Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר הדמיה פלאק Aβ עמילואיד בעכברי מודל למחלת אלצהיימר באמצעות methoxy-X04, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. זה מאפשר הקרנת טרום סעיפים רקמה המכילה פלאק לפני immunostaining ועיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.
Abstract
פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לזהות פלאק Aβ עמילואיד חלקים במוח ממודלי עכבר מחלת אלצהיימר לפני immunostaining טרום הטבעה (במיוחד עבור מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן 1 (IBA1), חלבון מחייב סידן שהביע microglia) ועיבוד רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). Methoxy-X04 הוא צבע פלואורסצנטי כי חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. הזרקה של החיות עם methoxy-X04 שקדם להקרבת קיבעון במוח מאפשר הקרנת טרום וגיוס כוח החלקים במוח המכיל פלאק לעיבוד נוסף עם מניפולציות זמן רב. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל הפלאק מעט מאוד, נוכח רק חלק קטן של חלקים. עיבוד פוסט מורטם של סעיפים רקמה עם האדום קונגו, Thioflavin S, ו ThioflT יבין (או אפילו עם methoxy-X04) יכול לתייג יריעות β-קפלים, אבל דורשת סליקה נרחבת עם אתנול להסיר עודפי צבע והנהלים אלה אינם עולים בקנה אחד עם שימור ultrastructural. זה גם יהיה לא יעיל לבצע תיוג עבור Aβ (ו סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על כל החלקים במוח מן האזורים של עניין, רק כדי להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. חשוב לציין, הפלאק Aβ עדיין גלויים לאחר עיבוד רקמות עבור EM, המאפשר זיהוי מדויק של אזורים (בדרך כלל עד כמה מרובע מילימטרים) לבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים.
Introduction
היווצרות הפלאק עמילואיד Aβ היא סימן ההיכר נוירו העיקרי של מחלת אלצהיימר (AD). עם זאת ראיה נוספת להשערה מציעה תפקידים חשובים של המערכת החיסונית 1,2 התקדמות מחלה. בפרט, נתונים חדשים ממחקרים פרה-קליניים וקליניים הוקמו תפקוד לקוי חיסון כנהג ראשי תורם לפתולוגיה לספירה. עם ממצאים אלו, תאי מערכת חיסון מרכזיים והיקפיים צמחו מטרות טיפוליות מבטיחות ובאשר לספירה 3. הפרוטוקול הבא משלב מיקרוסקופ אור אלקטרונים (EM) כדי לייצר תובנה חדשות אודות הקשר בין בתצהיר פלאק Aβ לבין שינויי פנוטיפי microglial של מחלת אלצהיימר. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של הפלאק Aβ במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת vivo של צבע פלואורסצנטי-X04 methoxy. Methoxy-X04 הוא נגזרת האדום קונגו שיכולים בקלות לחצות את המחסום שבין הדם למוח להיכנס parenchyma המוח לאגד יריעות β-קפלים עם גבוהffinity. מאז לצבוע הוא פלורסנט, ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי in vivo של בתצהיר פלאק Aβ עם שני הפוטונים מיקרוסקופיה 4. לאחר כבול Aβ, methoxy-X04 לא לנתק או להפיץ מחדש הרחק הפלאק, והוא שומר הקרינה לאורך זמן. זה מנוהל בדרך כלל שולי כדי לאפשר הדמיה לא פולשנית של דינמיקת מוח 5. הקרינה גם נשארת הבאה קיבעון אלדהיד, המאפשר שלאחר מוות גומל מנתח, לרבות חקירת מותו העצבי באזור הפלאק Aβ 6.
פרוטוקול זה מנצל את המאפיינים של methoxy-X04 כדי לבחור חלקים במוח מעכברים APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpressing מוטציה כפולה הגן APP Lys670Asn / Met671Leu, וגרסא PS1-A264E presenilin האדם) 7 כי התערוכה Aβ הפלאק באזורים ספציפיים של עניין (ההיפוקמפוס CA1, radiatum שכבות, ו-moleculare lacunosumלפני) טרום הטבעת immunostaining נגד מולקולת מתאם מחייב סידן מיונן סמן microglial 1 (IBA1) לדמיין גופי תהליכים בתא microglial עם EM. העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של פתרון methoxy-X04, 24 שעות לפני קיבוע המוח דרך זלוף transcardial. חלקים במוח העטרה מתקבלים באמצעות vibratome. סעיפים המכילים את CA1 בהיפוקמפוס מוקרנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הנוכחות של פלאק Aβ ב radiatum שכבות-moleculare lacunosum. Immunostaining עבור IBA1, שלאחר קיבוע tetroxide אוסמיום, והטבעת שרף פלסטיק מבוצעים אז על החלקים במוח שנבחרו. בסוף פרוטוקול זה, ניתן לזהות קטעים לארכיון ללא השפלה ultrastructural נוספת, מוכן חתך ultrathin ובדיקה ultrastructural. חשוב לציין, את הפלאק עדיין הם פלורסנט לאחר immunostaining עם נוגדנים שונים, למשל IBA1 כמו בפרוטוקול הנוכחי. הם הופכים t כהההאן neuropil הסובבת אותם הבאה tetroxide אוסמיום קיבוע פוסט, ללא תלות מכתים methoxy-X04, אשר מסייע לזהות אזורים של עניין במדויק, למטה, בדרך כלל, כמה מילימטרים רבועים, להיבדק עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
גישה גומלת זו מציעה דרך יעילה לזהות חלקים במוח ספציפיים כדי לבחון ברמת ultrastructural. זה מועיל במיוחד כאשר לומדים פתולוגיה לספירה מוקדם, באיזורים מסויימים במוח או שכבות שעשויות להכיל רק כמה הפלאק Aβ, נוכח רק חלק קטן של קטעי רקמה. בזמנים אלה במיוחד, זה יהיה לא יעיל להשתמש immunostaining עבור Aβ (וסימון כפול עבור סמנים תאיים אחרים כגון IBA1) על חלקים במוח כמה פשוט להניב חלק קטן המכיל לוחות Aβ במיקום הנכון. בנוסף, הזרקה של עכברים חיים עם methoxy-X04 שקדמו להקרבה ועיבוד רקמה לא compromisדואר שימור ultrastructural. שיטות חלופיות כגון מכתים שלאחר מוות עם קונגו אדום, Thioflavin S, Thioflavin T או methoxy-X04 על סעיפי רקמות קבועים דורשות בידול מכתים באתנול, 8-11 אשר גורם ללחץ האוסמוטי ומשבש את ultrastructure. גם האדום קונגו הוא קרצינוגן אדם ידוע 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים אושרו ובוצעו לפי ההנחיות של ועדת האתיקה המוסדית בעלי החיים, בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים כמו מנוהל על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה לאוול. APP-PS1 עכברים זכרים בין 4 ל 21 חודשים של גיל היו בשימוש. חיות אלה שוכנו תחת מחזור אור כהה 12 שעות ב 22 - 25 ° C עם גישה חופשית למזון ומים.
1. הכנת פתרון methoxy-X04
- הכן פתרון 5 מ"ג / מ"ל של methoxy-X04 9 על ידי המסת methoxy-X04 לתוך תמיסה המכילה sulfoxide דימתיל 10% (DMSO), 45% פרופילן גליקול, ואת בופר פוספט נתרן 45% (0.9% NaCl חיץ פוספט 100 מ"מ , pH 7.4).
- באמצעות microbalance, שוקל 5 מ"ג של המתחם methoxy-X04. מתחת למכסה המנוע קטר, לפזר את methoxy-X04 ב DMSO ומערבבים עד פתרון ירקרק ברור מתקבל. ברציפות להוסיף פרופילן גליקול ו phosphate חיץ מלוח תוך ערבוב עם כל תוספת.
- מערבבים את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס על הכתף O / N. השג תחליב ירוק צהבהב. הפתרון עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשים ללא שפלה.
2. הזרקת פתרון methoxy-X04
- hr 24 לפני זלוף, לשקול את העכברים ולתת כל עכבר זריקה intraperitoneal של methoxy-X04 במינון של 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף באמצעות מחט 27 ½ G.
3. Transcardial זלוף של עכברים שהוזרק
- ביום שלפני זלוף, להכין כרכים מתאימים של בופר פוספט (PBS), 3.5% acrolein, ו -4% paraformaldehyde (PFA) פתרונות 13 ולאחסן אותם ב 4 ° CO / N.
הערה: פתרונות אלה ישמשו הן זלוף טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה. זהירות כאשר עובד עם acrolein, כפי שהוא מאכל רעיל לשניחוקרים ואיכות הסביבה. בנוסף, מאז acrolein הוא מאכל כדי פלסטיק, תמיד להשתמש זכוכית מתאימה כדי להכין פתרונות acrolein. - ביום זלוף, לסנן את PFA ו acrolein באמצעות נייר סינון גס של כושר סינון 25 מיקרומטר.
- במהלך זלוף, השתמש משאבה peristaltic לספק 15 מ"ל של PBS, 75 מ"ל של acrolein, ו -150 מ"ל של PFA ברציפות לתוך מחזור העכבר, בקצב זרימה של 25 מ"ל / דקה.
היזהר. בצע זלוף בקפדנות בתוך במנדף להימנע אדים מזיקים של PFA ו acrolein.- כדי להגדיר את המשאבה, כנס קצה אחד אל פתרון PBS, למלא את הצינורות (מחזיקים כ 15 מיליליטר) עם PBS, ולתקן מחט איסוף דם מכונפת 25 G לצד השני. בכל פעילויות שלנו, להבטיח כי הצינורות הנם נקיים מכל בועות אוויר שנלכדו.
- מניח את הצינור ישירות בבקבוק acrolein לאחר הגדרת המשאבה זלוף עם הצינורות מלאים PBS.
- aesthetize עכבר אחד בכל פעם עם 90 מ"ג / ק"ג של מנה משקל הגוף של נתרן pentobarbital מוזרק intraperitoneally באמצעות מחט 27 ½ G. להעריך תגובות צובטות זנב / בוהן. המשך רק אם העכבר אינו מגיב לגירויים מרתיעים, כה כואבים.
- אבטח את העכבר במצב שכיבה (שוכב על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי הקשה על הרגליים הקדמיות ואת hindpaws אל משטח העבודה ובזהירות לחשוף את הלב מבלי לגרום נזק לאיברים אחרים. הקפד לעבוד מהר לאחר ניקוב הסרעפת.
- בצע חתך דרך העור עם מספרי כירורגיות לאורך קו האמצע החזי החל זנב החזה והמשך מקורה עצם הבריח.
- לעשות שני חתכים לרוחב נוספים לאורך הבסיס של בית חזה הגחון. בעדינות להזיז ואת סיכת שני קפלי עור, והקפד לחשוף את חלל בית החזה כולו.
- החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים בוטים לחשוף את חלל בית החזה לייצב את המספריים המחודדיםים. חותך דרך הסרעפת ואת בית החזה, נזהר למנוע ניקוב הריאות, ולהמשיך את מקורי חתך הבריח. הקפד לעבוד מהר לאחר ניקוב הסרעפת.
- בעדינות לקרוע את צק קרום הלב עם מלקחיים בוטים. החזק את הלב יציב עם מלקחיים בוטים, לחתוך את אטריום ימין, ולהתחיל העירוי של PBS. מיד להכניס את המחט דם אוסף לתוך החדר השמאלי.
- Perfuse את העכבר עם PBS (בצינור) ואחריו Acrolein במשך 3 דקות (המקביל ל 75 מ"ל) ולאחר מכן לעבור PFA עבור 6 דקות (המקביל ל -150 מ"ל). הקפד להשהות את זרימת המשאבה לפני מעבר פתרון כדי למנוע בועות מלהיכנס הצינור.
- לערוף את העכבר ולחלץ המוח הקבוע, ולמקם אותו ישירות לתוך בקבוקון זכוכית המכיל 4% PFA במשך שעה לפחות 2 ב 4 ° C.
- כדי לחלץ את המוח, להשתמש מספריים פינצטה לחתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת. בזהירות לשבור את אופ הגולגולתen שבין העיניים, ואת השבב מעל חתיכות קטנות של אותו לחשוף המוח הבסיסי.
- מוציאים בזהירות את התיקון המוח ופוסט חשף אותה עם 4% PFA עבור שעה 2 נוסף לפני שתמשיך עבור חתך vibratome.
4. המוח חתך באמצעות vibratome
- שטוף את המוח 3 פעמים הקבועות עם PBS הקר. באמצעות סכין גילוח חד, להסיר את נורת חוש הריח (אלא אם האזור הזה נמצא תחת חקירה) וחותך את המוח transversally לתוך 2 - 3 חתיכות של גובה שווה כ, כל מה שיכול להיות מחולקת זמנית כדי להאיץ את התהליך.
- מדביק את פיסות רקמת המוח אנכית לצלחת הדגימה המאובטחת למגש. ודא כי המשטח לחתוך חלק בתקיפות מקלות צלחת הדגימה אינו מקבל וחלץ במהלך הליך החתך. הוסף מספיק פתרון PBS לתוך המגש עד משטח המוח כולו שקוע לחלוטין. חשוב לשמור על החתיכות מוח דואר וחתכים לאחר שקועות לגמרי PBS ברחבי שלב זה.
- מניחים את המגש vibratome, להתאים את מהירות חתך 0.5 מ"מ / sec, תדירות חתך עד 90 הרץ, ואת עובי להאכיל 50 מיקרומטר כדי להניב 50 מיקרומטר חלקים עבים. ואז להעביר את חלקים לתוך צלוחיות זכוכית 20 מ"ל המכיל פתרון cryoprotectant (40% PBS, 30% אתילן גליקול, ו -30% גליצרול) באמצעות מכחול בסדר. אחסן את הבקבוקונים ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. לחלופין, לשמור את הסעיפים PBS להקרנה מיידית כמתואר בשלבים הבאים.
הקרנת סעיף 5. עבור נוכחות של הפלאק מוכתם methoxy-X04
- בעזרת מוח עכבר stereotaxic אטלס 14, חלקים במוח בחרו המכילים את האזור של עניין, למשל, בהיפוקמפוס CA1 כפי שמוצג בדוגמא הנוכחית. מניחים כל חלק לתוך באר בתוך צלחת תרבות 24 גם המכיל פתרון מספיק cryoprotectantכדי למנוע את הסעיפים מהתייבשות.
- לבחון כל קטע ברציפות, כדי למנוע התייבשות החלקים, באמצעות ההליך הבא:
- להוסיף טיפה של PBS לשקופית מיקרוסקופ עם טפטפת הפנויה, ומניחים את החלק על אגל.
- בדוק את הסעיף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזהות אזורים המכילים פלאק Aβ שכותרתו methoxy-X04.
הערה: methoxy-X04 ניתן מדמיין בקלות באמצעות אולטרה סגול קרינה (UV) מסנן (עירור 340 - 380 ננומטר).
- צלם תמונות של אזורים של עניין (ROI) בתחום בהיר כמו גם במצב קרינה מבלי להזיז את במת מיקרוסקופ, שכן כל תמונה חייבת להראות באותו האזור בשני התחומים על מנת לתאם את נוכחותם של הפלאק ישירות לאזור המבני של סעיף הרקמה.
- שמור שם את התמונות שצולמו על פי מספר בעלי החיים. כמו כן לרשום את המספר היטב את הצלחת בתחום התמונות ת"אקן. לדוגמה, אקס: 9978A1B; מספר בעלי חיים: 9978; ובכן מספר: A1; שדה: מואר. מניחים את החלק האחורי ב המיועד שלה גם לאחר השלמת הדמיה.
הערה: בסופו של דבר, עבור כל מקטע בחן, שתי תמונות מתקבלים, אחד בתחום בהיר אחר בתחום UV. - פתח את שתי תמונות של אותו ROI (אחד בתחום בהיר והשני בתחום UV) ב J תמונה, ושימוש תוסף MosaicJ, יישר את הקצוות של שתי תמונות ולשמור את התמונה בציר בשילוב לפי מספר טוב זה הגיע מ.
- שמור את התמונה בתיקייה נפרדת עם מספר של חיה מסוימת. מערבב את התמונות לזהות למקם את הפלאק קטע הרקמה, ויש לי את כל המידע לגבי הקטע השלם בשני התחומים השונים (הבהיר UV).
- לאחר תהליך המיון הושלם, לאחסן את הסעיפים שנבדקו ב -20 ° C בצלחת תרבות 24 גם המכילה cryoprotectant עד immunostaining או עיבוד נוסף הוא carried החוצה.
6. טרום הטבעת Immunostaining עבור IBA1
הערה: בצע את immunostaining עבור IBA1 על סעיפים בחופשיות-צפה שנבחרו על ידי נחת הצלחת על כיסא נדנדה נעה באיטיות ב RT.
- ביסודיות לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם כ 1 מ"ל PBS, לשטוף כל שנמשך 10 דקות.
- להרוות peroxidases אנדוגני עם מי חמצן 0.3% בפתרון PBS במשך 10 דקות. פעולה זו מונעת פעילות peroxidase הלא ספציפית, וזה חשוב כדי למנוע מכתים רקע.
- שטפו את הרקמה PBS 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
- דגירת מקטעי borohydride נתרן 0.1% בפתרון PBS למשך 30 דקות. שלב זה חשוב כדי להפחית אלדהידים הנותרים משלב הקיבעון, והיא חשובה במיוחד אם acrolein משמש קיבעון רקמות.
- שטפו את הרקמה 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בכל פעם ולוודא כדי להסיר את כל הבועות.
- חסום את הסעיפים 1 שעה.נוגדנים שונים עשויים לדרוש פעמים ופתרונות חסימה שונות. לקבלת IBA1, להכין חיץ חסימת המכילה סרום שור 10% עוברית, 3% בסרום שור אלבומין, ו 0.01% Triton X-100 ב 50 מ"מ טריס שנאגרו מלוחים (TBS; pH 7.4).
הערה: צעד החסימה הוא למנוע ספציפי המחייב של הנוגדן הראשוני. הריכוז הנמוך של טריטון X-100 מאפשר permeabilization הקל של ממברנות מכתים טוב יותר, והוא נמוך מספיק כדי לשמר רוב תכונות ultrastructural של רקמה תחת EM. - הסר את חוצץ החסימה מן הרקמה, הדגירה בתמיסת נוגדן ראשונית (ארנב נגד IBA1, בדילול [1: 1,000] חיץ חסימה) ב 4 ° CO / N.
- לשטוף ב TBS 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
- מדגירים את נוגדנים משני (מצומדות נגד ארנב עז כדי ביוטין) [1: 200] ב 0.05 M TBS למשך 90 דקות.
- לשטוף ב TBS 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
- מדגירים את פתרון מורכב avidin-ביוטין (avidin [1: 100], ביוטין [1: 100]) ב TBSפתרון עבור שעה 1.
- לשטוף ב TBS 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
- לחשוף את מכתים IBA1 עם 0.05% diaminobenzidine (DAB) ו 0.015 מי חמצן% ב TBS במשך 8 דקות.
הערה: התזמון של פיתוח DAB עשוי להשתנות מן פרוטוקול הפרוטוקול צריך להיקבע במהירות על ידי בחינת החלקים מוכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: IBA1, אחד צריך להיות מסוגל לדמיין את גופי התא בבירור ותהליכים של שריר כלשהו מוכתם IBA1 ב 20X (ראה איור 2 למשל נציג). היה זהיר באמצעות DAB, כפי שהוא מסרטן ידוע. - הימנע יתר לפתח בקפידה על ידי ניטור חלקים (כמתואר לעיל) במהלך שלב זה. עצור את התגובה על ידי שטיפת הפרקים, PB המצונן 5 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם.
עיבוד 7. אלקטרונים מיקרוסקופים
- כן פתרון אוסמיום tetroxide 1% PBS ב בקבוקון זכוכית. tetroxide אוסמיום הוא רגיש; לכסות את gבקבוקון ילדה עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על הפתרון מן האור.
היה זהיר באמצעות tetroxide אוסמיום, כפי שהוא כימיקל מסוכן מאוד. בצע זה ואת הצעדים הבאים בתוך במנדף. - הסר את PBS מן הסעיפים ומשטח אותם באמצעות מכחול בסדר. ביצועים טובים שלך צעד אחד בכל פעם, כדי לשמור על סעיפים מהתייבשות. הקפד לשטח את הסעיפים מייד לפני הוספת tetroxide אוסמיום, כמו קפלים כל בסעיפים יהפכו קבועים ומנסה לשטח קיבעון אוסמיום פוסט רקמה תהיה רק לשבור את הסעיפים.
- לטבול את הסעיפים tetroxide אוסמיום למשך 30 דקות ב RT, הוספת טיפה אחת של tetroxide אוסמיום בכל פעם עם טפטפת העברה, כדי למנוע קטעים מתוך קיפול. מכסים את היטב בנייר אלומיניום כדי להגן על חלקים מן האור.
הערה: צעד זה פותר את השומנים בתוך הסעיפים. הרקמה תופיע כהה מאוד לאחר קיבוע פוסט אוסמיום. - בעוד חלקים נמצאים אוסמיום טטרוxide, להכין שרף פלסטיק בכוס חד פעמי על ידי ערבוב רכיב 20 גרם, 20 גרם רכיב B, C רכיב 0.6 גרם, ו -0.4 מרכיב g ד מערבבים את המרכיבים יחד לפי הסדר האמור ומערבבים אותם היטב בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל עד צבע אחיד מתקבל.
- מעבירים את התערובת מוכנה מנות במשקל אלומיניום. הם יקבלו את קטעי הרקמה ברגע שהם כבר מיובשים.
- מייבש את סעיפי ריכוז גדל והולך של אתנול למשך 2 דקות לפי הסדר הבא: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- כדי להסיר אתנול שיורית, לטבול את הסעיפים פרופילן אוקסיד 3 פעמים במשך 2 דקות בכל פעם. הסר את החתכים המיובשים מהצלחת התרבות 24 גם לתוך צלוחיות זכוכית 20 מיליליטר. השתמש תמיד צלוחיות זכוכית כשעובדים עם פרופילן אוקסיד כפי שהוא מתמוסס פלסטיק, לשמור על זהירות, כפי שהוא מסוכן.
- השתמש קצה פיפטה זכוכית מכופף או מכחול עדין להעביר את הקטעים מתוך soluti פרופילן אוקסידעל לתוך השרף ולהשאיר O / N חדירה ב RT. היזהר שלא לדלל את השרף עם פרופילן אוקסיד.
- שבץ קטע עם שרף על פולי-כלורו-תלת-fluoro-אתילן (PCTFE) filmsheets:
- מניח את הכלים במשקל האלומיניום המכילים דגימות לתוך 50 - תנור C 60 מעלות במשך 10 - 15 דקות לפני הטבעת מדורי filmsheets PCTFE.
- כאשר הטבעה חלקה, לעבוד עם אלומיניום אחד במשקל מנה בכל פעם. באמצעות מכחול בסדר, לצייר שכבה דקה של שרף על-גבי גיליון הסרט PCTFE אחד.
- עבר קטע רקמה אחת בכל פעם מן האלומיניום במשקל תבשיל כדי גיליון סרט PCTFE. הסר שרף עודף סביב הרקמה, נזהר שלא לגעת בה.
- לאחר המעבר כל החלקים מאחד במשקל התבשיל כדי גיליון הסרט PCTFE, הנח גיליון PCTFE השני על הראשון, יצירת כריך של רקמות שרף בין 2 גליונות.
- לפלמר שרף באינקובטור במשך 3 ימים ב 55 - 60 ° C.
- החומר מוכן כעת חתך ultrathin ובדיקת ultrastructural, טכניקות מיוחדות אשר מבוצעות בדרך כלל על ידי מתקני גרעין EM. אחסן את הדגימות בין סדיני סרט PCTFE בבטחה ב RT ללא שפלת ultrastructural.
הערה: השלבים הבאים עבור ultrathin חתך בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת מוסברים בפרוטוקול נפרד 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה ממחיש את התוצאות ניתן לקבל שלבים קריטיים שונים של הפרוטוקול. בפרט התוצאות מראות דוגמאות של חלקים במוח המכיל methoxy-X04 הפלאק מוכתמים באזור מסוים ושכבות של עניין: CA1 בהיפוקמפוס, רבדים radiatum, ו lacunosum-moleculare. הפלאק ואת ארגון אזורי / שבשבת של ההיפוקמפוס הם דמיינו ברציפות באמצעות שילוב של UV ומסנן שדה בהיר (איור 1). סעיפי המוח שנבחרו לאחר מכן הם immunostained ומעובד EM תוך שמירה על מסלול של הפלאק Aβ שלהם, בהתחשב כי הם עדיין פלורסנט immunostaining הבא, ולהיות כהה יותר neuropil שמסביב לאחר טיפול עם tetroxide אוסמיום והטבעה (איור 1). זה מאפשר לזהות את התחומים (בדרך כלל כמה מילימטרים בריבוע) לבחון עם מיקרוסקופ אלקטרונים המבוססים על location הפלאק. יתר על כן, פרוטוקול משופר עבור immunostaining טרום הטבעה של microglia עם IBA1 מתואר כאן. פרוטוקול זה מניב להדמיה חריגה של גופי תא microglial, תהליכים גדולים וקטנים (איור 2), כמו גם חדירה של הנוגדנים בתוך החלקים במוח. זה כן מקילה על ההזדהות של גופי התא microglial ותהליכים ברמה ultrastructural, ואת המחקר של האינטראקציות שלהם עם פלאק Aβ (איורים 3 ו -4).
איור 1. ויזואליזציה של Aβ הפלאק 21 בן חודש עכברים APP-PS1 באמצעות אור מיקרוסקופית, בעקבות הזרקת מערכתית של methoxy-X04 צבע פלואורסצנטי. א.ב.) הדמיה Dual סעיף אחד בהיפוקמפוס באמצעות מצבי שדה הקרינה בהיר. האזורים והשכבות של עניין הם דמיינו תחת שדה בהיר(א), ואת לוחות Aβ מקומי ברציפות באמצעות מסנן UV בטווח של 340 - 380 ננומטר (B). CD) הדמיה כפולה של קטע נוסף בהיפוקמפוס לפני (ג) ואחרי (ד ') מראש הטבעה immunostaining עבור IBA1, ואחריו-קיבעון הדואר tetroxide אוסמיום, התייבשות באתנול, והטבעה בתוך שרף פלסטיק כנדרש עבור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. כדי לציין, את השלט (מוקף בקו מקווקו) עדיין גלוי על עיבוד רקמות עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. לדמיין את הפלאק כאשר זמירה אבן הרקמות מאפשר בחירה מדויקת של האזורים לתמונה ברזולוציה מרחבית גבוהה. ברי סולם = 300 מיקרומטר עבור A ו- B, 150 מיקרומטר עבור C ו- D אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Vi sualization של גוף תא microglial ותהליכים יפים עכברי APP-PS1 21 בן חודש על ידי IBA1 מכתים ברמה המיקרוסקופית האור. א.ב.) דוגמאות של microglia IBA1 מוכתם מראה חלוקה התקבצו כאשר הם מקשרים עם פלאק Aβ (מזוהה על ידי דימות פלואורסצנטי גומל של methoxy-X04; מוקף בקו מקווקו) כפי שנצפה לפני tetroxide אוסמיום שלאחר קיבוע והטבעה פלסטיק שרף. CD) דוגמאות של microglia IBA1 מוכתם הקשורים פלאק Aβ לאחר tetroxide אוסמיום קיבוע פוסט והטבעה שרף פלסטיק. ראוי לציין, כי הפלאק להיות כהה יותר neuropil שלהם שמסביב הבאים אוסמיום שלאחר קיבוע, ובכך מאפשר מעקב במיקומם. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
060 / 54060fig3.jpg "/>
ויזואליזציה איור 3. Dual הפלאק Aβ ו IBA1-immunostaining עכברים APP-PS1 6 חודשים הישן ברמת ultrastructural. א) דוגמה של לוחית Aβ ליבה צפופה מוכר על ידי מבנה fibrillary הקומפקטי שלה (ראה הבלעה) והקשר עם neurites דיסטרופי עם תכונות ultrastructural של autophagy. ב) דוגמא של תהליך microglial מוכתם IBA1 (מ '; בצבע סגול) נמצא בסמוך פלאק Aβ המכיל פיקדונות עמילואיד. שינויים מיטוכונדריאלי (שמוצג על ידי כוכביות) ניתן לראות גם בתוך תהליך microglial. כדי לציין, התמונה הזאת נרכשה בגבול-שרף רקמות (הלבן, בקצה הימני של התמונה) שבו החדירה של נוגדנים ועוצמים מכתים היא מקסימלית. ברי סולם = 2 מיקרומטר עבור A, 1 מיקרומטר עבור B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
: לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 4. דוגמאות נוספות Microglia IBA1-immunostained ב 6 חודשים ישני עכברי APP-PS1 כפי שנצפה עם הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים. לספירה) דוגמאות של גוף תא microglial מוכתם IBA1 ותהליכים (מ ') רכש רחוקה מגבול רקמות-שרף , מראה חדירה מעולה של נוגדנים מכתים עוצמת עמוק בתוך הקטע שימוש בפרוטוקול זה. bv = כלי דם, ד = דנדריט, ב = הכללה, s = עמוד השדרה הדנדריטים, t = מסוף האקסון. ראשי חץ להראות בתרי הסינפטי. ברי סולם = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מסביר גישה המצטרפת למיקוד פלאק Aβ ליבה צפופה עם EM. Methoxy-X04 הזרקת vivo מאפשרת בחירה מהירה של חלקים במוח המכילים פלאק Aβ בתוך אזורים מסוימים ושכבות של עניין, למשל CA1 בהיפוקמפוס, radiatum שכבות, ו lacunosum-moleculare. בדוגמה הנוכחית, methoxy-X04-הקרנת טרום אוחד עם טרום הטבעה immunostaining עבור IBA1 ללמוד כיצד שונה פנוטיפים microglial אינטראקציה עם סינפסות ברמה ultrastructural בנוכחות פלאק Aβ ליבה צפופה.
Microglia הם מאוד קשובים לסביבתם ופעילות דלקתית שלהם כבר זמן רב למד בהקשר של ערעור לתפקוד תקין של המוח ושיפור לקידום לספירה. בפרט, תאים אלה היו מעורבים בתהליכי ניוון עצביים בשל הפעלת הרחבת השחרור שלהם של ציטוקינים פרו-דלקתיים, שמובילים CHRneuroinflammation onic, והפרעת המוח הנורמלי הומאוסטזיס 15. בשנים האחרונות, עם זאת, תאים חיסוניים התושב אלה הוצגו גם לשפץ מעגלים עצביים פעיל במוח הבריא, מה שמוביל זיהוי של מנגנונים פתוגניים חדשים 16,17. התפקידים הפיסיולוגיים שלהם ב סינפסות עלולים להפוך dysregulated במהלך neuroinflammation לספירה, ותוצאה הוא אובדן הסינפטי מחריף, כיום שמקבילת פתולוגי למיטב ירידה קוגניטיבית על פני תנאים ניווניות שונים 18,19.
את השינויים שבוצעו בשיטה המכתימה הקודמת טרום הטבעת IBA1 13 כעת לאפשר חדירה טובה יותר של נוגדנים על פני החלקים במוח, כמו גם הדמיה של גופי תא microglial ותהליכים בסדר ברמת ultrastructural. בסך הכל, את הפרוטוקול צריך להתבצע בקפדנות מן זלוף עכבר עד הטבעת שרף הפלסטיק של סעיפי הרקמות, בהתחשב בכך שפלת ultrastructuralהמתרחשים בשלב כלשהו-בין יכול להתפשר על שלמות קרום התא, אברונים, אלמנטים cytoskeletal, וכו.
פרוטוקול זה יכול להתבצע ללא כל immunostaining (על ידי השמטת סעיף 6) כדי לחזות לוחות Aβ ליבה צפופה בלעדי, אבל הוא גם מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנונים המורכבים של בפתוגנזה לספירה ביחס בתצהיר Aβ, כמו נוגדנים שונים עשויים לשמש להתמקד תאים מסוגים שונים, כוללים מקרופאגים שולי נגזרות, microglia אנדוגני, האסטרוציטים, oligodendrocytes ואת האבות שלהם, כמו גם תת עצביים רבים.
בהתחשב זריקת in vivo של methoxy-X04, פרוטוקול זה לא יכול להתבצע על חלקים במוח קבועים, אשר מונע את השימוש שלה עם דגימות מוח האנושי שלאחר מוות. כמו כן, לעומת זאת כדי immunostaining נגד Aβ אשר תוויות צורות מסיסים ובלתי מסיסים של Aβ, את השימוש של צבעים מחייב בטא קפלים sheet מבנים חלבוניים כגון methoxy-X04 רק מאפשר הדמיה של הפלאק ליבה צפופה, המהווה הגבלה אחרת.
אף על פי כן, יישומים חשובים יכולים לכלול לומדים את התפקידים של המיקרוגליה סוגי תאים שונים, אשר חופפים להגדיל את פעילותם, וככאלה הם עלולים להיות השפעות ישירות על הומאוסטזיס רובד תפקוד עצבי במהלך פתולוגיה לספירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
