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Medicine

Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo, compresi gli Stati Uniti dove rappresenta oltre 780.000 morti ogni anno. 1 coronarica calcificazione delle arterie e calcificazione aortica sono le caratteristiche della malattia aterosclerotica e fungono da forti predittori di eventi cardiovascolari. 2- 4 Due tipi principali di calcificazione vascolare sono stati riportati in adulti: calcificazione intimale, associata con l'aterosclerosi, e mediale (noto anche come Mönckeberg) calcificazione, associata a malattia renale cronica e diabete 5 intimale la calcificazione si verifica nel contesto di accumulo di lipidi e macrofagi. infiltrazione nella parete del vaso. 5,6 mediale calcificazione parete si verifica indipendentemente intimale calcificazioni, localizza alle fibre di elastina o cellule muscolari lisce, e non è associato con la deposizione di lipidi o infiltrazione dei macrofagi. 5,7,8 studi sui meccanismi molecolari dicalcificazione vascolare hanno fatto affidamento su sistemi modello basati su celle e animali. Modelli di roditori per la malattia atherocalcific includono topi deficienti in entrambi apolipoproteina E (ApoE) 9,10 o recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LDLR) 11 alimentati con una dieta ricca di grassi, mentre i modelli per la calcificazione mediale includono topi con deficit di matrice proteica Gla (MGP) 12 o ratti che si sviluppano uremia o da nefrectomia quasi totale (il modello nefrectomia 5/6 °) o dall'esposizione ad una dieta ricca di adenina. 13

Qui, il modello di calcificazione vascolare mediale associata a carenza di MGP è focalizzata su. MGP è una proteina extracellulare che inibisce la calcificazione delle arterie. 12 mutazioni nel gene MGP sono state identificate nella sindrome Keutel, una malattia umana rara, caratterizzata da diffuse calcificazioni cartilagine oltre a brachitelefalangia, perdita di udito, e la stenosi polmonare periferica. 14-18 Anche se non spesso osservato, 19calcificazioni concentrica di più arterie è stata descritta nella sindrome Keutel. 20 polimorfismi comuni nel gene MGP umana sono associate ad un aumentato rischio di calcificazione delle arterie coronariche, 21-23 mentre alti livelli circolanti di uncarboxylated, MGP biologicamente inattivo predicono la mortalità cardiovascolare. 24 A differenza di esseri umani con la sindrome Keutel, topi MGP-deficienti sviluppano un fenotipo vascolare grave composto da spontanea diffusa la calcificazione delle arterie a partire da due settimane di età e morire 6-8 settimane dopo la nascita a causa di rottura aortica. 12

A differenza di ApoE - / - e LDLR - / - mice nutriti con una dieta ricca di grassi, che si sviluppano calcificazione vascolare intimale con l'infiammazione dei macrofagi indotta associata, MGP - / -. Topi sviluppano calcificazione vascolare mediale in assenza di infiltrazione di macrofagi 11,25 Sebbene questi risultati suggeriscono stimoli diversi sottostanti incontri intimiAl e calcificazione mediale, non vi è sovrapposizione nei meccanismi di segnalazione che mediano entrambe le forme di calcificazione. 26 Molteplici vie di segnalazione sono stati identificati che contribuiscono alla calcificazione vascolare compreso mediatori infiammatori come fattore di necrosi tumorale-α e IL-1 e fattori pro-osteogeniche come Notch, Wnt, e la proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione. 27,28 Questi percorsi di segnalazione aumentare l'espressione dei fattori di trascrizione runt legati fattore di trascrizione 2 (Runx2) e Osterix, che a loro volta aumentano l'espressione di proteine ​​ossee correlate ( . ad esempio, osteocalcina, sclerostina, e fosfatasi alcalina) nel sistema vascolare che mediano la calcificazione 28-30 Noi e altri hanno dimostrato che la calcificazione vascolare osservata in ApoE - / - e LDLR - / - topi nutriti con una dieta ricca di grassi e la spontanea calcificazione vascolare osservato in MGP - / - mice tutti dipendono dalla proteina morfogenetica dell'osso (BMP) SIgnaling, ed è questo percorso che si concentra qui. 11,25,31 BMP sono potenti fattori osteogeniche necessari per la formazione delle ossa e sono noti per esporre una maggiore espressione nell'aterosclerosi umana. 32-34 Studi in vitro hanno implicato segnalazione BMP nella regolazione l'espressione di fattori osteogenici come Runx2. 35-37 sovraespressione del ligando BMP, BMP-2, accelera lo sviluppo di calcificazione vascolare in topi ApoE-carente alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. 38 Inoltre, l'uso di specifici BMP segnalazione inibitori tali come LDN-193.189 (LDN) 39,40 e / o ALK3-Fc impedisce lo sviluppo di calcificazione vascolare in entrambi LDLR - / - mice nutriti con una dieta ricca di grassi e topi MGP-deficienti 11,25.

Cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) hanno un ruolo fondamentale nello sviluppo della calcificazione vascolare. 30,41,42 La calcificazione vascolare mediale che si sviluppa in MGP-carente topo è caratterizzati da una transdifferenziazione di VSMC a un fenotipo osteogenico. Perdita di MGP risultati in diminuita espressione di marcatori VSMC tra cui myocardin e alfa actina muscolo liscio, con un concomitante aumento marcatori osteogeniche quali Runx2 e osteopontina. Questi cambiamenti coincidono con lo sviluppo di calcificazione vascolare. 25,43,44

Calcificazione aortica e l'infiammazione nei topi sono in genere valutate utilizzando tecniche istochimiche come l'attività della fosfatasi alcalina per la calcificazione precoce e l'attività osteogenica, von Kossa e alizarina colorazione rossa per la fine di calcificazione, e protocolli di immunoistochimica che colpiscono marcatori proteici macrofagi (ad es., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Tuttavia, queste tecniche di imaging standard richiede la lavorazione di tessuti aortici in sezioni trasversali, che è lunga e imperfetta tempo a causa di errori di campionamento, e sono limitati nella loro capacità di quantificare l'infiammazione e calcificatione in tutta dell'aorta. Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare e quantificare tutta la calcificazione delle arterie aortica e medie imprese e l'accumulo di macrofagi utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR) imaging molecolare ex vivo. È inoltre disponibile un metodo per la raccolta e la coltura VSMC aortici primari da topi e indurre il calcificazione dei murina e VSMC umani in vitro al fine di determinare i meccanismi molecolari alla base calcificazione vascolare. Queste tecniche prevedono l'investigatore sia in vivo e metodi in vitro per lo studio della malattia atherocalcific.

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Protocol

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Tutti gli studi con i topi sono stati eseguiti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Corpo e tutte le procedure che coinvolgono i topi descritti in questo studio sono stati approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Uso comitati del Massachusetts General Hospital (sottocomitato per Animal Care Research). Tutte le procedure sono state eseguite con cura per ridurre al minimo le sofferenze.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Near-Infrared imaging di fluorescenza di Whole aorte
    Nota:. Un bisfosfonato-derivato, nel vicino infrarosso sonda di imaging fluorescente può essere usato per marcare l'attività osteogenica nel sistema vascolare legandosi a idrossiapatite 46,47 Una sonda di imaging a fluorescenza catepsina-attivo può servire come marker per proteolitica macrofagi e l'attività elastolytic in la vascolarizzazione. 9 Per consentire l'uso simultaneo di entrambe le sonde fluorescenti, è importanteper usare le sonde che sono spettralmente distinti. Il calcio notazione NIR sarà usato per indicare la sonda di imaging fluorescenti e catepsina vicino infrarosso NIR specifico calcificazione per indicare la sonda catepsina specifico all'attività vicino infrarosso di imaging fluorescente.
    1. Preparare le soluzioni di calcio NIR e catepsina NIR. Come per i protocolli del produttore, aggiungere 1,2 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) al flaconcino contenente 24 nmol di calcio NIR o catepsina NIR e agitare delicatamente.
      Nota: Secondo il produttore, una volta ricostituito con PBS, le soluzioni NIR calcio e catepsina NIR rimangono stabili per 14 giorni se conservato al buio a 2-8 ° C.
  2. L'isolamento e la calcificazione di Murine aortica VSMCs
    1. Aortica Digestione Soluzione:
      1. Preparare una soluzione fresca (~ 3-5 ml per dell'aorta raccolte) con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente 175 U / ml di tipo 2 collagenasi e 1,25 U / ml elastasi. Sterilizzare la soluzione with un sistema di filtrazione 0,22 micron sottovuoto guidato e mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    2. Cellulare di media:
      1. Supplement 500 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero fetale bovino, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.
    3. Calcificazione media:
      1. La calcificazione media A (NaPhos, utilizzato in linee cellulari di topo):
        1. Supplemento 100-500 ml di DMEM (volume come necessario) con 10% siero fetale bovino, 2 mM sodio fosfato, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.

          O
      2. La calcificazione media B (βGP / Asc / DEX; utilizzato in entrambi i mouse o linee cellulari umane):
        1. Supplemento 100-500 ml di DMEM (volume come necessario) con il 10% di siero fetale bovino, sodio 10 mM β-glicerofosfato, / ml di acido L-ascorbico 50 mg, 10nM desametasone, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.

2. Tail Vein Injection

  1. Prima dell'iniezione coda, riscaldare i topi sotto una lampada blando riscaldamento per 5 min.
  2. Trattenere il mouse in un supporto tubo roditore. Disinfettare la coda con un tampone imbevuto di alcool.
  3. Utilizzare un ago da 30 G per l'iniezione coda vena. vene coda si trovano lateralmente.
    1. Applicare una leggera pressione in avanti sulla siringa come l'ago viene fatto avanzare nella coda. La vena, si accede dopo la resistenza all'iniezione non è più presente.
    2. Iniettare un volume di 100 ml di calcio NIR e / o 100 ml di catepsina NIR ad un tasso costante. Al termine dell'iniezione, dopo una pausa 5 sec, estrarre l'ago.
  4. Raccogliere le aorte (vedi sezione 3) 3-24 ore dopo l'iniezione.

3. mouse Dissection

  • Euthanize mouse con 200 mg / kg iniezione intraperitoneale pentobarbital.
  • Posare il supina animale sulla tavola di dissezione e stabilizzare con nastro adesivo ogni zampa alla scheda. Utilizzando un microscopio da dissezione e piccole forbici, fare una incisione mediana estende dal basso addome al torace superiore.
  • Staccare la pelle con una pinza e rimuovere il peritoneo, rivelando gli organi addominali. Rimuovere gli organi gastrointestinali, facendo attenzione a non transetto l'aorta.
  • Effettuare una incisione laterale nel diaframma anteriore e continuare l'incisione attraverso l'addome. Utilizzando forbici dissezione, rilasciare la gabbia toracica tagliando attraverso i lati delle costole e rimuovendo l'aderente tessuti molli alla porzione superiore dello sterno. Rimuovere la gabbia toracica, rivelando i polmoni.
  • Lasciare il cuore a posto inizialmente (per gli aiuti a identificare e sezionare l'aorta prossimale) e rimuovere con attenzione i polmoni. Rimuovere il timo, la trachea, l'esofago e con cura, ensuring che l'aorta rimane intatto.
  • Utilizzando una pinza dritto sottili e forbici micro-dissezione, rimuovere il tessuto molle che circonda l'aorta dalla biforcazione iliaca per l'arco aortico, facendo attenzione quando si rimuove il grasso (Figura 1A) peri-aortica. Rimuovere il tessuto grasso e morbido rimanente che circonda i grandi rami dell'arco aortico (cioè le arterie, brachiocefalici, carotidi comuni e succlavia, Figura 1B).
    Nota: È importante rimuovere il grasso dall'aorta perché il grasso può aumentare il segnale di fondo durante l'esecuzione di imaging di fluorescenza.
  • Rimuovere il cuore dalla cavità toracica, con attenzione staccandola dall'aorta prossimale, e scartare. Transetto l'aorta distale alla biforcazione iliaca. Utilizzando un ago da insulina, iniettare soluzione fisiologica nell'aorta dall'arco aortico per lavare globuli rimanenti. Staccare l'aorta con i vasi dell'arco aortico, rimuovendo completamentedal corpo.
  • Inserire l'aorta in soluzione fisiologica in ghiaccio fino per l'imaging.
  • 4. aortica Imaging

    1. Aorte Immagine ex vivo subito dopo la raccolta da imaging di fluorescenza di riflettanza nel vicino infrarosso. 25
      1. Impostare l'imager fluorescenza a lunghezze d'onda multicanale appropriate per quantificare l'intensità del segnale di fluorescenza dalle aorte di calcio NIR e topi catepsina NIR-iniettato, come descritto in precedenza. 25 Secondo il produttore, NIR calcio può essere eccitato da ~ 650-678 nm luce con una emissione massima nella ~ 680-700 nm gamma. Cathepsin NIR può essere eccitato da ~ 745-750 nm luce con una emissione di massimo a ~ 770 nm.

    5. L'isolamento di primaria murini aortica vascolari cellule muscolari lisce

    1. Eseguire i passaggi 3,1-3,7 come descritto sopra.
    2. Mettere aorte in HBSS freddo fino a quando le dissezioni sono completi. Attentamente tagliare qualsiasi remaining grasso periaortica e dei tessuti molli, lasciando solo l'aorta.
    3. Sotto una cappa di coltura di tessuti sterili, trasferire i aortas alla digestione Solution aortica in x 10 mm piatti di coltura di tessuti da 35 mm. Inserire in termostato a 37 ° C per 30 minuti con dolce dondolio intermittente. Dopo la digestione, le aorte presentano un aspetto allungato o sfilacciato.
    4. Con il microscopio dissezione e pinza sterile, rimuovere lo strato esterno avventiziale dell'aorta, mantenendo intatto lo strato mediale. Una tecnica per rimuovere il avventizia è a staccarsi lo strato esterno dell'aorta ad una estremità e rimuoverlo dallo strato sottostante mediale come un calzino potrebbe essere sfogliato indietro e rimosso.
    5. Una volta che lo strato avventiziale è stato rimosso, posizionare l'aorta rimanenti in un nuovo piatto di coltura di tessuti con mezzi di coltura cellulare e conservare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2-4 ore.
    6. Sotto una cappa sterile e l'utilizzo di 3 mm forbici micro-dissezione sterili, tagliare l'aorta in 1-2 mm di larghezzaanelli.
    7. Mettere questi anelli in un nuovo piatto di coltura tissutale con aortica digestione Solution e incubare a 37 ° C con dolce intermittente a dondolo per 120 min. Pipetta la soluzione su e giù più volte durante questa incubazione per risospendere le cellule.
    8. Aggiungere 5 ml di media caldo coltura cellulare per la soluzione di digestione e trasferimento in un tubo da 15 ml.
    9. Centrifugare la provetta per 5 min a 200 x g.
    10. Aspirare media e risospendere le cellule nel volume desiderato di terreni di coltura cellulare (per esempio, 5 ml).
    11. Piatto l'intera quantità di cellule isolate da ciascuna aorta in cm 25 pallone di coltura cellulare 2 e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Propagare cellule utilizzando tecniche standard, come descritto in precedenza. 25,48 Durante i primi 7-10 giorni di incubazione, cambiare i media ogni 72-96 ore. Come le cellule si avvicinano confluenza, ricostituire i media più frequentemente (ogni 48 ore).
      Nota: Si può richiedere molte settimane per crescere un qua sufficiententity di cellule.
    12. Una volta confluenti, le cellule di passaggio con tripsina che viene riscaldato a 37 ° C.
      1. Aggiungere 0,5-1,0 ml di tripsina ad ogni pallone di coltura e incubare per 3-5 minuti; toccare delicatamente il lato del pallone ogni 30-60 sec come necessario per staccare le cellule dalla superficie.
      2. Una volta che le cellule si staccano dal fondo del pallone, aggiungere 10 ml di mezzi cellule alle cellule in tripsina. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Aspirare i media e tripsina dal pellet cellulare. Risospendere le cellule in quantità desiderata di supporto cellulare fresca (ad esempio, 5-10 ml) e trasferire in un pallone (con alcune cellule trasferiti a una diapositiva camera).
    13. Al primo passaggio di cellule, confermano lineage cellule muscolari lisce con tecniche immunocitochimica standard come descritto in precedenza, 49 usando un anticorpo diretto contro α-actina del muscolo liscio.

    6. Induzione calcificazione di Cultured muscolo lisciocellule

    1. cellule piastra ottenuti da 5.12 in un formato da 6 pozzetti. Nota: A partire da 1 x 10 5 cellule / pozzetto in un volume totale di 2,0 ml di supporti per cellule si raccomanda bene.
    2. Consentono alle cellule di crescere in media calcificazione A o B per almeno 7 giorni in un formato 6-pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2.
    3. Cambiare supporti cellulari ogni 48 ore.

    7. Valutare VSMC calcificazione Utilizzando la von Kossa metodo di colorazione

    Nota:. Il metodo di von Kossa per misurare matrice extracellulare calcificazione dei tessuti o cellule coltivate si basa sulla sostituzione di ioni calcio fosfato-bound con ioni d'argento 50 In presenza di composti leggeri e organici, gli ioni d'argento sono ridotti e visualizzati come metallico argento. Qualsiasi argento non reagito viene rimosso per trattamento con sodio tiosolfato 50 Il protocollo per von Kossa colorazione è come segue.:

    1. supporti Aspirare da cu cellularePiastre lture.
    2. Fissare cellule mettendoli in 1 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 min.
    3. Rimuovere formalina e lavare le cellule fissate con acqua distillata per 5 min.
    4. Incubare le cellule in 1 ml di soluzione di nitrato d'argento 5% sotto una lampadina 60-100 W per 1-2 ore.
    5. Aspirare la soluzione di nitrato d'argento e lavare con acqua distillata per 5 min.
    6. Rimuovere argento non reagito ponendo le cellule in 1 ml di tiosolfato di sodio 5% (w / v) in acqua distillata per 5 min.
    7. Risciacquare le cellule con acqua distillata per 5 min. lavaggi Ripetere 3x. La macchia von Kossa è pronto per l'imaging con lo standard microscopio ottico invertito.
    8. Passaggio opzionale: Controcolorare con 1 ml di rosso veloce nucleare per 5 min. Seguire questo con tre lavaggi con acqua distillata (5 minuti ciascuno).

    O

    8. Valutare VSMC calcificazione con Imaging fluorescente vicino infrarosso

    Nota: Simile alla sua capacitàindividuare calcificazioni all'interno aorte del mouse, il calcio NIR si lega facilmente calcifica minerale depositato da cellule in coltura. Utilizzando questa tecnica, microscopia a fluorescenza e lettori di piastre con filtri lunghezza d'onda può immagine e quantificare la calcificazione in vitro, rispettivamente. La lunga lunghezza d'onda di emissione calcio NIR consente l'utilizzo simultaneo di più bassa lunghezza d'onda fluorofori che emettono per rilevare altre caratteristiche. Il protocollo per il calcio NIR colorazione è la seguente:

    1. Come descritto nella Sezione 1.1.1, aggiungere 1,2 ml di PBS 1x per il flacone contenente 24 nmol di calcio NIR.
    2. Diluire il calcio NIR magazzino 1: 100 nei media di calcificazione o di controllo adeguate.
    3. supporti cellule Aspirare da piastre di coltura e sostituire con il calcio NIR contenenti terreni di coltura.
    4. Incubare le piastre di coltura con i media NIR di calcio durante la notte a 37 ° C.
    5. Aspirare il supporto dai pozzetti e lavare i pozzetti una volta con PBS.
      Nota: A questo punto,mezzo di coltura originale può essere aggiunta ai pozzetti e le cellule può essere realizzata live. In caso contrario, procedere con la seguente procedura.
    6. Fissare cellule mettendoli in 1 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 min.
    7. Rimuovere formalina e lavare le cellule fissate con acqua distillata per 5 min. lavaggi Ripetere 3x.
    8. Passaggio facoltativo:. Eseguire la colorazione di immunofluorescenza o altro controcolorazioni per le proteine ​​di interesse 8,9
    9. Immagine o rilevare la macchia NIR di calcio usando lunghezze d'onda di eccitazione di fluorescenza appropriata (ad esempio, NIR calcio può essere eccitata da 650-678 nm luce) e filtri di emissione (~ 680-700 nm).

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    Representative Results

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    Calcificazione aortica in MGP - / - e wild-type topi è stata misurata utilizzando l'imaging di NIR calcio fluorescenza. Nessun segnale NIR calcio è stato rilevato nelle aorte di topi wild-type, che indica l'assenza di calcificazione (figura 2). Un segnale NIR calcio forte è stata rilevata nelle aorte da MGP-carente topo, che è coerente con la calcificazione vascolare avanzata. Le sezioni di tessuto di aorte da wild-type e MGP - / - mice erano macchiate di rosso alizarina 25 (figura 3A - B), a conferma della vasta calcificazione vascolare osservato nei topi MGP-deficienti senza calcificazioni rilevato nei topi wild-type. Per determinare se la calcificazione vascolare associata a carenza di MGP dipende dalla segnalazione BMP, MGP - / - topi sono stati trattati con LDN, ALK3-Fc, o di un veicolo a partire dal giorno 1 della vita. Questi topi sono stati iniettati con il calcio NIR il giorno 27 eaorte sono state raccolte il giorno seguente. L'inibizione farmacologica di BMP segnalazione ridotta calcificazione aortica rilevati con il calcio NIR (Figura 2). Simile ai risultati con il calcio NIR, le aorte di LDN- e ALK3-Fc-trattati MGP - / - mice aveva ridotto Alizarina macchia rossa per il calcio rispetto ai veicoli trattati MGP - / - mice (Figura 3B - D). Questi risultati indicano che la segnalazione BMP è necessaria per la calcificazione vascolare osservata in MGP - / - mice.

    LDLR - / - topi nutriti con una dieta ricca di grassi sviluppare sia l'infiammazione dei macrofagi e calcificazione della parete arteriosa 11 simultanea coda vena iniezione di calcifica e specifici catepsina sonde NIR in MGP -. / - Topi è stata effettuata per determinare se la calcificazione vascolare del MGP -deficiency è associata ad accumulo di macrofagi 25 LDLR -. / - topi nutritiun alto topi dieta e wild-type di grasso sono stati utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente. Aorte di topi wild-type esposti praticamente nessun segnale NIR di calcio o di catepsina NIR, come anticipato (Figura 4A). Calcio NIR e catepsina NIR segnali co-localizzato che hanno favorito la regione dell'arco aortico sono stati osservati nel LDLR - / - mice, indicando una forte associazione tra l'infiltrazione di macrofagi e calcificazione vascolare in questo modello di intimale aterosclerosi. Anche se un segnale diffuso e NIR forte calcio è stato osservato nelle aorte di MGP - / - mice, il segnale catepsina NIR non era diverso da quello di topi wild-type. Questi risultati indicano che la calcificazione vascolare in carenza MGP si verifica in assenza di accumulo macrofagi. Per confermare ulteriormente questi risultati, aortas da wild-type, MGP - / - e LDLR - / - mice sono state raccolte, sezionati, e colorati con un anticorpo specifico per il marcatore macrofagi MAC-2 ( - / - mice dimostrarono abbondante MAC-2 colorazione; non vi era alcuna rilevabile MAC-2 colorazione nelle aorte di MGP - / - mice, indicando l'assenza di macrofagi vascolari.

    Per modellare calcificazione vascolare in vitro, VSMCs aortiche sono stati isolati da wild-type e MGP - / - mice e coltivate in alta-fosfato contenente i media, utilizzando il protocollo descritto sopra. Per determinare il ruolo di MGP nel modulare la calcificazione delle VSMC coltivate, un adenovirus che esprimono MGP (Ad.MGP) è stato utilizzato per ripristinare MGP in VSMC aortici da MGP - / - mice. VSMC MGP-carenti infettate con un adenovirus che esprimono la proteina fluorescente verde (Ad.GFP) sono stati utilizzati come controllo. Inoltre, per determinare l'effetto di rimuovere espressione MGP da VSMC dalla successiva calcificazione, VSMCs aortici da topi wild-type sono stati trattati con siRNA diretto contro MGP (siMGP) o siRNA (SISC). Calcificazione è stata indotta in VSMC coltivate coltivando le cellule in calcificazione media A per 7 giorni. Le cellule sono state poi fissate e colorate per il calcio con il metodo von Kossa. Restauro di MGP con Ad.MGP ridotta calcificazione dei MGP - / - VSMCs rispetto alle cellule di controllo adenovirus-trattati (Figura 5A - B, E). Trattamento di wild-type VSMCs aortici con siMGP, con conseguente> 95% atterramento di espressione MGP, 25 aumentato la calcificazione rispetto alle cellule SISC-trattati (Figura 5C - D, F). Questi risultati indicano che questo modello in vitro di VSMC imita calcificazione i risultati nei topi MGP-deficienti e dimostra che MGP modula calcificazione dei VSMCs in coltura.

    Un metodo alternativo per rilevare calcificazione dei VSMCs coltura è con il calcio NIR. Per modellare la calcificazione vascolare in v itro, VSMCs coronariche umane sono state acquistate e coltivate per 21 giorni in media calcificazione B. Dopo il periodo di trattamento, la calcificazione è stato identificato con il metodo NIR calcio e le colture sono state di contrasto con una sonda personalizzata verde fluorescente collagene 51 e colorante Hoechst (1 ug / ml per 5 min dopo fissazione in formalina 10%) (Figura 6). Nuclei VSMC sono stati osservati con blu Hoechst a fluorescenza mediante microscopia confocale (Figura 6A). Una sezione ottica rappresentante mostra minerale calcific calcio NIR macchiate all'interno della matrice di collagene prodotto dal VSMC (Figura 6B). Ricostruzioni tridimensionali di z-stack ottiche illustrano i livelli creati nella cultura come VSMC sul fondo del pozzo produrre una matrice di collagene in cui il minerale calcific depositato viene intrappolata (Figura 6C - D).

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    Figura 1:. Rappresentante dissezione di una aorta da una Wild-tipo di mouse (A) Un'immagine del toracica e dell'aorta addominale si estende fino al comune biforcazione dell'arteria iliaca è raffigurato dopo la rimozione degli organi sovrastanti e grassi peri-aortica. (B) Una vista dell'arco aortico si è concentrato con il brachiocefalica, lasciò carotide comune, e le arterie succlavia sinistra. Barre di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: Vascolare calcificazione in MGP - / - mice dipende BMP Segnalazione MGP - / - topi sono stati trattati con intraperitoneale (ip) iniezioni di entrambi ve. topi vei-, LDN-193.189 (LDN, 2,5 mg / kg / die), o ALK3-Fc (2 mg / kg ogni due giorni) e wild-type sono stati trattati con iniezioni ip di veicoli con inizio alle giorno 1 della vita fino al giorno 28 . Il giorno 27, i topi sono stati iniettati con NIR calcio via vena della coda. Aorte sono state raccolte il giorno 28 e ripreso con fluorescenza nel vicino infrarosso. Immagini sono allo stesso ingrandimento in tutte e quattro pannelli con barra di scala visibile 3 mm. Wild-type aortas topo non esporre il calcio segnale NIR mentre aortas da MGP - / - mice avevano un segnale NIR calcio forte. Rispetto ai veicoli trattati MGP - / - mice, le aorte di MGP - / - topi trattati con entrambi i LDN o ALK3-Fc esibivano significativamente ridotti segnali NIR calcio. Questa figura è tratta da riferimento 25. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Figura 3: farmacologico inibizione della BMP segnalazione Impedisce aortica calcificazione nei topi MGP-deficienti topi wild-type sono stati trattati con iniezioni ip di veicolo (A) e MGP - / - topi sono stati trattati con iniezioni ip di veicolo (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / die), o ALK3-Fc (D, 2 mg / kg a giorni alterni) con inizio alle giorno 1 della vita fino al giorno 28. aortas sono stati raccolti, sezionato, e colorate per il calcio con alizarina rosso. Le immagini sono state scattate allo stesso ingrandimento in tutte e quattro pannelli con la barra della scala che indica 400 micron. Simile ai segnali NIR calcio in figura 2, la colorazione rossa alizarina dimostra un pesante fardello di calcificazione nelle aorte del veicolo trattati MGP - / - mice. La calcificazione è diminuita nelle aorte di LDN- e ALK3-Fc-trattati MGP - / - mice. Questa figura è tratta dariferimento 25. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    . Figura 4: determinazione simultanea di aortica calcificazione e macrofagi infiltrazione con calcio NIR e catepsina NIR (A) wild-type, MGP - / - e LDLR - / - mice nutriti con una dieta ricca di grassi sono stati iniettati con il calcio NIR e catepsina NIR via coda iniezione vena. Aorte sono state raccolte 24 ore più tardi e valutati con imaging di fluorescenza nel vicino infrarosso. Immagini sono allo stesso ingrandimento con la barra di scala visibile 3 mm. topi wild-type mostrano praticamente alcuna calcificazione aortica o la presenza dei macrofagi. Le aorte da LDLR - / - mice hanno una vasta calcificazioni che co-localizza con accumulo di macrofagi. Al contrario, MGP - / - Topi hanno calcificazione aortica che si verifica in assenza di infiltrazione di macrofagi. (B) aorte sono state raccolte da wild-type, MGP - / - e LDLR - / - mice nutriti con una dieta ricca di grassi. Questi aorte sono stati sezionati e colorati per macrofagi con un anticorpo specifico per MAC-2. I nuclei sono state colorate con DAPI. La superficie luminale è verso destra in ogni pannello. Le immagini sono state scattate allo stesso ingrandimento in tutti e tre i pannelli con la barra della scala che indica 100 micron. Simile ai risultati di (A), non vi era alcuna evidenza di accumulo dei macrofagi nelle aorte di MGP - / - mice. Questa cifra è una versione modificata di una figura di riferimento 25. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    . Figura 5: MGP Protegge VSMCs coltivate da calcificazione aortica VSMC coltivate sono stati isolati da MGP - / - mice e infettati con adenovirus che esprimono sia GFP (A) o MGP (B). VSMC aortici isolati da topi wild-type sono state trasfettate sia con il controllo scrambled siRNA (C) o siRNA mira MGP (D). Le cellule sono state coltivate in calcificazione media A per 7 giorni e successivamente fissate e colorate con von Kossa. Le immagini sono state scattate allo stesso ingrandimento in tutti e quattro pannelli (A - D) con la barra della scala che indica 200 micron. Campi di serie di vista sono stati fotografati e quantificati per la colorazione di calcio utilizzando immagine software J dopo la sottrazione dello sfondo (E ed F), con barre di errore che indicano SEM. Questa figura è una versione modificata di una figura di riferimento 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6:. Il calcio NIR Identifica calcificazione in collaborazione con la matrice extracellulare in vitro (A) VSMCs arterie coronarie umane coltivate in calcificazione media B per 21 giorni sono stati identificati dalla colorazione nucleare utilizzando colorante Hoechst. (B) una sezione ottica ottenuto mediante microscopia confocale NIR calcio colorazione (rosso) in combinazione con una sonda collagene verde fluorescente mostra minerale calcific tutta la matrice di collagene. Immagini A - B sono state prese allo stesso ingrandimento con la barra di scala che indica 10 micron. (C e D) ricostruzioni tridimensionali mostrano l'intrappolamento di minerale calcifica entro tegli matrice di collagene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

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    Calcificazione arteriosa è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari negli esseri umani e può contribuire direttamente alla patogenesi di eventi cardiovascolari. 1,5,52 deposizione di calcio intimale nei sottili tappi fibrose di malattia aterosclerotica è stato proposto di aumentare lo stress biomeccanico locale e contribuire alla rottura della placca. 53,54 calcificazione impatti mediale risultati clinici, aumentando la rigidità arteriosa, che può indurre l'ipertrofia cardiaca e influenzare la funzione cardiaca. 55 Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari che sono alla base calcificazione vascolare fornirà importanti intuizioni malattia umana e potenzialmente identificare nuovi obiettivi per terapia.

    Qui, un metodo per rilevare la calcificazione aortica e l'accumulo di macrofagi in modelli murini di aterosclerosi e calcificazione vascolare utilizzando l'imaging NIRF è descritto. 9 È fondamentale per iniettare precisione il NIRagenti F nella vena della coda. Questa è una tecnica che richiede pratica significativa prima di raggiungere la padronanza. 56 Inoltre, è importante rimuovere tutto il grasso peri-aortica dall'aorta, come questo grasso può causare un segnale autofluorescenti alla stessa lunghezza d'onda del calcio NIR e catepsina segnali NIR. L'uso di agenti NIRF ha molti importanti vantaggi rispetto ai metodi istologici standard di valutazione calcificazione vascolare e infiammazione. Contrariamente alle tecniche istologiche convenzionali, questi agenti consentono la quantificazione di tutta la calcificazione aortica e l'infiltrazione di macrofagi. Inoltre, essi forniscono un metodo più sensibile per rilevare i primi cambiamenti associati con lo sviluppo della calcificazione aortica di colorazione istologica e può quindi offrire spunti meccanicistici in precedenti fasi della malattia. 9 Siti del primo segnale NIR calcio sono associati a marcatori di formazione ossea, compresa una maggiore attività di fosfatasi alcalina come well come espressione Runx2 e osteopontina gene. Inoltre, l'uso simultaneo di sonde spettralmente distinti per la calcificazione e l'attività della catepsina consente la quantificazione e l'associazione della progressione spazio-temporale sia della malattia ateromasica e calcifica. 9

    Identificare le caratteristiche spaziali e temporali di calcificazione e l'infiammazione vascolare aiuti nella nostra comprensione dei meccanismi fisiopatologici alla base di malattie vascolari. Per esempio, l'uso di agenti NIRF ha dimostrato che in modelli di intimale calcificazione (ApoE - / - e LDLR - / - topi su una dieta ad alta percentuale di grassi), calcificazioni co-localizzato a siti di accumulo di macrofagi vascolare (Figura 4) e che la calcificazione segue l'accumulo di macrofagi temporalmente. 9,11 interessante, nessun accumulo di macrofagi con catepsina NIR è stato rilevato nella calcificazione vascolare mediale trovato nei topi MGP-deficienti. 25 gios, da esperimenti che utilizzano agenti NIRF, si può concludere che, anche se l'accumulo di macrofagi si associa vascolare calcificazione intimale, che non è necessario per la calcificazione vascolare mediale.

    Simile al suo ruolo nella formazione immagine e studiare la malattia vascolare, imaging NIRF è stato utilizzato per studiare la malattia della valvola aortica. 47 malattia della valvola aortica è caratterizzata da macrofagi e calcifiche lesioni carichi di lipidi sulla valvola e presenta meccanismi molecolari alla base simili e determinanti genetici come l'aterosclerosi . 57-59 aortica calcificazione della valvola provoca compromissione della funzione volantino ed è la causa primaria della clinica stenosi aortica nei pazienti anziani. L'unico trattamento attualmente disponibile per stenosi aortica sintomatica è la sostituzione della valvola. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari della malattia della valvola aortica è necessario per evitare la fase tardo-complicanze cliniche di progressiva calcificazione della valvola aortica. L'utilizzo di NIAgenti RF come strumenti di imaging molecolare in modelli animali fornisce un metodo sensibile per valutare la malattia della valvola aortica in sue prime fasi. 60

    Tecniche standard di visualizzare le placche coronariche si sono concentrati sulla gravità della stenosi, ma la maggior parte delle sindromi coronariche acute derivare dalla rottura di placche non-flow-limitante. 6 I processi biologici all'interno di placche, come ad esempio l'infiammazione, servire come migliori predittori di rottura della placca che il grado di stenosi. 61 al contrario di tecniche di imaging convenzionali, l'imaging NIRF offre la possibilità di misurare l'attività cellulare (ad esempio, attività proteolitica macrofagi con un metalloproteinasi della matrice (MMP) agente attivabili, attività proteolitica e elastolytic con catepsina NIR, e l'attività osteogenica con NIR calcio). 9 Questo metodo fornisce quindi valutazione funzionale e anatomica simultanea di malattie cardiovascolari. l'imaging NIRF utilizza elunghezze d'onda xcitation nell'intervallo 650 a 900 nm, che ha il vantaggio di penetrazione nel tessuto maggiore rispetto alla luce ad una lunghezza d'onda inferiore, permettendo così una maggiore valutazione approfondita delle lesioni malattia. 60 Vi è anche ridotta segnale di fondo autofluorescenti di tessuto vascolare nel prossimo lunghezza d'onda -Infrared. Sebbene questo protocollo concentra sull'uso di NIRF dell'imaging ex vivo, imaging NIRF rappresenta anche una piattaforma utile per l'imaging molecolare longitudinale in vivo. Dell'imaging 9 NIRF, quando combinato con la microscopia intravitale, può avere applicazioni diagnostiche future nell'uomo. 61 Tuttavia, una limitazione dell'imaging NIR calcio longitudinalmente è che la sonda bisfosfonato derivato stessa può alterare il processo fisiologico di calcificazione. 62

    Calcificazione cardiovascolare è un processo regolato attivamente che coinvolge la transdifferenziazione di VSMC a un fenotipo osteogenico. 25,41,42 63 ed ha raggiunto un numero sufficiente di cellule per aorta murino effettuare studi in vitro (Figura 5). Una mi alternativaThOD per l'isolamento VSMC non comporta la digestione enzimatica, ma piuttosto la cultura diretta di anelli aortici espiantati; questa tecnica è stato segnalato per produrre meno cellule rispetto alla tecnica utilizzando la digestione enzimatica. 63,64

    Due supporti calcificazione differenti, sia con βGP / Asc / DEX 65,66 o NaPhos, 25,43 sono descritti che possono essere utilizzati per indurre calcificazione dei VSMCs. Entrambi i tipi di media sono stati utilizzati per calcificarsi VSMCs murini con successo equivalente. Mentre i media di calcificazione contenente βGP / Asc / DEX è stato utilizzato per calcificarsi VSMCs umani (Figura 6), il supporto contenente NaPhos non è stato efficace nel calcificazione VSMCs umani nella nostra esperienza. Inoltre, 21 - 28 giorni di coltura di VSMC umani in calcificazione media B può essere richiesto prima che venga rilevata la calcificazione. Calcificazione delle wild-type VSMCs in vitro è stata aumentata quando i livelli di espressione di MGP sono stati ridotti con siRNA e calcificatiè stato ridotto in MGP - / - VSMCs quando l'espressione MGP è stata restaurata (Figura 5). Questi risultati sono coerenti con la calcificazione aortica osservato in MGP - / - mice e suggeriscono che questo metodo in vitro di VSMC calcificazioni serve come un utile modello di calcificazione in vivo. E 'importante notare, tuttavia, che non ci sono limitazioni nel trarre le conclusioni per quanto riguarda i vasi sanguigni intatti da VSMCs coltivate. VSMC coltivate possono perdere le loro in vivo proprietà contrattili, in particolare a passaggi più alti, oltre allo sviluppo di cambiamenti nei modelli di espressione genica, la morfologia e la rigidità. 67-70 VSMCs coltivate in calcificazione dei media non differenziarsi per un lignaggio osteoblastica prima di calcificazione, ma non lo fanno esibire un intermedio chondrocytic che viene spesso osservato in vivo. 71 E 'quindi importante che le conclusioni tratte da meccanicistiche cellule coltivate convalidati in sistemi in vivo. Soprae il metodo potenziale di superare questa limitazione è quello di studiare VSMCs nel loro stato in vivo utilizzando un anello colta nave intatta. 70

    Due metodi differenti sono rappresentati per rilevare calcificazione VSMC coltivate, il metodo von Kossa (Figura 5) e NIR calcio colorazione (Figura 6). Sebbene frequentemente usato per valutare per calcificazioni, il metodo von Kossa è piuttosto limitata dalla sua specificità ridotta per cristalli di calcio. 50 calcio NIR è sentita essere specifico per la calcificazione ed è particolarmente vantaggiosa in quanto permette di colorazione simultanea con ulteriori fluorescente spettralmente distinti agenti. 9 applicazioni future di questo protocollo che utilizza NIR calcio con sonde molecolari aggiuntive possono fornire importanti informazioni sui meccanismi di calcificazione e possono consentire la rapida valutazione di piccole molecole inibitrici di VSMC calcificazioni in maniera high-throughput, per identify potenziali nuove terapie per la calcificazione vascolare.

    In sintesi, la calcificazione cardiovascolare è un importante fattore di rischio e sostenere il potenziale di malattia clinica. La conoscenza dei meccanismi di calcificazione cardiovascolare e malattia aterosclerotica si basa sia su modelli cellulari di origine animale e. Metodologie per la valutazione calcificazione nei modelli in vivo, ex vivo e in vitro sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione delle malattie cardiovascolari.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione
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    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

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