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Medicine

Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

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A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo, incluindo os Estados Unidos, onde é responsável por mais de 780.000 mortes anualmente. 1 calcificação da artéria coronária e calcificação aórtica são características da doença aterosclerótica e servem como fortes preditores de eventos cardiovasculares. 2- 4 dois tipos principais de calcificação vascular foram relatadas em adultos: a calcificação da íntima, associado com a aterosclerose, e medial (também conhecido como Mönckeberg) calcificação, associada à doença renal crônica e diabetes 5 intimal calcificação ocorre no cenário de acumulação de lípidos e macrófagos. infiltração na parede do vaso. 5,6 calcificação parede medial ocorre independentemente da calcificação da intima, localiza-se às fibras de elastina ou de células musculares lisas, e não está associada com a deposição de lípidos ou de infiltração de macrófagos. 5,7,8 Estudos sobre os mecanismos moleculares decalcificação vascular têm contado com sistemas modelo baseados em células e animais. Modelos de roedores para a doença atherocalcific incluem ratinhos deficientes em qualquer apolipoproteína E (ApoE) 9,10 ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) 11 alimentados com uma dieta rica em gordura, enquanto os modelos para a calcificação medial incluem ratos com proteína Gla de matriz deficiência (MGP) 12 ou ratos que desenvolvem uremia quer por nefrectomia quase total (a 5/6 modelo de nefrectomia) ou por exposição a uma dieta rica em adenina. 13

Aqui, o modelo de calcificação vascular medial associada com deficiência de MGP é focado na. MGP é uma proteína extracelular que inibe a calcificação arterial. 12 As mutações no gene de MGP foram identificados na síndrome Keutel, uma doença humana rara caracterizada por calcificação da cartilagem difusa para além brachytelephalangy, perda de audição, e estenose pulmonar periférica 14-18. Embora não seja frequentemente observado, 19calcificação concêntrica de múltiplas artérias foi descrito na síndrome Keutel. 20 polimorfismos comuns no gene MGP humana estão associados com risco aumentado de calcificação da artéria coronária, 21-23, enquanto os níveis circulantes mais elevados de uncarboxylated MGP, biologicamente inactivo prever a mortalidade cardiovascular. 24 Ao contrário dos humanos com a síndrome Keutel, ratos MGP-deficientes desenvolvem um fenótipo vascular grave que consiste de calcificação arterial generalizada espontânea a partir de duas semanas de idade e morrem 6-8 semanas após o nascimento, devido à ruptura da aorta 12.

Ao contrário da ApoE - / - e de LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura, que se desenvolvem calcificação vascular da íntima com a inflamação induzida por macrófago associada, MGP - / -. Ratinhos desenvolvem calcificação vascular medial na ausência de infiltração de macrófagos 11,25 Embora estes resultados sugerem diferentes estímulos subjacentes para intimai e calcificação da média, há sobreposição nos mecanismos de sinalização que medeiam a ambas as formas de calcificação. 26 múltiplas vias de sinalização tenham sido identificados que contribuem para a calcificação vascular incluindo mediadores inflamatórios tais como factor de necrose tumoral-α e IL-1 e factores pró-osteogénicas tais como Notch, Wnt, e proteína morfogenética do osso (BMP) de sinalização. Estas vias de sinalização 27,28 aumentar a expressão dos factores de transcrição relacionados com o factor de transcrição enfezado 2 (Runx2) e osterix, que por sua vez aumentar a expressão de proteínas relacionadas com os ossos ( . por exemplo, a osteocalcina, sclerostin, e fosfatase alcalina) na vasculatura que medeiam a calcificação 28-30 Nós e outros demonstraram que a calcificação vascular observada em ApoE - / - e de LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura e a espontânea calcificação vascular observada em MGP - / - ratos todos dependem de proteína morfogenética óssea (BMP) signaling, e é esta via que é focado sobre aqui. 11,25,31 BMPs são potentes factores osteogénicos necessários para a formação óssea e são conhecidos por apresentar um aumento da expressão na aterosclerose humana. 32-34 Estudos in vitro têm implicado na regulação de sinalização de BMP a expressão de factores osteogénicos, tais como Runx2 35-37. a sobre-expressão do ligando BMP, BMP-2, acelera o desenvolvimento da calcificação vascular em ratinhos ApoE-deficient alimentados com uma dieta rica em gordura. 38 Além disso, a utilização de inibidores específicos de BMP tais sinalização como LDN-193189 (LDN) 39,40 e / ou ALK3-Fc impede o desenvolvimento de calcificação vascular em ambos LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta rica em gordura e ratos MGP-deficientes 11,25.

Células do músculo liso vascular (VSMC) têm um papel crítico no desenvolvimento da calcificação vascular. 30,41,42 A calcificação vascular medial que se desenvolve em ratinhos deficientes MGP é caractezado por uma transdiferenciação de VSMC a um fenótipo osteogênico. Perda de MGP resulta na diminuição da expressão de marcadores de VSMC incluindo myocardin e alfa actina de músculo liso, com um aumento concomitante nos marcadores osteogénicas, tais como Runx2 e osteopontina. Estas alterações coincidir com o desenvolvimento de calcificação vascular 25,43,44.

Calcificação aórtica e inflamação em ratinhos são tipicamente avaliada utilizando técnicas histoquímicas, como atividade de fosfatase alcalina para a calcificação precoce e actividade osteogénica, von Kossa e Alizarina coloração vermelha para o final de calcificação e protocolos de imuno-histoquímica que têm como alvo proteínas marcadores de macrófagos (por exemplo., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 no entanto, estas técnicas de imagiologia convencionais implicam o tratamento de tecidos da aorta em secções transversais, o que é demorado e imperfeito devido à polarização de amostragem, e estão limitados na sua capacidade de quantificar a inflamação e calcificatiônica em toda a aorta. Este protocolo descreve um método para visualizar e quantificar a calcificação arterial aórtica e médias todo e acumulação de macrófagos utilizando fluorescente no infravermelho próximo (NIR) imagiologia molecular ex vivo. Também é fornecido um método para a colheita e a cultura de VSMCs primária da aorta de ratinhos, e induzindo a calcificação de murino e VSMCs humanas in vitro a fim de determinar os mecanismos moleculares subjacentes a calcificação vascular. Estas técnicas proporcionam o investigador com tanto in vivo e in vitro para estudar a doença atherocalcific.

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Protocol

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Todos os estudos com ratos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Habitação e todos os procedimentos que envolvem ratos descritos neste estudo foram aprovados pelo Cuidado Institucional Animal e Uso Comitês do Massachusetts General Hospital (Subcomissão de Investigação Animal Care). Todos os procedimentos foram realizados com cuidado para minimizar o sofrimento.

1. Preparação dos Reagentes

  1. Near-Infrared fluorescência imagem de todo aortas
    Nota:. Um derivado de bisfosfonato, de infravermelho próximo sonda de imagiologia fluorescente pode ser usado para marcar a actividade osteogénica na vasculatura por ligação a hidroxiapatite 46,47 Uma sonda de imagem activadas fluorescentes-catepsina pode servir como um marcador para a actividade proteolítica dos macrófagos e, em elastolítico a vasculatura. 9 Para permitir a utilização simultânea de ambas as sondas fluorescentes, é importantepara utilizar sondas que são espectralmente distinto. O cálcio notação NIR será usado para indicar o infravermelho próximo sonda de imagem fluorescente e catepsina-NIR específica calcificação para indicar a sonda de imagiologia fluorescente catepsina específico da actividade de infravermelho próximo.
    1. Preparar as soluções de cálcio e catepsina NIR NIR. De acordo com os protocolos do fabricante, adicionar 1,2 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS) para o frasco contendo 24 nmol de cálcio NIR ou catepsina NIR e agitar suavemente.
      Nota: De acordo com o fabricante, uma vez reconstituído com PBS, as soluções de cálcio e NIR NIR catepsina permanecerá estável durante 14 dias quando armazenado no escuro a 2-8 ° C.
  2. Isolamento e calcificação de Murino aórtica VSMC
    1. A digestão da aorta Solução:
      1. Prepara-se uma solução fresca (~ 3-5 ml por aorta retirado) com Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) contendo 175 U / ml de tipo 2 e 1,25 U de colagenase / elastase ml. Esterilizar a solução wom de um sistema de filtração de 0,22 um accionado por vácuo e manter a solução em gelo até à sua utilização.
    2. Meios celular:
      1. Suplemento 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.
    3. Calcificação de mídia:
      1. Calcificação de mídia A (NaPhos; utilizado em linhas de células de rato):
        1. Suplemento 100-500 mL de meio DMEM (volume conforme o necessário) com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de fosfato de sódio, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.

          OU
      2. Calcificação Mídia B (βGP / Asc / DEX; utilizado em qualquer mouse ou linhas de células humanas):
        1. Suplemento 100-500 mL de meio DMEM (volume conforme o necessário) com 10% de soro fetal bovino, 10 mM de dissódio β-glicerofosfato, 50 ug / ml de ácido L-ascórbico, 10nM dexametasona, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.

2. injecção na veia da cauda

  1. Antes da injecção cauda, ​​aquecer os ratos sob uma lâmpada de aquecimento leve para 5 min.
  2. Contenha o mouse em um suporte de tubo de roedor. Desinfectar a cauda com um algodão embebido em álcool.
  3. Utilizar uma agulha de 30 G para a injecção na veia da cauda. veias da cauda estão localizados lateralmente.
    1. Aplique uma quantidade suave de pressão para a frente da seringa quando a agulha é avançada na cauda. A veia é acedida uma vez que a resistência a injecção não está mais presente.
    2. Injectar um volume de 100 ul de cálcio NIR e / ou 100 ul de catepsina NIR a uma taxa constante. No final da injecção, depois de uma pausa de 5 segundos, retirar a agulha.
  4. Colheita das aortas (ver secção 3) 3-24 horas após a injeção.

3. Rato Dissection

  • Euthanize rato com um 200 mg de injeção de pentobarbital / kg intraperitoneal.
  • Coloque o supino animal na placa de dissecção e estabilizar gravando cada pata para o conselho. Usando um microscópio de dissecação e uma tesoura pequena, fazer uma incisão na linha média que se estende desde a parte inferior do abdômen ao tórax superior.
  • Retire a pele com uma pinça e retire o peritônio, revelando os órgãos abdominais. Retirar os órgãos gastrointestinais, tomando cuidado para não transecto da aorta.
  • Adicione uma incisão lateral no diafragma anterior e continuar a incisão através do abdómen. Com uma tesoura de dissecação, libertar a caixa torácica com o corte através dos lados das nervuras e a remoção do tecido mole aderente à parte superior do esterno. Remover a caixa torácica, revelando os pulmões.
  • Deixe o coração no lugar inicialmente (para auxílio na identificação e dissecção da aorta proximal) e retire cuidadosamente os pulmões. Remova o timo, traquéia e esôfago com cuidado, ensuring que a aorta permanece intacta.
  • Utilizando uma pinça reta finas e-dissecando tesoura micro, remover o tecido mole ao redor da aorta da bifurcação ilíaca ao arco aórtico, prestando muita atenção ao retirar o peri-aórtico de gordura (Figura 1A). Retire a gordura e tecido mole permanecendo em torno das grandes ramos do arco aórtico (artérias ou seja, braquiocefálicas, carótida comum e subclávia, Figura 1B).
    Nota: É importante remover a gordura da aorta porque a gordura pode aumentar o sinal de fundo ao realizar imagiologia de fluorescência.
  • Tiraram o coração do interior da cavidade torácica, destacando-o cuidadosamente da aorta proximal, e descartar. Transecto da aorta distal, na bifurcação ilíaca. Usando uma agulha de insulina, injectar solução salina normal para a aorta a partir do arco da aorta para lavar os glóbulos remanescentes. Retire a aorta, juntamente com os vasos do arco aórtico, removê-lo completamentea partir do corpo.
  • Coloque a aorta em solução salina normal em gelo até estarem prontos para imagiologia.
  • 4. aórtica Imagiologia

    1. Aortas imagem ex vivo imediatamente após a colheita por imagem de fluorescência de reflectância de infravermelho próximo. 25
      1. Definir o gerador de imagens de fluorescência nos comprimentos de onda adequados para quantificar multicanal intensidades de sinal de fluorescência a partir das aortas de ratos e de cálcio NIR catepsina NIR-injectado, tal como anteriormente descrito. 25 De acordo com o fabricante, NIR de cálcio pode ser excitado por ~ 650-678 nm com luz uma emissão máxima no 680-700 nm gama ~. Catepsina NIR pode ser animado por ~ 745-750 nm de luz com uma emissão máxima em ~ 770 nm.

    5. Isolamento de Primário Murino aórtica vasculares células musculares lisas

    1. Execute os passos 3,1-3,7 como descrito acima.
    2. Coloque aortas em HBSS frio até que as dissecações estão completos. Cortar cuidadosamente qualquer remaining periaórtica gordura e de tecido mole, deixando apenas a aorta.
    3. Dentro de uma câmara de cultura de tecido estéril, transferir as aortas para a digestão Solução de aorta no de 35 mm x 10 mm pratos de cultura de tecidos. Coloque dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 30 min com agitação intermitente suave. Após a digestão, as aortas exibem uma aparência esticada ou desgastado.
    4. Com o microscópio de dissecção e uma pinça estéril, remover a camada adventícia exterior da aorta, mantendo a camada medial intacta. Uma técnica para a remoção da adventícia é para descascar a camada exterior da aorta em uma extremidade e removê-la a partir da camada média subjacente como uma meia poderia ser retirada e removida.
    5. Uma vez que a camada adventícia foi removido, colocar os restantes aorta para uma nova placa de cultura de tecidos com meio de cultura celular e armazenamento a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2-4 horas.
    6. Dentro de uma câmara estéril e usando 3 mm estéreis tesoura micro-dissecação, cortados em aorta 1-2 mm de larguraanéis.
    7. Colocar estes anéis numa nova placa de cultura de tecidos com aórtica Digestão solução e incubar a 37 ° C com balanço suave intermitente durante 120 min. Pipetar a solução para cima e para baixo várias vezes durante a incubação para ressuspender as células.
    8. Adicionar 5 ml de meio de cultura de célula quente para a solução de digestão e transferir para um tubo de 15 ml.
    9. Centrifugar o tubo durante 5 min a 200 x g.
    10. Aspirar os meios de comunicação e Ressuspender as células no volume desejado de meio de cultura de células (por exemplo, 5 ml).
    11. Placa toda a quantidade de células isoladas da aorta em cada uma 25 centímetros frasco de cultura 2 de células e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Propagar células utilizando técnicas padrão, tal como anteriormente descrito. 25,48 Durante os primeiros 7-10 dias de incubação, alterar o suporte de todas as 72-96 horas. À medida que as células se aproximar confluência, repor a mídia com mais frequência (a cada 48 horas).
      Nota: Pode levar várias semanas para crescer um qua suficiententity de células.
    12. Uma vez confluentes, as células de passagem com tripsina, que é aquecido a 37 ° C.
      1. Adicionar 0,5-1,0 ml de tripsina a cada balão de cultura e incuba-se durante 3-5 minutos; bata suavemente a parede lateral do balão a cada 30-60 segundos, conforme necessário para separar as células da superfície.
      2. Uma vez que as células de separar a partir do fundo do frasco, adicionar 10 ml de meio celular para as células em tripsina. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min. Aspirar os meios de comunicação e tripsina a partir do sedimento de células. Ressuspender as células na quantidade desejada de meios de células frescas (por exemplo, 5-10 ml) e transferir para um novo frasco (com algumas células transferidas para uma lâmina de câmara).
    13. Na primeira passagem de células, confirmar a linhagem de células do músculo liso com técnicas de imunocitoquímica padrão, como descrito anteriormente, 49 utilizando um anticorpo dirigido contra a actina de músculo liso-α.

    6. Indução de calcificação do músculo liso Cultivadascélulas

    1. células da placa obtido a partir de 5,12 em um formato de 6 poços. Nota: A partir de 1 x 10 5 células / poço num volume total de 2,0 ml de meio de células por poço é recomendado.
    2. Permitir que as células crescer em Meio A calcificação ou B, pelo menos, 7 dias num formato de placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2.
    3. Mudança de mídia celulares a cada 48 horas.

    7. Avaliação Calcificação VSMC Usando o método de coloração de von Kossa

    Nota:. O método de von Kossa para medir a calcificação da matriz extracelular de tecidos ou células cultivadas é baseado na substituição de iões de cálcio ligados a fosfato com os iões de prata 50 Na presença de compostos leves e orgânicas, os iões de prata são reduzidos e visualizada como metálico prata. Qualquer prata que não reagiu é removido por tratamento com tiossulfato de sódio a 50 O protocolo para a coloração de von Kossa é como se segue.:

    1. media aspirado de cu celularplacas LTURE.
    2. Fixar as células, colocando-os em 1 ml de formalina a 10% à temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Remover o formalina e lavar as células fixadas com água destilada durante 5 minutos.
    4. Incubar as células em 1 ml de solução de nitrato de prata a 5% sob uma lâmpada de 60-100 W durante 1-2 horas.
    5. Aspirar a solução de nitrato de prata e lava-se com água destilada durante 5 minutos.
    6. Remover prata que não reagiu por colocação das células em 1 ml de 5% de tiossulfato de sódio a solução em água destilada durante 5 minutos (v / w).
    7. Lavar as células com água destilada durante 5 minutos. Repetir 3x lavagens. A mancha von Kossa está pronto para geração de imagens com microscopia de luz invertida padrão.
    8. Passo opcional: contracoloração com 1 mL de vermelho rápido nuclear durante 5 min. Seguir-se com três lavagens com água destilada (5 minutos cada).

    OU

    8. Avaliar VSMC calcificação com a imagem fluorescente Near-infrared

    Nota: Semelhante a sua capacidadepara identificar a calcificação dentro aortas de rato, cálcio NIR prontamente se liga mineral calcificada depositado por células cultivadas. Usando esta técnica, microscopia fluorescente e leitores de placas com filtros de comprimento de onda longos podem imagem e quantificar a calcificação in vitro, respectivamente. O comprimento de onda de emissão longo do cálcio NIR permite a utilização simultânea de fluoróforos que emitem comprimentos de onda mais baixo para detectar outras características. O protocolo para o cálcio NIR coloração é como se segue:

    1. Conforme descrito na Seção 1.1.1, adicionar 1,2 ml de 1x PBS para o frasco contendo 24 nmol de cálcio NIR.
    2. Diluir o cálcio estoque NIR 1: 100 na calcificação ou de controle de mídia apropriados.
    3. meios de células de aspirado de placas de cultura e substituir com o cálcio NIR contendo meio de cultura.
    4. Incubar as placas de cultura com meios NIR de cálcio durante a noite a 37 ° C.
    5. Aspirar a mídia dos poços e lavar os poços uma vez com PBS.
      Nota: Neste ponto,o meio de cultura original pode ser adicionado aos poços, e as células podem ser trabalhada ao vivo. Caso contrário, continue com os passos abaixo.
    6. Fixar as células, colocando-os em 1 ml de formalina a 10% à temperatura ambiente durante 20 min.
    7. Remover o formalina e lavar as células fixadas com água destilada durante 5 minutos. Repetir 3x lavagens.
    8. Etapa opcional:. Execute imunofluorescência ou outros counterstains para proteínas de interesse 8,9
    9. Imagem ou detectar a mancha NIR de cálcio usando comprimentos de onda de fluorescência apropriado de excitação (por exemplo, NIR de cálcio podem ser excitados por luz 650-678 nm) e filtros de emissão (~ 680-700 nm).

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    Representative Results

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    Calcificação aórtica em MGP - / - e murganhos de tipo selvagem foi medida utilizando imagiologia de fluorescência NIR cálcio. Nenhum sinal foi detectado NIR cálcio nas aortas de ratinhos de tipo selvagem, indicando a ausência de calcificação (Figura 2). Um sinal de NIR de cálcio forte foi detectada nas aortas de MGP com deficiência de camundongos, o que é consistente com calcificação vascular avançada. As secções de tecido de aorta a partir de tipo selvagem e MGP - / - ratos foram corados com vermelho de alizarina 25 (Figura 3A - B), o que confirma a grande calcificação vascular observada em ratinhos deficientes em MGP sem calcificação detectada em ratinhos de tipo selvagem. Para determinar se a calcificação vascular associada com a deficiência de MGP é dependente da sinalização de BMP, MGP - / - ratos foram tratados com LDN, ALK3-Fc, ou veículo a começar no dia 1 de vida. Estes ratinhos foram injectados com cálcio NIR no dia 27 eAs aortas foram recolhidas no dia seguinte. Inibição farmacológica da BMP sinalização reduzida calcificação aórtica detectada com cálcio NIR (Figura 2). Semelhante aos achados com cálcio NIR, as aortas de LDN- e ALK3-Fc-tratados MGP - / - ratos tinham reduzido Alizarina mancha vermelha para o cálcio quando comparados aos tratados com o veículo do POP - / - ratos (Figura 3B - D). Estes resultados indicam que a sinalização de BMP é necessário para a calcificação vascular observado na MGP - / - ratos.

    LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta rica em gordura desenvolver tanto a inflamação macrófagos e calcificação da parede arterial 11 de injecção na veia da cauda simultânea de calcificada e específicos de catepsina sondas NIR em MGP -. / - Ratos foi realizada para determinar se a calcificação vascular de MGP -deficiência está associada com acúmulo de macrófagos 25 LDLR -. / - ratos alimentadosuma alta ratos da dieta e do tipo selvagem de gordura foram usadas como controlos positivos e negativos, respectivamente. Aortas de ratinhos de tipo selvagem exibiram praticamente nenhum sinal de NIR de cálcio ou catepsina NIR, como previsto (Figura 4A). Cálcio NIR e NIR catepsina sinais localizada-co que favoreceram a região do arco aórtico foram observados no LDLR - / - ratos, indicando uma forte associação entre infiltração de macrófagos e calcificação vascular neste modelo de aterosclerose íntima. Embora um sinal de difuso e de cálcio NIR forte foi observada em aorta de MGP - / - ratos, o sinal de catepsina NIR não foi diferente do de ratinhos de tipo selvagem. Estes resultados indicam que a calcificação vascular em deficiência de MGP ocorre na ausência de acumulação de macrófagos. Para confirmar ainda mais estas descobertas, a partir de aortas de tipo selvagem, MGP - / -, e LDLR - / - ratos foram colhidas, seccionadas e coradas com um anticorpo específico para o marcador de macrófagos MAC-2 ( - / - ratos demonstraram abundante MAC-2 coloração; não foi detectável MAC-2 coloração nas aortas de MGP - / - ratos, indicando uma ausência de macrófagos vasculares.

    Para modelar calcificação vascular in vitro, VSMCs de aorta foram isoladas a partir de tipo selvagem e MGP - / - ratos e cultivadas em alta-fosfato contendo meios de comunicação, usando o protocolo descrito acima. Para determinar o papel de MGP na modulação da calcificação das VSMC cultivadas, de um adenovírus que expressa MGP (Ad.MGP) foi usada para restaurar MGP em VSMC da aorta da MGP - / - ratos. VSMC MGP-deficientes infectados com um adenovírus expressando a proteína fluorescente verde (Ad.GFP) foram utilizados como controle. Além disso, para determinar o efeito da remoção de expressão MGP de VSMC na subsequente calcificação, as VSMCs de aorta de ratinhos do tipo selvagem foram tratadas com ARNsi dirigido contra a MGP (siMGP) ou ARNsi de controlo (sisc). A calcificação foi induzida em VSMC cultivadas por crescimento das células em meio A calcificação durante 7 dias. As células foram subsequentemente fixadas e coradas para o cálcio usando o método de von Kossa. Restauração da MGP com Ad.MGP reduzida calcificação da MGP - / - VSMC em comparação com células de controlo tratados com adenovírus (Figura 5A - B, E). Tratamento de VSMC da aorta do tipo selvagem com siMGP, resultando em> 95% knockdown de expressão MGP, 25 aumentaram a calcificação em comparação com células tratadas com sisc (Figura 5C - D, F). Estes resultados indicam que este modelo in vitro de VSMC imita calcificação as descobertas em camundongos MGP-deficiente e demonstra que MGP modula calcificação das VSMC cultivadas.

    Um método alternativo para a detecção de calcificação das VSMC cultivadas é com cálcio NIR. Para modelar calcificação vascular em v ITRO, VSMCs de artérias coronárias humanas foram adquiridos e cultivadas durante 21 dias na calcificação Meios B. Seguindo o período de tratamento, a calcificação foi identificado utilizando o método de NIR de cálcio e as culturas foram contrastadas com uma sonda personalizada verde-fluorescente de colagénio e 51 de corante Hoechst (1 ug / ml durante 5 min após fixação em formalina a 10%) (Figura 6). Núcleos VSMC foram observados com azul fluorescente Hoechst por microscopia confocal (Figura 6A). Uma secção óptica representativo mostra mineral calcificada cálcio NIR-coradas dentro da matriz de colagénio produzida pelo VSMC (Figura 6B). Reconstruções tridimensionais de Z-pilhas ópticos ilustrar as camadas criadas em cultura como as VSMC na parte inferior do poço produzir uma matriz de colagénio em que o mineral depositado torna-se calcificada aprisionado (Figura 6C - D).

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    Figura 1:. Representativas Dissecção de uma aorta de um rato do tipo selvagem (A) Uma imagem da aorta torácica e abdominal, que se estende para a bifurcação ilíaca comum é artéria representada depois da remoção dos órgãos sobrejacentes e gordura peri-aórtico. (B) Uma vista do arco aórtico focado com o braquiocefálico, carótida comum esquerda e artéria subclávia esquerda. Barras de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2: A calcificação vascular em MGP - / - ratos é dependente de sinalização de BMP MGP - / - ratos foram tratados com injecção intraperitoneal (IP) quer injecções de ve. culo, LDN-193189 (LDN, 2,5 mg / kg / dia), ou ALK3-Fc (2 mg / kg a cada dois dias) e do tipo selvagem, os ratos foram tratados com injecções ip de veículo começando no dia 1 de vida até ao dia 28 . No dia 27, os ratinhos foram injectados com NIR de cálcio através da veia da cauda. Aortas foram colhidas no dia 28 e fotografada com fluorescência do infravermelho próximo. As imagens são com a mesma ampliação em todos os quatro painéis com a barra de escala indica 3 mm. Aortas de rato do tipo selvagem não apresentaram sinal de NIR de cálcio, enquanto aortas de MGP - / - ratos tiveram um sinal de NIR de cálcio forte. Em comparação com tratados com o veículo do POP - / - ratos, as aortas de MGP - / - ratos tratados com LDN ou ALK3-Fc apresentaram redução significativamente sinais NIR cálcio. Este valor é retirado de referência 25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 3: Farmacológicos Inibição da BMP Sinalização Impede aórtica calcificação em ratinhos MGP deficientes em ratinhos de tipo selvagem foram tratados com injecções ip de veículo (A) e MGP - / - ratos foram tratados com injecções ip de veículo (B), LDN. (C, 2,5 mg / kg / dia), ou ALK3-Fc (D, 2 mg / kg em dias alternados), começando no dia 1 de vida até ao dia 28. As aortas foram recolhidas, seccionados e corados para cálcio com vermelho de alizarina. As imagens foram tiradas com a mesma ampliação em todos os quatro painéis com a barra de escala indica 400 uM. De forma semelhante aos sinais de NIR de cálcio na Figura 2, a coloração com vermelho de alizarina demonstra um pesado fardo de calcificação nas aortas de GPM tratados com veículo - / - ratos. A calcificação é reduzido nas aortas de LDN- e ALK3-Fc-tratados MGP - / - ratos. Este valor é retirado dereferência 25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    . Figura 4: Determinação simultânea da aorta Calcificação e macrófago infiltração com cálcio NIR e Catepsina NIR (A) de tipo selvagem, MGP - / -, e LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta rica em gordura foram injectados com cálcio NIR e catepsina NIR através de injecção na veia da cauda. Aortas foram colhidas 24 horas mais tarde e avaliados com imagens de fluorescência do infravermelho próximo. As imagens são com a mesma ampliação com a barra de escala indica 3 mm. camundongos selvagens exibem praticamente nenhuma calcificação aórtica ou presença de macrófagos. As aortas de LDLR - / - ratos têm calcificação extensa que a co-localiza com acúmulo de macrófagos. Em contraste, MGP - / - Ratos têm calcificação da aorta que ocorre na ausência da infiltração de macrófagos. (B) aortas foram colhidas a partir de tipo selvagem, MGP - / -, e LDLR - / - ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura. Estes aortas foram seccionados e corados para macrófagos com um anticorpo específico para MAC-2. Os núcleos foram corados com DAPI. A superfície luminal é para a direita em cada painel. As imagens foram tiradas com a mesma ampliação em todos os três painéis com a barra de escala indica 100 um. Semelhantes aos achados em (A), não houve evidência de acumulação de macrófagos nas aortas de MGP - / - ratos. Esta figura é uma versão modificada de uma figura de referência 25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    . Figura 5: MGP Protege VSMC cultivadas a partir de calcificação VSMC cultivadas de aorta foram isoladas a partir de MGP - / - ratos e infectadas com adenovírus expressando GFP, quer (A) ou MGP (B). As VSMC aórticas isoladas a partir de ratinhos do tipo selvagem foram transfectadas com ARNsi de controlo scrambled (C) ou siRNA alvejando MGP (D). As células foram cultivadas em Meio A calcificação durante 7 dias e, subsequentemente, fixadas e coradas com Von Kossa. As imagens foram tiradas com a mesma ampliação em todos os quatro painéis (A - D) com a barra de escala indica 200 um. Campos de série de vista foram fotografados e quantificadas para a coloração de cálcio usando a imagem do software J após a subtracção de fundo (E e F), com barras de erro indicam SEM. Esta figura é uma versão modificada de uma figura de referência 25.4017fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 6
    Figura 6:. Cálcio NIR Identifica calcificação em associação com a matriz extracelular in vitro (A) VSMC artérias coronárias humanas cultivadas em calcificação de mídia B durante 21 dias foram identificados pela coloração nuclear com Hoechst corante. (B) Uma secção óptica obtida por microscopia confocal de coloração NIR cálcio (vermelho) combinada com uma sonda de colagénio verde-fluorescente mostra mineral calcificada por toda a matriz de colagénio. Imagens de A - B foram tomadas com a mesma ampliação com a barra de escala que indica 10 um. (C e D) reconstruções tridimensionais mostram o aprisionamento de mineral calcificada dentro tele colágeno matriz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

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    Calcificação arterial é um importante fator de risco para as doenças cardiovasculares em seres humanos e pode contribuir diretamente para a patogênese de eventos cardiovasculares. 1,5,52 deposição de cálcio íntima nas calotas fibrosos finos de doença aterosclerótica foi proposto para aumentar o estresse biomecânico local e contribuir para ruptura da placa. 53,54 impactos calcificação Medial resultados clínicos, aumentando a rigidez arterial, o que pode induzir a hipertrofia cardíaca e afetam a função cardíaca. 55 Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes a calcificação vascular irá fornecer importantes insights sobre doenças humanas e potencialmente identificar novos alvos para terapia.

    Aqui, é descrito um método para a detecção de calcificação aórtica e acumulação de macrófagos em modelos murinos de aterosclerose e calcificação vascular utilizando imagiologia NIRF 9. É fundamental para injectar com precisão o NIRagentes F na veia da cauda. Esta é uma técnica que exige prática significativa antes domínio é conseguido. 56 Além disso, é importante remover toda a gordura peri-aórtico da aorta, como esta gordura pode causar um sinal autofluorescente ao mesmo comprimento de onda, como o cálcio NIR e catepsina sinais NIR. O uso de agentes NIRF tem muitas vantagens importantes sobre os métodos histológicos padronizados de avaliação da calcificação vascular e inflamação. Em contraste com as técnicas histológicas convencionais, estes agentes de permitir a quantificação da calcificação aórtica todo e infiltração de macrófagos. Além disso, eles proporcionam um método mais sensível para a detecção de alterações precoces associados com o desenvolvimento de calcificação da aorta do que a coloração histológica e pode, por conseguinte, oferecer uma visão mecanísticos em fases iniciais da doença. 9 Locais de sinal NIR cálcio início estão associados com marcadores de formação óssea incluindo aumento atividade de fosfatase alcalina, bem assiml como a expressão do gene Runx2 e osteopontina. Além disso, a utilização simultânea de sondas espectralmente distintos para calcificação e atividade catepsina permite a quantificação e associação da progressão espaço-temporal de ambos doença ateromatosa e calcificada 9.

    Identificar as características espaciais e temporais de calcificação e inflamação ajudas vasculares em nossa compreensão dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes da doença vascular. Por exemplo, a utilização de agentes NIRF demonstrou que em modelos de calcificação da intima (ApoE - / - e de LDLR - / - ratos com uma dieta rica em gordura), calcificação co-localiza em locais de acumulação de macrófagos vascular (Figura 4) e calcificação que segue a acumulação de macrófagos temporalmente. 9,11 Curiosamente, nenhuma acumulação de macrófagos com catepsina NIR foi detectado na calcificação vascular medial encontrada em ratinhos deficientes em POP. 25 quis, a partir de experiências utilizando agentes NIRF, pode concluir-se que, embora a acumulação de macrófagos está associada com a calcificação da intima vascular, que não é necessário para a calcificação vascular medial.

    Semelhante ao seu papel na imagem e estudar a doença vascular, imagens NIRF tem sido utilizada para estudar a doença da válvula aórtica. 47 doença da válvula aórtica é marcada por lesões macrófagos e calcificados carregados de lipídios na válvula e apresenta mecanismos moleculares subjacentes similares e determinantes genéticos como aterosclerose . 57-59 calcificação da válvula aórtica causa comprometimento da função folheto e é a principal causa da estenose aórtica clínica em idosos. O único tratamento disponível atualmente para a estenose aórtica sintomática é a substituição da válvula. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares da doença da válvula aórtica é necessário para impedir a fase final de complicações clínicas de calcificação da válvula aórtica progressiva. Utilização de NIAgentes RF como ferramentas de imagem molecular em modelos animais fornece um método sensível para avaliar a doença da válvula aórtica em seus estágios iniciais 60.

    Técnicas padrão para visualizar placas de artérias coronárias têm incidido sobre a gravidade da estenose, mas a maioria das síndromes coronárias agudas resultam da ruptura de placas não-flow limitante. 6 Os processos biológicos no interior das placas, como a inflamação, servir como melhores preditores de ruptura de placa do que o grau de estenose. 61 ao contrário de técnicas de imagiologia convencionais, NIRF de imagem fornece uma oportunidade para medir a actividade celular (ou seja, a actividade proteolítica dos macrófagos com uma metaloproteinase de matriz (MMP) agente activável, actividade proteolítica e elastolítico com catepsina NIR, e actividade osteogénica com NIR cálcio). 9 Este método, portanto, fornece a avaliação anatômica e funcional simultânea de doença cardiovascular. NIRF imagem utiliza ecomprimentos de onda xcitation na gama de 650-900 nm, o que tem a vantagem de uma maior penetração nos tecidos em comparação com a luz a um comprimento de onda mais baixo, permitindo assim uma maior apreciação profundidade de lesões da doença. 60 Há também é reduzida sinal de fundo autofluorescente de tecido vascular no próximo comprimento de onda -infrared. Embora este protocolo centra-se no uso de NIRF imagiologia ex vivo, NIRF imagiologia também representa uma plataforma útil para imagiologia molecular longitudinal in vivo. Imagiologia 9 NIRF, quando combinado com microscopia intravital, pode ter aplicações de diagnóstico futuras em seres humanos. 61 No entanto, uma limitação de imagiologia NIR de cálcio é longitudinalmente que a sonda derivados do bisfosfonato pode-se alterar o processo fisiológico de calcificação. 62

    Calcificação cardiovascular é um processo activamente regulado que envolve a transdiferenciação de VSMC para um fenótipo osteogénico 25,41,42. 63 e alcançou um número adequado de células por aorta murino para realizar estudos in vitro (Figura 5). Um me alternativaTHOD para isolamento VSMC não envolve a digestão enzimática, mas sim a cultura directa de anéis de aorta explantados; esta técnica tem sido relatado para se obter menos células do que a técnica de utilização de digestão enzimática 63,64.

    Dois meios de calcificação diferentes, quer com βGP / Asc / ou DEX 65,66 NaPhos, 25,43 são descritos que podem ser utilizados para induzir a calcificação das VSMC. Ambos os tipos de meios têm sido utilizados para calcificar VSMCs de murinos com sucesso equivalente. Enquanto a mídia calcificação contendo βGP / Asc / DEX tem sido usado para calcificar VSMC humanos (Figura 6), a mídia contendo NaPhos não tem sido eficaz na calcifying VSMC humanos em nossa experiência. Além disso, 21 - podem ser necessários 28 dias de cultura de VSMC humanos na calcificação Mídia B antes de calcificação é detectado. Calcificação das VSMC do tipo selvagem in vitro foi maior quando os níveis de MGP expressão foram reduzidos com siRNA e calcificatina foi reduzido em MGP - / - quando VSMCs de expressão de MGP foi restaurado (Figura 5). Estes resultados são consistentes com a calcificação da aorta observada na MGP - / - murganhos e sugerem que este método in vitro de VSMC calcificação serve como um modelo útil de calcificação in vivo. É importante notar, contudo, que existem limitações em tirar conclusões sobre os vasos sanguíneos intactos de VSMC cultivadas. VSMC cultivadas podem perder suas in vivo propriedades contráteis, particularmente em passagens superiores, além de desenvolver mudanças nos padrões de expressão genética, morfologia e rigidez. 67-70 VSMC cultivadas em calcifying mídia se diferenciam de uma linhagem osteoblástica antes de calcificação, mas não exibem um intermediário condrocítico que é frequentemente observada in vivo. 71 Assim, é importante que as conclusões tiradas mecanicistas a partir de células cultivadas ser validado em sistemas in vivo. Eme método do potencial de superar essa limitação é estudar VSMC em seu estado in vivo usando um anel embarcação intacta culta 70.

    Dois métodos diferentes são apresentados para a detecção de calcificação das VSMC cultivadas, o método de von Kossa (Figura 5) e coloração de NIR de cálcio (Figura 6). Embora frequentemente utilizado para avaliar a calcificação, o método de Von Kossa está um tanto limitada pela sua especificidade reduzida para cristais de cálcio. 50 cálcio NIR é sentida para ser específico para a calcificação e é particularmente vantajoso na medida em que permite uma coloração simultânea com fluorescentes espectralmente distinto adicional agentes. 9 futuras aplicações deste protocolo utilizando NIR de cálcio com sondas moleculares adicionais podem fornecer importantes insights sobre os mecanismos de calcificação e pode permitir a rápida avaliação das pequenas moléculas inibidoras de VSMC calcificação de uma forma de alto rendimento, para iDEntify potenciais novas terapias para a calcificação vascular.

    Em resumo, a calcificação cardiovascular é um fator de risco importante para eo potencial contribuinte para a doença clínica. O conhecimento dos mecanismos de calcificação cardiovascular e doença aterosclerótica assenta em ambos os modelos baseados em células e animais. Metodologias de avaliação da calcificação em in vivo, ex vivo e in vitro modelos são fundamentais para avançar nossa compreensão da doença cardiovascular.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação
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    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

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