Correlatieve Licht en Electron Microscopy om te studeren Microgliale Interacties met β-amyloïde plaques
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren Ap amyloïde plaques in de ziekte van Alzheimer muismodellen behulp methoxy-X04, die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Hiermee pre-screening van plaque bevattende weefselcoupes voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Abstract
Een gedetailleerd protocol is hier voorzien om amyloïde Aß plaques in de hersenen secties identificeren van de ziekte van Alzheimer muismodellen voor pre-inbedding immunokleuring (specifiek voor geïoniseerd calcium bindend adapter molecule 1 (IBA1), een calcium-bindend eiwit door microglia uitgedrukt) en de verwerking van weefsel voor elektronenmicroscopie (EM). Methoxy-X04 is een fluorescente kleurstof die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Injectie van de dieren met methoxy-X04 voorafgaand aan het offeren en de hersenen fixatie laat pre-screening en selectie van de plaque met de hersenen secties voor verdere verwerking met tijdrovende manipulaties. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van vroege AD pathologie binnen specifieke hersengebieden of lagen die zeer weinig plaques, die aanwezig zijn in slechts een klein deel van de secties kan bevatten. Post-mortem verwerking van weefsel secties met Congo Red, Thioflavine S, en ThioflAvin T (of zelfs met methoxy-X04) kunnen labelen β-geplooide platen, maar vereist uitgebreide clearing met ethanol om overtollige verf te verwijderen en deze procedures niet verenigbaar zijn met ultrastructurele behoud. Ook zou het inefficiënt zijn om labeling uit te voeren voor Aß (en andere cellulaire merkers zoals IBA1) alle hersenplakjes van de gebieden van belang zijn, slechts een kleine fractie die Ap-plaques op de juiste plaats op te leveren. Belangrijk is Aß plaques zijn nog steeds zichtbaar na verwerking weefsel voor EM, waardoor een nauwkeurige identificatie van de gebieden (in het algemeen neer op een paar vierkante millimeters) te onderzoeken met de elektronenmicroscoop.
Introduction
Ap amyloïde plaquevorming is de voornaamste neuropathologische kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD). Maar meer gegevens suggereren belangrijke rol van het immuunsysteem bij ziekteprogressie 1,2. In het bijzonder, nieuwe gegevens van preklinische en klinische studies opgericht immuundisfunctie als een van de belangrijkste bestuurder en bijdrage aan AD pathologie. Met deze bevindingen, hebben de centrale en perifere immuuncellen als veelbelovende therapeutische doelen ontstaan voor AD 3. De volgende protocol combineert licht en elektronenmicroscopie (EM) tot nieuwe inzichten in de relatie tussen Aß plaque depositie en microglia fenotypische veranderingen in AD te genereren. Dit protocol maakt het mogelijk de etikettering van Ap-plaques in muismodellen van AD met behulp van in vivo injectie van de fluorescente kleurstof methoxy-X04. Methoxy-X04 is een Congo Red derivaat die gemakkelijk de bloed-hersenbarrière kan passeren naar de hersenen parenchym voeren en binden β-geplooide platen met een hogeffinity. Aangezien de kleurstof fluorescentie kan worden gebruikt voor in vivo detectie van Aß plaque depositie twee-foton microscopie 4. Eenmaal gebonden aan AB, is methoxy-X04 niet distantiëren of herdistribueren weg van plaques en behoudt hij zijn fluorescentie in de tijd. Algemeen wordt perifeer toegediend om voor niet-invasieve beeldvorming van de hersenen dynamiek 5. De fluorescentie blijft ook na aldehyde fixatie, waardoor correlatieve post-mortem analyses, met inbegrip van onderzoek van neuronale dood in de buurt van Ap-plaques 6.
Dit protocol maakt gebruik van de eigenschappen van methoxy-X04 naar de hersenen secties van APP SWE / PS1A 246e muizen te selecteren (APP-PS1; co-expressie van een dubbele mutatie op APP gen Lys670Asn / Met671Leu, en menselijke preseniline PS1-A264E variant) 7 dat AB vertonen plaques in specifieke gebieden van belang (hippocampus CA1, lagen radiatum en lacunosum-moleculare) Voorafgaand aan pre-inbedding immunokleuring tegen de microglia marker geïoniseerd-calcium bindend adapter molecule 1 (IBA1) de microglia cellichamen en processen met EM te visualiseren. De muizen krijgen intraperitoneale injectie van methoxy-X04 oplossing 24 uur vóór hersenen fixatie door middel transcardial perfusie. Coronale hersensecties worden verkregen met behulp van een vibratoom. Gedeelten met de hippocampus CA1 gescreend onder een fluorescentiemicroscoop op de aanwezigheid van Ap-plaques in strata radiatum en lacunosum-moleculare. Immunokleuring voor IBA1 worden osmiumtetroxide post-fixatie en kunststof hars inbedding vervolgens uitgevoerd op de geselecteerde hersenen secties. Aan het einde van dit protocol, kunnen de secties worden gearchiveerd zonder verdere ultrastructurele degradatie, klaar voor ultradunne snijden en ultrastructurele onderzoek. Belangrijk is, worden de plaques nog fluorescerende na immunokleuring met verschillende antilichamen, bijvoorbeeld IBA1 zoals in het onderhavige protocol. Ze worden donkerder than hun omgeving neuropil volgende osmiumtetroxide post-fixatie, onafhankelijk van methoxy-X04 kleuring, die helpt om de regio's van belang nauwkeurig te identificeren, over het algemeen tot een paar vierkante millimeter, worden onderzocht met de transmissie-elektronenmicroscoop.
Deze correlatieve aanpak biedt een efficiënte manier om specifieke hersengebieden paragrafen worden om na te gaan op het ultrastructurele niveau. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van vroege AD pathologie binnen bepaalde hersengebieden of lagen die slechts enkele Aß plaques aanwezig in slechts een klein deel van weefselsecties kunnen bevatten. Gedurende deze tijd bijzonder zou het inefficiënt zijn om immunokleuring voor Aß (en dubbele labeling voor andere cellulaire merkers zoals IBA1) gebruiken verschillende hersenplakjes alleen een kleine fractie die Ap-plaques op de juiste plaats op te leveren. Daarnaast injectie van levende muizen met methoxy-X04 voorafgaand aan het offeren en weefsel verwerking niet compromise de ultrastructurele behoud. Alternatieve werkwijzen zoals post-mortem kleuring met Congo Rood, Thioflavine S, Thioflavine T of methoxy-X04 op vaste weefselsecties vereisen kleuring differentiatie in ethanol, 8-11 die osmotische stress veroorzaakt en verstoort de ultrastructuur. Congo Rood is ook een bekend menselijk carcinogeen 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol legt een korrelerende aanpak voor het richten van dichte kern Ap-plaques met EM. Methoxy-X04 in vivo injectie maakt een snelle selectie van de hersenen secties die Ap-plaques in bepaalde gebieden en lagen van het belang van de hippocampus CA1, lagen radiatum en lacunosum-moleculare bevatten, bijvoorbeeld. In het onderhavige voorbeeld werd methoxy-X04 pre-screening gecombineerd met pre-inbedding immunokleuring voor IBA1 het onderzoeken hoe verschillende microgliale fenotypes interactie met synapsen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
