग्रह की वजह से समय लगता है और अपूर्ण है की आवश्यकता होती है, और में सीमित कर रहे हैं उनके सूजन और calcificat यों की क्षमतापूरे महाधमनी में आयन। इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन कल्पना और पूरे महाधमनी और मध्यम आकार के धमनी कड़ा हो जाना और मैक्रोफेज संचय लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट (NIR) आणविक इमेजिंग पूर्व vivo उपयोग यों की। इसके अलावा प्रदान की कटाई और चूहों से प्राथमिक महाधमनी VSMCs संवर्धन और उत्प्रेरण के लिए एक विधि है आदेश में murine और इन विट्रो में मानव VSMCs का कड़ा हो जाना संवहनी कड़ा हो जाना अंतर्निहित आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए। इन तकनीकों में विवो में और atherocalcific रोग के अध्ययन के लिए इन विट्रो तरीकों में दोनों के साथ अन्वेषक प्रदान करते हैं।

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Protocol

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चूहों के साथ सभी अध्ययनों की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया। हाउसिंग और इस अध्ययन में वर्णित चूहों से जुड़े सभी प्रक्रियाओं मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों (उपसमिति पर रिसर्च पशु की देखभाल) द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी प्रक्रियाओं पीड़ा को कम करने के लिए देखभाल के साथ प्रदर्शन किया गया।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. नियर-इन्फ्रारेड प्रतिदीप्ति पूरे Aortas की इमेजिंग
    नोट: क। बिसफ़ॉस्फ़ोनेट व्युत्पन्न, लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच हाइड्रॉक्सियापटाइट के बंधन से 46,47 वाहिका में osteogenic गतिविधि चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक cathepsin सक्रिय फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच बृहतभक्षककोशिका प्रोटिओलिटिक और elastolytic गतिविधि के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं वाहिका। 9 दोनों फ्लोरोसेंट जांच का एक साथ उपयोग अनुमति देने के लिए, यह महत्वपूर्ण हैजांच जो प्रेतसंबंधी अलग कर रहे हैं का उपयोग करें। संकेतन कैल्शियम NIR कड़ा हो जाना-विशिष्ट लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच और cathepsin NIR cathepsin गतिविधि-विशिष्ट लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच से संकेत मिलता है इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    1. कैल्शियम NIR और cathepsin NIR का समाधान तैयार करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, कैल्शियम NIR या cathepsin NIR के 24 nmol युक्त शीशी 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1.2 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे से हिला।
      नोट: निर्माता के अनुसार, एक बार पीबीएस के साथ पुनर्गठन, कैल्शियम NIR और cathepsin NIR समाधान 14 दिनों के लिए स्थिर रहेगा जब 2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत।
  2. अलगाव और murine महाधमनी VSMCs की हड्डी बन जाना
    1. महाधमनी पाचन समाधान:
      1. हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) के साथ एक ताजा समाधान (~ 3-5 मिलीलीटर प्रति महाधमनी काटा) 175 यू / एमएल प्रकार से युक्त 2 कोलैजिनेज़ और 1.25 यू / एमएल elastase तैयार करें। समाधान डब्ल्यू जीवाणुरहितएक 0.22 माइक्रोन वैक्यूम संचालित छानने का काम प्रणाली ith और उपयोग करें जब तक बर्फ पर समाधान रखें।
    2. सेल मीडिया:
      1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 500 मिलीलीटर अनुपूरक। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया का उपयोग करने से पहले गर्म।
    3. कड़ा हो जाना मीडिया:
      1. कड़ा हो जाना मीडिया (NaPhos; माउस सेल लाइनों में प्रयुक्त):
        1. (जरूरत के रूप में मात्रा) अनुपूरक DMEM के 100-500 मिलीलीटर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी सोडियम फास्फेट, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया का उपयोग करने से पहले गर्म।

          या
      2. कड़ा हो जाना मीडिया बी (βGP / ए एस सी / DEX, या तो माउस या मानव कोशिका लाइनों में प्रयुक्त):
        1. अनुपूरक DMEM के 100-500 मिलीलीटर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ, 10 मिमी β-glycerophosphate Disodium, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एल ascorbic एसिड, 10 (जरूरत के रूप में मात्रा)एनएम dexamethasone, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया का उपयोग करने से पहले गर्म।

2. पूंछ नस इंजेक्शन

  1. पूंछ इंजेक्शन से पहले, 5 मिनट के लिए एक हल्के हीटिंग दीपक के तहत चूहों गर्म है।
  2. एक ट्यूब कृंतक धारक में माउस को नियंत्रित। एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ कीटाणुरहित।
  3. पूंछ नस में इंजेक्शन के लिए एक 30 जी सुई का उपयोग। पूंछ नसों laterally स्थित हैं।
    1. सिरिंज पर आगे दबाव के एक सज्जन राशि लागू रूप में सुई पूंछ में उन्नत है। नस पहुँचा एक बार इंजेक्शन के लिए प्रतिरोध अब मौजूद नहीं है।
    2. एक स्थिर दर पर कैल्शियम NIR के 100 μl और / या cathepsin NIR के 100 μl की एक मात्रा इंजेक्षन। इंजेक्शन के अंत में, एक 5 सेकंड के ठहराव के बाद, सुई वापस ले लें।
  4. aortas (धारा 3 देखें) इंजेक्शन के बाद 3-24 मानव संसाधन हार्वेस्ट।

3. माउस विच्छेदन

  • एक 200 मिलीग्राम / किग्रा intraperitoneal pentobarbital इंजेक्शन के साथ माउस euthanize।
  • विच्छेदन बोर्ड पर पशु लापरवाह निर्धारित करना और बोर्ड के लिए प्रत्येक पंजा टेप से स्थिर। एक विदारक माइक्रोस्कोप और छोटे कैंची का प्रयोग, एक midline चीरा पेट के निचले हिस्से से ऊपरी छाती के लिए बढ़ा सकते हैं।
  • संदंश के साथ त्वचा वापस छील और पेरिटोनियम हटाने, पेट अंगों खुलासा। जठरांत्र अंगों निकालें, देखभाल करने के महाधमनी आड़ा काट करने के लिए नहीं।
  • पूर्वकाल डायाफ्राम में एक पार्श्व चीरा और पेट भर चीरा जारी है। विच्छेदन कैंची का प्रयोग, पसलियों के पक्ष के माध्यम से काटने और उरोस्थि के बेहतर भाग के लिए नरम ऊतक पक्षपाती हटाने के द्वारा ribcage जारी। ribcage निकालें, फेफड़ों खुलासा।
  • और ध्यान से फेफड़ों को हटाने (पहचान करने और समीपस्थ महाधमनी विदारक में सहायता करने के लिए) शुरू में जगह में दिल छोड़ दें। थाइमस, श्वासनली, और देखभाल, ensuri साथ घेघा हटायेएनजी कि महाधमनी बरकरार है।
  • सीधे ठीक संदंश और सूक्ष्म विदारक कैंची का प्रयोग, महाधमनी चाप को श्रोणिफलक विभाजन से महाधमनी आसपास के कोमल ऊतकों को हटाने, सावधान ध्यान दे जब पेरी महाधमनी वसा (चित्रा 1 ए) को हटाने। महाधमनी चाप (यानी, प्रगंडशीर्षी, आम मन्या और subclavian धमनियों, चित्रा 1 बी) की बड़ी शाखाओं के आसपास के शेष वसा और कोमल ऊतकों निकालें।
    नोट: यह महाधमनी से चर्बी हटाने के लिए है क्योंकि वसा पृष्ठभूमि संकेत वृद्धि कर सकते हैं जब प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन जरूरी है।
  • वक्ष गुहा से दिल निकालें, ध्यान से समीपस्थ महाधमनी से यह detaching, और त्यागें। श्रोणिफलक विभाजन पर बाहर का महाधमनी आड़ा काट। एक इंसुलिन सुई का प्रयोग, शेष रक्त कोशिकाओं को बाहर धोने के लिए महाधमनी चाप से महाधमनी में सामान्य नमक इंजेक्षन। महाधमनी चाप जहाजों के साथ महाधमनी को अलग करें, पूरी तरह से इसे हटानेशरीर से।
  • बर्फ पर सामान्य नमक के घोल में महाधमनी इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक रखें।
  • 4. महाधमनी इमेजिंग

    1. छवि aortas पूर्व vivo तुरंत लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति reflectance इमेजिंग द्वारा फसल के बाद। 25
      1. निर्माता के अनुसार उचित मल्टीचैनल तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति इमेजर सेट, कैल्शियम NIR और cathepsin NIR इंजेक्शन चूहों की aortas से प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता यों के रूप में पहले से वर्णित। 25, कैल्शियम NIR ~ 650-678 एनएम के साथ प्रकाश से उत्साहित किया जा सकता है ~ 680-700 एनएम रेंज में एक अधिक से अधिक उत्सर्जन। Cathepsin NIR ~ 770 एनएम पर एक अधिक से अधिक उत्सर्जन के साथ ~ 745-750 एनएम प्रकाश से उत्साहित किया जा सकता है।

    5. प्राथमिक Murine महाधमनी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव

    1. जैसा कि ऊपर वर्णित चरणों 3.1-3.7 प्रदर्शन करना।
    2. ठंड HBSS में aortas रखें जब तक विच्छेदन पूरा कर रहे हैं। ध्यान से किसी भी रेम दूर कटौतीperiaortic वसा और कोमल ऊतकों aining, केवल महाधमनी जा रही है।
    3. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड के तहत, 35 मिमी x 10 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन में महाधमनी पाचन समाधान करने के लिए aortas हस्तांतरण। कोमल रुक-रुक कर कमाल के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखें। पाचन के बाद, aortas बढ़ाकर या अस्तव्यस्त उपस्थिति दिखा रहे हैं।
    4. विच्छेदन माइक्रोस्कोप और बाँझ संदंश के साथ, जबकि औसत दर्जे परत बरकरार रखने महाधमनी की बाहरी परत को हटाने adventitial। adventitia को हटाने के लिए एक तकनीक एक छोर पर महाधमनी की बाहरी परत दूर छील और अंतर्निहित औसत दर्जे परत एक जुर्राब की तरह वापस खुली किया जा सकता है और हटाया से इसे हटाने के लिए है।
    5. एक बार जब adventitial परत हटा दिया गया है, 2-4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति मीडिया और दुकान के साथ एक नए ऊतक संस्कृति डिश में शेष महाधमनी जगह है।
    6. एक बाँझ हुड और बाँझ 3 मिमी सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग तहत, 1-2 मिमी चौड़े में महाधमनी में कटौतीबजता है।
    7. महाधमनी पाचन समाधान के साथ एक नए ऊतक संस्कृति डिश में इन छल्लों की जगह और कोमल रुक-रुक कर 120 मिनट के लिए कमाल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। समाधान और इस ऊष्मायन कोशिकाओं resuspend के दौरान कई बार नीचे पिपेट।
    8. पाचन समाधान और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए गर्म सेल संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. अपकेंद्रित्र 200 x जी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब।
    10. सेल संस्कृति मीडिया (जैसे, 5 एमएल) के वांछित मात्रा में मीडिया और resuspend कोशिकाओं aspirate।
    11. एक 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में प्रत्येक महाधमनी से अलग कक्षों की पूरी राशि की थाली और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। , मानक तकनीक का उपयोग कोशिकाओं प्रचार के रूप में पहले से वर्णित। 25,48 ऊष्मायन के प्रारंभिक 7-10 दिनों के दौरान, मीडिया हर 72-96 मानव संसाधन बदल जाते हैं। कोशिकाओं संगम दृष्टिकोण के रूप में, मीडिया को अधिक बार फिर से भरना (हर 48 घंटा)।
      नोट: यह कई सप्ताह लेने के लिए पर्याप्त योग्यता के रूप में विकसित करने के लिए कर सकते हैंकोशिकाओं के ntity।
    12. एक बार मिला हुआ, trypsin के साथ पारित होने कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है।
      1. प्रत्येक संस्कृति फ्लास्क trypsin के 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए सेते हैं; धीरे कुप्पी की ओर हर 30-60 सेकंड के रूप में सतह से कोशिकाओं को अलग करने की जरूरत नल।
      2. एक बार कोशिकाओं कुप्पी के नीचे से अलग, trypsin में कोशिकाओं के लिए सेल मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सेल गोली से मीडिया और trypsin aspirate। ताजा मीडिया सेल (जैसे, 5-10 मिलीग्राम) के वांछित राशि में कोशिकाओं resuspend और एक नई कुप्पी (कुछ कोशिकाओं को एक चैम्बर स्लाइड को हस्तांतरित के साथ) के लिए स्थानांतरण।
    13. कोशिकाओं के पहले पारित होने पर, मानक immunocytochemistry तकनीकों के साथ चिकनी पेशी सेल वंश की पुष्टि के रूप में पहले 49 में वर्णित एक एंटीबॉडी α चिकनी पेशी actin के खिलाफ निर्देशित इस्तेमाल करते हैं।

    6. संवर्धित चिकनी पेशी के उत्प्रेरण कड़ा हो जानाप्रकोष्ठों

    1. प्लेट कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्रारूप में 5.12 से प्राप्त की। नोट: 1 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सेल मीडिया के 2.0 मिलीलीटर की कुल मात्रा में साथ शुरू प्रति अच्छी तरह से सिफारिश की है।
    2. कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में कम से कम 7 दिनों के लिए कड़ा हो जाना मीडिया ए या बी में विकसित करने के लिए अनुमति दें। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. सेल मीडिया परिवर्तन हर 48 घंटा।

    7. वॉन Kossa धुंधला विधि का प्रयोग VSMC कड़ा हो जाना आकलन

    नोट:। ऊतकों या संवर्धित कोशिकाओं के बाह्य मैट्रिक्स कड़ा हो जाना मापने के लिए वॉन Kossa विधि चांदी आयनों के साथ फॉस्फेट बाध्य कैल्शियम आयनों के प्रतिस्थापन पर आधारित है 50 प्रकाश और कार्बनिक यौगिकों की उपस्थिति में, चांदी आयनों कम और धातु के रूप में कल्पना कर रहे हैं चांदी। किसी भी unreacted चांदी सोडियम thiosulfate साथ इलाज के द्वारा हटा दिया जाता है 50 वॉन Kossa धुंधला के लिए प्रोटोकॉल के रूप में निम्नानुसार है।:

    1. सेल घन से महाप्राण मीडियाlture प्लेटें।
    2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10% formalin के 1 मिलीलीटर में उन्हें रखने के द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. formalin निकालें और 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ तय की कोशिकाओं धो लें।
    4. 1-2 घंटे के लिए एक 60-100 डब्ल्यू बल्ब के तहत 5% चांदी नाइट्रेट समाधान के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. चांदी नाइट्रेट समाधान Aspirate और 5 मिनट के लिए आसुत जल से धो लें।
    6. 5% सोडियम thiosulfate के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं रखने (डब्ल्यू / वी) 5 मिनट के लिए आसुत जल में समाधान द्वारा unreacted चांदी निकालें।
    7. 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ कोशिकाओं कुल्ला। दोहराएँ washes 3x। वॉन Kossa दाग मानक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए तैयार है।
    8. वैकल्पिक कदम: 5 मिनट के लिए परमाणु फास्ट लाल के 1ml साथ Counterstain। आसुत जल (5 मिनट प्रत्येक) के साथ तीन washes के साथ इस का पालन करें।

    या

    8. पास अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ VSMC कड़ा हो जाना आकलन

    नोट: अपनी क्षमता के समानमाउस aortas भीतर कड़ा हो जाना पहचान करने के लिए, कैल्शियम NIR आसानी से चूनेवाला खनिज संवर्धित कोशिकाओं द्वारा जमा बांधता है। लंबे तरंगदैर्ध्य फिल्टर के साथ इस तकनीक, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और प्लेट पाठकों का उपयोग कर छवि और इन विट्रो कड़ा हो जाना यों कर सकते हैं, क्रमशः। कैल्शियम NIR की लंबी तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन कम तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन fluorophores के एक साथ उपयोग अन्य सुविधाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। कैल्शियम NIR धुंधला के लिए प्रोटोकॉल इस प्रकार है:

    1. धारा 1.1.1 में वर्णित है, कैल्शियम NIR के 24 nmol युक्त शीशी के लिए 1x पीबीएस के 1.2 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. उचित कड़ा हो जाना या नियंत्रण मीडिया में 100: पतला कैल्शियम NIR शेयर 1।
    3. संस्कृति प्लेटों से महाप्राण सेल मीडिया और कैल्शियम NIR युक्त संस्कृति मीडिया के साथ बदलें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कैल्शियम NIR मीडिया के साथ संस्कृति प्लेटें सेते हैं।
    5. कुओं से मीडिया Aspirate और पीबीएस के साथ एक बार कुओं धो लें।
      नोट: इस बिंदु पर,मूल संस्कृति मीडिया कुओं को जोड़ा जा सकता है, और कोशिकाओं को लाइव imaged किया जा सकता है। अन्यथा, नीचे दिए गए चरणों के लिए आगे बढ़ें।
    6. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10% formalin के 1 मिलीलीटर में उन्हें रखने के द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें।
    7. formalin निकालें और 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ तय की कोशिकाओं धो लें। दोहराएँ washes 3x।
    8. वैकल्पिक कदम:। Immunofluorescence धुंधला या ब्याज की प्रोटीन के लिए अन्य counterstains प्रदर्शन करना 8,9
    9. छवि या उचित प्रतिदीप्ति उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (जैसे, कैल्शियम NIR 650-678 एनएम प्रकाश से उत्साहित किया जा सकता है) और उत्सर्जन फिल्टर (~ 680-700 एनएम) का उपयोग कैल्शियम NIR दाग का पता लगाने।

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    Representative Results

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    / - - एमजीपी में महाधमनी कड़ा हो जाना और जंगली प्रकार चूहों कैल्शियम NIR प्रतिदीप्ति की इमेजिंग का उपयोग मापा गया था। कोई कैल्शियम NIR संकेत प्रकार के जंगली चूहों से aortas में पता चला था, कड़ा हो जाना की अनुपस्थिति (चित्रा 2) का संकेत है। एक मजबूत कैल्शियम NIR संकेत एमजीपी की कमी चूहों, जो उन्नत संवहनी कड़ा हो जाना के साथ संगत है से aortas में पाया गया था। जंगली प्रकार और से aortas के ऊतक वर्गों एमजीपी - / -, व्यापक संवहनी कड़ा हो जाना कोई कड़ा हो जाना प्रकार के जंगली चूहों में पाया साथ एमजीपी की कमी चूहों में मनाया की पुष्टि - चूहों Alizarin लाल 25 (बी चित्रा 3) के साथ दाग रहे थे। निर्धारित करें कि क्या संवहनी एमजीपी की कमी के साथ जुड़े कड़ा हो जाना बीएमपी सिगनल पर निर्भर है, एमजीपी - / - चूहों जीवन के दिन 1 पर शुरू LDN, ALK3-एफसी, या वाहन के साथ इलाज किया गया। इन चूहों को 27 दिन पर कैल्शियम NIR के साथ इंजेक्शन थे औरaortas अगले दिन काटा गया। बीएमपी के Pharmacologic निषेध महाधमनी कड़ा हो जाना कैल्शियम NIR (चित्रा 2) के साथ पाया कम हो संकेत है। कैल्शियम NIR के साथ निष्कर्षों के लिए इसी प्रकार, LDN- और aortas ALK3-एफसी इलाज एमजीपी - / - चूहों कैल्शियम के लिए Alizarin लाल दाग कम था जब वाहन का इलाज एमजीपी की तुलना में - / - चूहों (चित्रा 3 बी - डी)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बीएमपी सिगनल एमजीपी में मनाया संवहनी कड़ा हो जाना के लिए आवश्यक है - / - चूहों।

    LDLR - / - चूहों एमजीपी में खिलाया एक उच्च वसा वाले आहार दोनों मैक्रोफेज सूजन और धमनियों की दीवार का कड़ा हो जाना विकसित चूनेवाला और cathepsin विशेष की 11 एक साथ पूंछ नस इंजेक्शन NIR जांच -। / - चूहों को निर्धारित करने के लिए किया गया था कि अगर एमजीपी के संवहनी कड़ा हो जाना -deficiency बृहतभक्षककोशिका संचय के साथ जुड़ा हुआ है 25 LDLR -। / - चूहों से तंग आ गयाएक उच्च वसा वाले आहार और जंगली प्रकार चूहों में क्रमश: सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। जंगली प्रकार चूहों से Aortas वस्तुतः कोई कैल्शियम NIR या cathepsin NIR संकेत, के रूप में प्रत्याशित (चित्रा 4 ए) का प्रदर्शन किया। / - - सह स्थानीय कैल्शियम NIR और cathepsin NIR का संकेत है कि महाधमनी चाप क्षेत्र इष्ट LDLR में मनाया गया चूहों, intimal atherosclerosis के इस मॉडल में बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ और नाड़ी कड़ा हो जाना के बीच एक मजबूत सहयोग का संकेत है। / - - हालांकि एक फैलाना और मजबूत कैल्शियम NIR संकेत एमजीपी के aortas में मनाया गया चूहों, cathepsin NIR संकेत प्रकार के जंगली चूहों के उस से अलग नहीं था। इन नतीजों से संकेत मिलता है कि एमजीपी कमी में संवहनी कड़ा हो जाना बृहतभक्षककोशिका संचय के अभाव में होता है। / - - और LDLR - आगे इन निष्कर्षों, जंगली प्रकार, एमजीपी से aortas पुष्टि करने के लिए / - चूहों, काटा गया sectioned, और एक एंटीबॉडी बृहतभक्षककोशिका मार्कर मैक-2 (के लिए विशिष्ट साथ दाग - / - चूहों का प्रदर्शन किया प्रचुर मात्रा में मैक-2 धुंधला; / - - चूहों संवहनी मैक्रोफेज की अनुपस्थिति का संकेत है, एमजीपी के aortas में नहीं detectable मैक-2 धुंधला नहीं था।

    उच्च फॉस्फेट मीडिया वाले, प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित का उपयोग करने में चूहों और सुसंस्कृत - / - इन विट्रो में संवहनी कड़ा हो जाना मॉडल के लिए, महाधमनी VSMCs प्रकार के जंगली और एमजीपी से अलग थे। / - - चूहों सुसंस्कृत VSMCs का कड़ा हो जाना नियमन में एमजीपी की भूमिका का निर्धारण करने के लिए, एक adenovirus एमजीपी व्यक्त (Ad.MGP) से एमजीपी महाधमनी VSMCs में एमजीपी बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक adenovirus हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Ad.GFP) व्यक्त से संक्रमित एमजीपी की कमी VSMCs नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, बाद में कड़ा हो जाना पर VSMCs से एमजीपी अभिव्यक्ति हटाने के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, जंगली प्रकार चूहों से महाधमनी VSMCs एमजीपी (siMGP) के खिलाफ निर्देशित siRNA साथ इलाज किया गया या siRNA नियंत्रण (SISC)। कड़ा हो जाना 7 दिनों के लिए कड़ा हो जाना मीडिया में कोशिकाओं बढ़ रही द्वारा सुसंस्कृत VSMCs में प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं बाद में तय की और वॉन Kossa विधि का उपयोग कैल्शियम के लिए दाग रहे थे। / - - Ad.MGP साथ एमजीपी की बहाली एमजीपी का कड़ा हो जाना कम हो VSMCs एडीनोवायरस इलाज कोशिकाओं (- बी, चित्रा 5 ए) को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में। SiMGP साथ जंगली प्रकार महाधमनी VSMCs,> एमजीपी अभिव्यक्ति के 95% पछाड़ना में जिसके परिणामस्वरूप का उपचार, 25 SISC इलाज कोशिकाओं (- डी, एफ चित्रा 5C) की तुलना में कड़ा हो जाना बढ़ गया। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि VSMC कड़ा हो जाना mimics के इस मॉडल में इन विट्रो एमजीपी की कमी चूहों में निष्कर्ष और यह दर्शाता है कि एमजीपी सुसंस्कृत VSMCs का कड़ा हो जाना modulates।

    सुसंस्कृत VSMCs का कड़ा हो जाना का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि कैल्शियम NIR के साथ है। वी में संवहनी कड़ा हो जाना करने के लिए मॉडल itro, मानव कोरोनरी धमनी VSMCs खरीदा और कड़ा हो जाना मीडिया बी में 21 दिनों के उपचार अवधि के बाद के लिए सुसंस्कृत थे, कड़ा हो जाना कैल्शियम NIR विधि का उपयोग पहचान की थी और संस्कृतियों एक कस्टम हरी फ्लोरोसेंट कोलेजन जांच 51 और Hoechst डाई (1 साथ counterstained माइक्रोग्राम / एमएल 10% formalin में निर्धारण के बाद 5 मिनट) (चित्रा 6) के लिए। VSMC नाभिक confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6A) द्वारा ब्लू Hoechst प्रतिदीप्ति के साथ मनाया गया। एक प्रतिनिधि ऑप्टिकल अनुभाग कोलेजन मैट्रिक्स VSMCs (चित्रा 6B) द्वारा उत्पादित भीतर कैल्शियम NIR से सना हुआ चूनेवाला खनिज पता चलता है। ऑप्टिकल जेड के ढेर के तीन आयामी पुनर्निर्माण की अच्छी तरह से एक कोलेजन मैट्रिक्स, जिसमें जमा चूनेवाला खनिज फँस हो जाता है (- डी चित्रा 6C) का उत्पादन तल पर VSMCs के रूप में संस्कृति में बनाया परतों को दर्शाते हैं।

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    चित्रा 1:। एक जंगली प्रकार माउस से एक महाधमनी के प्रतिनिधि विच्छेदन (ए) के वक्ष और उदर महाधमनी आम श्रोणिफलक धमनी बंटवारे को विस्तार देने की एक तस्वीर overlying अंगों और पेरी महाधमनी वसा को हटाने के बाद दिखाया गया है। (बी) ए, प्रगंडशीर्षी के साथ ध्यान केंद्रित महाधमनी चाप के मद्देनजर आम मन्या, और बाईं subclavian धमनियों छोड़ दिया है। स्केल सलाखों = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: संवहनी कड़ा हो जाना एमजीपी में - / - चूहों बीएमपी संकेतन पर निर्भर है एमजीपी - / - चूहों intraperitoneal साथ इलाज किया गया (आईपी) के इंजेक्शन या तो ve। hicle, LDN-193189 (LDN, 2.5 मिलीग्राम / किग्रा / दिन), या ALK3-एफसी (2 मिलीग्राम / किग्रा हर दूसरे दिन) और जंगली प्रकार चूहों 28 दिन तक जीवन के दिन 1 पर शुरुआत वाहन के आईपी इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया । 27 दिन, चूहों पूंछ नस के माध्यम से कैल्शियम NIR के साथ इंजेक्शन थे। Aortas 28 दिन पर काटा और लगभग अवरक्त रोशनी के साथ imaged थे। छवियाँ पैमाने पर पट्टी 3 मिमी संकेत के साथ सभी चार पैनलों में एक ही बढ़ाई हैं। जंगली प्रकार माउस aortas कैल्शियम NIR संकेत प्रदर्शन नहीं किया था, जबकि एमजीपी से aortas - / - चूहों एक मजबूत कैल्शियम NIR संकेत था। / - - वाहन का इलाज एमजीपी की तुलना में चूहों, एमजीपी के aortas - / - या तो LDN या ALK3-एफसी के साथ इलाज चूहों काफी कैल्शियम NIR संकेतों को कम कर प्रदर्शन किया। यह आंकड़ा संदर्भ 25 से लिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    चित्रा 3: एमजीपी की कमी चूहों में बीएमपी संकेतन रोकता महाधमनी कड़ा हो जाना Pharmacologic निषेध जंगली प्रकार चूहों वाहन (ए) और के आईपी इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया एमजीपी - / - चूहों वाहन (बी), LDN के दोनों आईपी इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया। (सी, 2.5 मिलीग्राम / किग्रा / दिन), या ALK3-एफसी (डी, 2 मिलीग्राम / किग्रा हर दूसरे दिन) 28. दिन Aortas, काटा गया sectioned, और Alizarin लाल के साथ कैल्शियम के लिए दाग जब तक जीवन के दिन 1 में शुरुआत। छवियों पैमाने बार 400 माइक्रोन का संकेत के साथ सभी चार पैनलों में एक ही बढ़ाई पर ले जाया गया। / - - चूहों चित्रा 2 में कैल्शियम NIR संकेतों के लिए इसी प्रकार, Alizarin लाल धुंधला वाहन का इलाज एमजीपी के aortas में कड़ा हो जाना का एक भारी बोझ को दर्शाता है। एफसी इलाज ALK3 एमजीपी कड़ा हो जाना LDN- और aortas में कमी आई है - / - चूहों। यह आंकड़ा से लिया जाता हैसंदर्भित 25। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    । चित्रा 4: महाधमनी कड़ा हो जाना और कैल्शियम NIR और cathepsin NIR साथ Macrophage घुसपैठ का एक साथ निर्धारण (ए) जंगली प्रकार, एमजीपी - / -, और LDLR - / - चूहों एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया कैल्शियम NIR और cathepsin NIR के साथ इंजेक्शन थे पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से। Aortas 24 घंटा बाद में काटा और लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ मूल्यांकन किया गया। छवियाँ पैमाने पर पट्टी 3 मिमी संकेत के साथ ही बढ़ाई हैं। जंगली प्रकार चूहों वास्तव में कोई महाधमनी कड़ा हो जाना या बृहतभक्षककोशिका उपस्थिति दिखा रहे हैं। LDLR से aortas - / - चूहों व्यापक कड़ा हो जाना है कि सह-localizes बृहतभक्षककोशिका संचय के साथ की है। इसके विपरीत, एमजीपी - / - चूहों महाधमनी कड़ा हो जाना कि बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के अभाव में होता है। (बी) Aortas जंगली प्रकार से काटा गया, एमजीपी - / -, और LDLR - / - चूहों एक उच्च वसा वाले आहार खिलाया। ये aortas sectioned और मैक-2 के लिए एक एंटीबॉडी विशिष्ट साथ मैक्रोफेज के लिए दाग रहे थे। केन्द्रक डीऐपीआई के धब्बे वाले थे। lumenal सतह प्रत्येक पैनल में सही दिशा में है। छवियों पैमाने बार 100 माइक्रोन का संकेत के साथ सभी तीन पैनलों में एक ही बढ़ाई पर ले जाया गया। / - - चूहों में (ए) के निष्कर्षों के लिए इसी प्रकार, वहाँ एमजीपी के aortas में बृहतभक्षककोशिका संचय के कोई सबूत नहीं था। यह आंकड़ा संदर्भ 25 से एक आंकड़ा का एक संशोधित संस्करण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    । चित्रा 5: - / - एमजीपी कड़ा हो जाना से संवर्धित VSMCs की सुरक्षा संवर्धित महाधमनी VSMCs से एमजीपी अलग थे चूहों और एडीनोवायरस व्यक्त या तो GFP (ए) या ​​एमजीपी (बी) से संक्रमित। जंगली प्रकार चूहों से अलग महाधमनी VSMCs या तो तले siRNA (सी) या siRNA को निशाना एमजीपी (डी) पर नियंत्रण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। कोशिकाओं 7 दिनों के लिए कड़ा हो जाना मीडिया में बड़े हो रहे थे और बाद में तय की और वॉन Kossa के साथ दाग। पैमाने बार 200 माइक्रोन का संकेत के साथ - (डी ए) छवियाँ सभी चार पैनलों में एक ही बढ़ाई पर ले जाया गया। देखने के सीरियल क्षेत्रों फोटो खिंचवाने और पृष्ठभूमि घटाव (ई और एफ) के बाद छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कैल्शियम धुंधला के लिए मात्रा निर्धारित किया गया, SEM का संकेत त्रुटि सलाखों के साथ। यह आंकड़ा संदर्भ 25 से एक आंकड़ा का एक संशोधित संस्करण है।4017fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6:। एसोसिएशन में कैल्शियम NIR पहचानता कड़ा हो जाना इन विट्रो में बाह्य मैट्रिक्स (क) मानव कोरोनरी धमनी VSMCs कड़ा हो जाना मीडिया बी में सुसंस्कृत के लिए 21 दिनों के Hoechst डाई का उपयोग परमाणु धुंधला द्वारा की पहचान की गई। (ख) एक ऑप्टिकल अनुभाग कैल्शियम NIR धुंधला (लाल) के confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट कोलेजन जांच के साथ संयुक्त कोलेजन मैट्रिक्स भर चूनेवाला खनिज पता चलता है। छवियों को एक - बी पैमाने बार 10 माइक्रोन का संकेत के साथ ही बढ़ाई पर ले जाया गया। (सी और डी) तीन आयामी पुनर्निर्माण टी के भीतर चूनेवाला खनिज की फंसाने दिखानेवह मैट्रिक्स कोलेजन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

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    धमनी कड़ा हो जाना मनुष्यों में हृदय रोग के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है और हृदय की घटनाओं के रोगजनन के लिए सीधे योगदान कर सकते हैं। Atherosclerotic रोग की पतली रेशेदार टोपी में 1,5,52 अंत: कैल्शियम बयान स्थानीय बायोमैकेनिकल तनाव बढ़ाने के लिए और करने के लिए योगदान करने के लिए प्रस्तावित किया गया है पट्टिका टूटना। 53,54 औसत दर्जे का कड़ा हो जाना प्रभावों धमनी कठोरता, जो हृदय अतिवृद्धि प्रेरित और हृदय समारोह को प्रभावित कर सकते हैं बढ़ाने के द्वारा नैदानिक ​​परिणामों। 55 इसलिए, आणविक तंत्र है कि संवहनी कड़ा हो जाना आबाद मानव रोग में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और संभवतः के लिए उपन्यास लक्ष्यों की पहचान करेगा समझने चिकित्सा।

    इधर, महाधमनी कड़ा हो जाना और atherosclerosis और नाड़ी कड़ा हो जाना NIRF इमेजिंग के उपयोग के murine मॉडल में बृहतभक्षककोशिका संचय का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। 9 यह सही NIR इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण हैपूंछ नस में एफ एजेंटों। यह एक तकनीक है कि महत्वपूर्ण अभ्यास से पहले महारत हासिल की है आवश्यकता है इसके अतिरिक्त है। 56, यह महाधमनी से पेरी महाधमनी में वसा की सभी को दूर करने के रूप में इस वसा कैल्शियम NIR और cathepsin रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य में एक autofluorescent संकेत पैदा कर सकता है महत्वपूर्ण है NIR का संकेत है। NIRF एजेंटों के उपयोग संवहनी कड़ा हो जाना और सूजन का आकलन करने का मानक histologic तरीकों पर कई महत्वपूर्ण लाभ है। पारंपरिक ऊतकीय तकनीक के विपरीत, इन एजेंटों पूरे महाधमनी कड़ा हो जाना और मैक्रोफेज घुसपैठ की मात्रा का ठहराव की अनुमति है। इसके अलावा, वे histologic धुंधला से महाधमनी कड़ा हो जाना के विकास से जुड़े जल्दी परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक और अधिक संवेदनशील तरीका प्रदान करते हैं और इसलिए इस बीमारी के पहले चरण में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। जल्दी कैल्शियम NIR संकेत के 9 साइटें हड्डी गठन के मार्कर के साथ जुड़े रहे हैं सहित वृद्धि हुई wel के रूप में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधिRunx2 और osteopontin जीन अभिव्यक्ति के रूप में एल। इसके अलावा, कड़ा हो जाना और cathepsin गतिविधि के लिए प्रेतसंबंधी अलग जांच का एक साथ उपयोग मात्रा का ठहराव और दोनों atheromatous और चूनेवाला रोग के spatiotemporal प्रगति के सहयोग से सक्षम बनाता है। 9

    रोग के अंतर्निहित pathophysiologic तंत्र की हमारी समझ में संवहनी कड़ा हो जाना और सूजन को एड्स के स्थानिक और लौकिक विशेषताओं की पहचान। उदाहरण के लिए, NIRF एजेंटों के उपयोग का प्रदर्शन किया है कि intimal कड़ा हो जाना के मॉडल में (ApoE - / - और LDLR - / - एक उच्च वसा वाले आहार पर चूहों), नाड़ी कड़ा हो जाना बृहतभक्षककोशिका संचय की साइटों के लिए सह-localizes (चित्रा 4) और कि कड़ा हो जाना, दिलचस्प बात यह अस्थायी मैक्रोफेज के संचय के बाद। 9,11 cathepsin NIR के साथ कोई बृहतभक्षककोशिका संचय एमजीपी की कमी चूहों में पाए औसत दर्जे का संवहनी कड़ा हो जाना में पाया गया था। 25 गुरुएस, NIRF एजेंटों के उपयोग के प्रयोगों से यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि हालांकि बृहतभक्षककोशिका संचय संवहनी intimal कड़ा हो जाना के साथ जुड़ा हुआ है, यह नाड़ी औसत दर्जे का कड़ा हो जाना लिए आवश्यक नहीं है।

    इमेजिंग और रोग का अध्ययन करने में अपनी भूमिका के लिए इसी प्रकार, NIRF इमेजिंग महाधमनी वाल्व रोग का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। 47 महाधमनी वाल्व रोग वाल्व पर लिपिड से लदी मैक्रोफेज और चूनेवाला घावों द्वारा चिह्नित और इसी तरह के अंतर्निहित आणविक तंत्र और atherosclerosis के रूप में आनुवंशिक निर्धारकों को दर्शाती है । 57-59 महाधमनी वाल्व कड़ा हो जाना पत्रक समारोह की हानि का कारण बनता है और बुजुर्गों में नैदानिक ​​महाधमनी प्रकार का रोग का प्रमुख कारण है। केवल उपचार वर्तमान प्रतीक महाधमनी प्रकार का रोग के लिए उपलब्ध वाल्व प्रतिस्थापन है। महाधमनी वाल्व रोग के आणविक तंत्र का एक बेहतर समझ देर चरण प्रगतिशील महाधमनी वाल्व कड़ा हो जाना के नैदानिक ​​जटिलताओं को रोकने के लिए आवश्यक है। एनआई की उपयोगितापशु मॉडल में आणविक इमेजिंग उपकरण के रूप में आरएफ एजेंटों जल्द से जल्द अपने चरणों में महाधमनी वाल्व रोग का आकलन करने के लिए एक संवेदनशील तरीका प्रदान करता है। 60

    मानक तकनीक कल्पना करने के लिए कोरोनरी धमनी सजीले टुकड़े एक प्रकार का रोग की गंभीरता पर ध्यान केंद्रित किया है, अभी तक एक्यूट कोरोनरी सिंड्रोम के बहुमत गैर-प्रवाह को सीमित सजीले टुकड़े का टूटना से परिणाम। इस तरह के सूजन के रूप में सजीले टुकड़े के भीतर 6 जैविक प्रक्रियाओं, पट्टिका टूटना के बेहतर भविष्यवक्ताओं के रूप में सेवा इमेजिंग तकनीक पारंपरिक करने के लिए विरोध के रूप में एक प्रकार का रोग। 61 डिग्री की तुलना में, NIRF इमेजिंग सेलुलर गतिविधि (यानी, एक मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) सक्रिय एजेंट, cathepsin NIR साथ प्रोटिओलिटिक और elastolytic गतिविधि के साथ बृहतभक्षककोशिका प्रोटिओलिटिक गतिविधि और osteogenic गतिविधि को मापने के लिए एक अवसर प्रदान करता है कैल्शियम NIR के साथ)। 9 इस विधि इसलिए हृदय रोग का एक साथ कार्यात्मक और संरचनात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है। NIRF इमेजिंग ई का इस्तेमाल650 से 900 एनएम रेंज है, जो वृद्धि हुई ऊतक प्रवेश का लाभ दिया है एक कम तरंग दैर्ध्य में प्रकाश की तुलना में xcitation तरंग दैर्ध्य, इस प्रकार की बीमारी घावों की अधिक से अधिक गहराई आकलन के लिए अनुमति देता है। 60 वहाँ भी पास में संवहनी ऊतक के autofluorescent पृष्ठभूमि संकेत कम हो जाता है -infrared तरंगदैर्ध्य रेंज। हालांकि इस प्रोटोकॉल NIRF इमेजिंग पूर्व vivo के उपयोग पर केंद्रित है, NIRF इमेजिंग भी विवो में अनुदैर्ध्य आणविक इमेजिंग के लिए एक उपयोगी मंच एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। 9 NIRF इमेजिंग, जब intravital माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, मनुष्यों में भविष्य नैदानिक ​​आवेदन कर सकते हैं। 61 हालांकि, कैल्शियम NIR इमेजिंग के longitudinally कि बिसफ़ॉस्फ़ोनेट व्युत्पन्न जांच में ही कड़ा हो जाना की शारीरिक प्रक्रिया को बदल सकता है। 62

    हृदय कड़ा हो जाना एक सक्रिय रूप से विनियमित प्रक्रिया है कि एक osteogenic phenotype के लिए VSMCs की transdifferentiation शामिल है। 25,41,42 63 प्रकाशित समान है और murine महाधमनी प्रति कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या हासिल किया है इन विट्रो अध्ययन (चित्रा 5) प्रदर्शन करने के लिए। एक वैकल्पिक मेरेVSMC अलगाव के लिए Thod enzymatic पाचन बल्कि explanted महाधमनी के छल्ले के प्रत्यक्ष संस्कृति को शामिल नहीं करता; इस तकनीक 63,64 तकनीक enzymatic पाचन के उपयोग की तुलना में कम कोशिकाओं उपज के लिए सूचित किया गया है।

    दो अलग अलग कड़ा हो जाना मीडिया, या तो βGP साथ / ए एस सी / DEX 65,66 या NaPhos, 25,43 बताए गए VSMCs का कड़ा हो जाना प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मीडिया के दोनों प्रकार के बराबर सफलता के साथ murine VSMCs कड़ा हो जाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कड़ा हो जाना मीडिया से युक्त जबकि βGP / ए एस सी / DEX मानव VSMCs (चित्रा 6) कड़ा हो जाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, मीडिया NaPhos युक्त हमारे अनुभव में मानव VSMCs calcifying में प्रभावी नहीं रहा है। इसके अलावा, 21 - कड़ा हो जाना मीडिया बी में मानव VSMCs की संस्कृति का 28 दिनों से पहले कड़ा हो जाना का पता चला है की आवश्यकता हो सकती है। जब एमजीपी की अभिव्यक्ति के स्तर siRNA और calcificati के साथ कम हो गई थी इन विट्रो में जंगली प्रकार VSMCs की हड्डी बन जाना बढ़ गया थापर एमजीपी में कम हो गया था - / - VSMCs जब एमजीपी अभिव्यक्ति बहाल किया गया (चित्रा 5)। / - - इन निष्कर्षों में एमजीपी मनाया महाधमनी कड़ा हो जाना के साथ संगत कर रहे हैं चूहों और सुझाव है कि VSMC कड़ा हो जाना की इस विधि में इन विट्रो में विवो कड़ा हो जाना का एक उपयोगी मॉडल के रूप में कार्य करता है। यह ध्यान रखें, हालांकि, वहाँ सुसंस्कृत VSMCs से बरकरार रक्त वाहिकाओं के बारे में निष्कर्ष ड्राइंग में सीमाएं हैं कि महत्वपूर्ण है। संवर्धित VSMCs उनके vivo सिकुड़ा गुण, विशेष रूप से उच्च मार्ग पर, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, आकृति विज्ञान, और कठोरता में परिवर्तन के विकास के अलावा में खो सकते हैं। 67-70 VSMCs मीडिया calcifying कड़ा हो जाना पहले एक osteoblastic वंश के लिए अलग है में सुसंस्कृत, लेकिन नहीं है एक chondrocytic मध्यवर्ती कि अक्सर इन विवो में मनाया जाता है दिखा रहे हैं। 71 इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि यंत्रवत संवर्धित कोशिकाओं से तैयार निष्कर्ष में विवो प्रणालियों में मान्य किया जा रहा है। परइस सीमा पर काबू पाने के ई संभावित विधि एक सुसंस्कृत बरकरार पोत अंगूठी का उपयोग कर अपने इन विवो राज्य में VSMCs अध्ययन करने के लिए है। 70

    दो अलग अलग तरीकों सुसंस्कृत VSMCs का कड़ा हो जाना का पता लगाने, वॉन Kossa विधि (चित्रा 5) और कैल्शियम NIR धुंधला (चित्रा 6) के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। हालांकि अक्सर इस्तेमाल किया कड़ा हो जाना के लिए आकलन करने के लिए, वॉन Kossa विधि को कुछ हद तक कैल्शियम क्रिस्टल के लिए अपनी कम विशिष्टता द्वारा सीमित है। 50 कैल्शियम NIR महसूस किया है कड़ा हो जाना के लिए विशिष्ट हो सकता है और विशेष रूप से लाभप्रद है कि यह अतिरिक्त प्रेतसंबंधी-अलग फ्लोरोसेंट के साथ एक साथ धुंधला के लिए अनुमति देता है एजेंटों। इस प्रोटोकॉल अतिरिक्त आणविक जांच के साथ कैल्शियम NIR उपयोग कड़ा हो जाना के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है के 9 भविष्य अनुप्रयोगों और एक उच्च throughput ढंग से VSMC कड़ा हो जाना के छोटे अणु अवरोधकों का तेजी से मूल्यांकन सक्षम हो सकता है, आईडीई के लिएसंवहनी कड़ा हो जाना लिए ntify संभावित उपन्यास उपचारों।

    सारांश में, हृदय रोग कड़ा हो जाना नैदानिक ​​करने के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक और संभावित योगदान है। हृदय कड़ा हो जाना और atherosclerotic रोग के तंत्र का ज्ञान दोनों जानवर और सेल आधारित मॉडल पर निर्भर करता है। इन विवो, पूर्व vivo, और इन विट्रो में मॉडलों में कड़ा हो जाना का आकलन करने के लिए तरीके हृदय रोग के बारे में हमारी समझ को अग्रिम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

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    References

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    संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और महाधमनी कड़ा हो जाना और सूजन की इमेजिंग की हड्डी बन जाना
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