Этот протокол описывает использование многофотонной микроскопии для выполнения расширенного замедленную съемку многоклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени, в естественных условиях в одном разрешении клеток.
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Распространение опухолевых клеток из первичной опухоли молочной железы было показано, включать не только опухолевые клетки, но у себя стромальных клеток, включая макрофаги и эндотелиальные клетки. Кроме того, сосудистую сеть опухоли является ненормальным с повышенной проницаемостью 1. Таким образом, определение того, как опухолевые клетки, макрофаги и эндотелиальные клетки взаимодействуют посредничать проницаемость сосудов и опухолевых клеток intravasation в микросреды первичной опухоли имеет важное значение для понимания метастазирования. Понимание кинетики проницаемости сосудов, опухолевых клеток intravasation и основной механизм передачи сигналов многоклеточных взаимодействий в микроокружение опухоли может предоставить важную информацию в разработке и введению анти-терапии рака.
Основным средством изучения опухолевой сосудистой проницаемости в естественных условиях было измерение экстраваскулярных красителей , таких как голубой Эванса 2, декстраны с высокой молекулярной массой (155 кДа)3 и флуорофор или радиоиндикаторные-конъюгированные белки ( в том числе альбумин) 4 в фиксированные моменты времени после инъекции красителя. Достижения в области микроскопии, животные модели и флуоресцентные красители позволили визуализации клеточных процессов и проницаемости сосудов в живых животных через прижизненной микроскопии 5.
Живое животное изображений с приобретением статических изображений или короткое время покадровой последовательностей в течение нескольких моментов времени не позволяет для полного понимания динамических событий в микроокружение опухоли 6,7. В самом деле, статическое получение изображений в течение 24 часов , показали , что опухоль сосудистая негерметичен, однако динамика проницаемости сосудов не наблюдалось 6. Таким образом, расширенное время непрерывной покадровой изображений до 12 часов захватывает кинетики динамических событий в микроокружение опухоли.
Этот протокол описывает использование расширенного покадровой multiphotна прижизненной микроскопии для изучения динамических многоклеточные событий в опухоли микроокружения. Несколько типов клеток в опухоли микроокружения помечены инъекционные красителей или с использованием трансгенных животных, экспрессирующие флуоресцентные белки. Использование вены катетер хвоста сосудистые красители или белки могут быть инъецированы после начала обработки изображений для получения кинетических данных многоклеточных событий в микроокружение опухоли. Для получения изображений живых клеток опухоли молочной подвергается через хирургической подготовки кожного лоскута. Изображения приобретаются на срок до 12 часов с использованием многофотонного микроскопа , оборудованного с несколькими фотоумножителей (ФЭУ) детекторов 8. При использовании соответствующих фильтров, алгоритм вычитания позволяет 4 детекторов PMT приобрести 5 флуоресцентные сигналы в опухоли микроокружения одновременно 9. Высокое разрешение многофотонная прижизненной микроскопии захватывает одного элемента разрешения визуализации опухоли стромы взаимодействий в микроокружение опухоли, что приводит к лучшему Understanding проницаемости сосудов и intravasation опухолевых клеток 10-13. В частности, расширенные прижизненной визуализации выявили высоколокализованной, транзиторные сосудистых событий , которые происходят проницаемости селективно на участках взаимодействия между опухолевой клетки, макрофаг и эндотелиальных клеток (определяемой как Опухоль микросреде метастаз, TMEM 14) 13. Кроме того, опухолевые клетки intravasation происходит только при TMEM и пространственно и временно коррелирует с проницаемостью сосудов 13. Одно разрешение клеток динамики этих событий стало возможным благодаря использованию расширенного покадровой многофотонной микроскопии флуоресцентно меченых клеток в опухоли микроокружения.
Межклеточных взаимодействий, которые происходят спонтанно в микроокружение опухоли может привести к изменениям в опухолевых клеток моторики и intravasation. Высокое разрешение прижизненной визуализации тканей живого опухоли позволяет визуализировать многоклеточных динамики , которые мо…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Министерством обороны груди Программа исследований рака под номером премии (ясень, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 и Программа комплексной обработки изображений.
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
1 x PBS | Life Technologies | ||
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
Oxygen | AirTech | ||
1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |