Summary
この記事では、メトキシX04、血液脳関門を通過し、選択的にβ-プリーツする高密度コアAβ斑に見られるシートを結合し使用して、アルツハイマー病のマウスモデルにおいてアミロイドAβプラークを可視化するためのプロトコルについて説明します。これは、電子顕微鏡用の免疫染色および処理の前にプラークを含む組織切片の事前スクリーニングを可能にします。
Abstract
詳細なプロトコールは、前にアルツハイマー病のマウスモデルから脳切片におけるアミロイドAβプラークを識別するために、ここで提供される事前埋め込む免疫染色をし、組織処理のために（具体的には、イオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1）、ミクログリアによって発現されるカルシウム結合タンパク質について）電子顕微鏡（EM）。メトキシX04は、血液脳関門を通過し、選択的にβ-プリーツする高密度コアAβ斑に見られるシートを結合する蛍光色素です。メトキシX04を有する動物の注射前屠殺し、脳を固定が事前スクリーニングおよび時間のかかる操作で、さらなる処理のためにプラークを含有する脳切片の選択を可能にします。セクションのごく一部のみに存在する非常に少数のプラークを含有することができる特定の脳領域または層内の早期AD病理を研究するときに特に便利です。コンゴーレッド、チオフラビンS、およびThiofl有する組織切片の死後処理AVIN（あるいはメトキシ-X04との）Tはβプリーツシートにラベルを付けますが、過剰な染料を除去するためにエタノールとの広範な決済を必要とし、これらの手順は、超微細構造の保存と互換性がないことができます。また、唯一の右の場所でAβ斑を含むごく一部を得るために、関心領域からすべての脳切片上で、Aβのためのラベリング（およびそのようなIBA1などの他の細胞マーカー）を実行するのは非効率的であろう。重要なことは、Aβ斑は、電子顕微鏡で検査すること（一般的にダウンして数平方ミリメートル）の領域の正確な同定を可能にする、EMのための組織処理後も表示されます。
Introduction
アミロイドAβプラークの形成は、アルツハイマー病（AD）の主要な神経病理学的特徴です。しかし、増加する証拠は、疾患の進行の1,2における免疫系の重要な役割を示唆しています。具体的には、前臨床および臨床研究からの新しいデータは、AD病理にメインドライバや寄稿などの免疫不全を確立しました。これらの知見により、中枢および末梢免疫細胞は、AD 3のための有望な治療標的を浮上しています。以下のプロトコルは、Aβプラーク沈着およびADにおけるミクログリアの表現型の変化との関係に新たな洞察を生成するために、光と電子顕微鏡（EM）を組み合わせました。このプロトコルは、蛍光色素メトキシX04の生体内注入に使用して、ADのマウスモデルにおけるAβプラークの標識化を可能にします。メトキシX04は簡単に脳実質に入り、高いAとβプリーツシートを結合するために、血液脳関門を通過することができますコンゴーレッド誘導体でありますffinity。色素は蛍光性であるので、二光子顕微鏡4でAβプラーク沈着のin vivo検出のために使用することができます。一度Aβに結合した、メトキシX04は、解離またはプラークから離れて再配布、それは時間をかけて、その蛍光を保持しません。一般に脳ダイナミクス5の非侵襲的イメージングを可能にするために末梢投与されます。蛍光はまた、Aβ斑6の近傍におけるニューロン死の調査を含む、相関死後分析を可能にする、アルデヒド固定を以下のまま。
Aβを示す7;（APP遺伝子Lys670Asn / Met671Leuで二重変異を共発現し、ヒトプレセニリンPS1-A264E変異APP-PS1）このプロトコルは、APP SWE / PS1A 246eをマウスからの脳切片を選択するために、メトキシX04の性質を利用しています関心の特定の領域（海馬CA1、地層radiatum、およびlacunosum-moleculareでプラーク）ミクログリア細胞体とEMとのプロセスを可視化するために）ミクログリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1に対する免疫染色を埋め込み事前に先立っ。マウスをtranscardial灌流を介して前脳を固定しメトキシX04溶液の腹腔内注射、24時間を与えられています。冠状脳切片をビブラトームを用いて得られます。海馬CA1を含むセクションでは、地層radiatumとlacunosum-moleculareにおけるAβ斑の存在を蛍光顕微鏡下でスクリーニングされます。 IBA1の免疫染色、四酸化オスミウム後固定し、プラスチック樹脂の埋め込みは、選択された脳切片上で実行されます。このプロトコルの終わりには、セクションでは、超薄切片と超微細構造検査のために準備ができて、さらに超微細構造劣化なしにアーカイブすることができます。重要なことは、プラークがまだ存在プロトコルのようにインスタンスIBA1のために、異なる抗体で免疫染色した後に蛍光性です。彼らはトン暗くなりますハン四酸化オスミウム後固定後、その周囲の神経網は、独立して正確に、数平方ミリメートルの概して下、関心領域を識別するのに役立つメトキシX04染色の透過型電子顕微鏡で観察することができます。
この相関アプローチは、超微細構造レベルで検討するために、特定の脳切片を識別するための効率的な方法を提供しています。早期AD病理を研究する場合にのみ、組織切片のごく一部のみに存在するいくつかのAβ斑を含むことができる特定の脳領域または層内に、特に有用です。特に、これらの時間の間に、単に右の場所でAβ斑を含むごく一部を得るために、いくつかの脳切片上で（例えばIBA1などの他の細胞マーカーおよび二重標識）Aβのための免疫染色を使用するのは非効率的であろう。また、メトキシX04と生きたマウスの注射屠殺前と組織処理はないコンプロミを行います超微細構造の保存を電子。このような固定された組織切片上のコンゴーレッド、チオフラビンS、チオフラビンTまたはメトキシX04と、死後染色などの代替の方法は、浸透圧ストレスの原因となり、超微細構造を破壊エタノール、8-11で染色分化を必要とします。コンゴーレッドはまた、既知のヒト発がん性物質12です。
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Protocol
注意：大学ラバルの動物管理委員会により投与として全ての実験は承認され、動物ケアガイドラインにカナダの理事会に合わせて、制度の動物倫理委員会のガイドラインの下で行いました。生後4及び21ヶ月の間にAPP-PS1雄マウスを使用しました。食料と水に自由にアクセスさせて25°C - これらの動物は、22で12時間の明暗サイクル下で飼育しました。
1.メトキシX04溶液の調製
- 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、45％プロピレングリコール、45％リン酸ナトリウム緩衝液（100 mMリン酸緩衝液中の0.9％NaClを含む溶液にメトキシX04を溶解しメトキシX04 9を5mg / mlの溶液を調製します、pH7.4中）。
- 微量天秤を用いて、メトキシX04化合物5mgを秤量します。ヒュームフードの下では、DMSO中のメトキシX04を溶解し、透明な緑がかった溶液が得られるまで撹拌します。続いて、プロピレングリコール及びpHを追加各添加して攪拌しながら生理食塩水をバッファosphate。
- 回転子のO / N上で、4℃で溶液を攪拌します。黄緑色エマルジョンを得ます。溶液は、分解することなく最大2ヶ月間4℃で保存することができます。
2.メトキシX04液注入
- 灌流の前に24時間で、マウスを秤量し、27半G針を使用して、体重の10mg / kgの用量で各マウスをメトキシX04の腹腔内注射を与えます。
注射したマウスの3 Transcardial灌流
- 灌流前日に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、3.5％のアクロレイン、および4％パラホルムアルデヒド（PFA）ソリューション13の適切なボリュームを準備し、4°CO / Nでそれらを格納します。
注：これらの溶液は、灌流およびプレ埋め込み免疫組織化学の両方のために使用されます。アクロレインで作業する場合、それは腐食性との両方に対して毒性であるように、特別な注意を払ってください研究者や環境。アクロレインは、プラスチックに対して腐食性であるため、また、常にアクロレイン溶液を調製するために、適切なガラス器具を使用しています。 - 灌流の日に、25ミクロンの粒子保持の粗い濾紙を使用して、PFAとアクロレインをフィルタリングします。
- 灌流中に25 ml /分の流速で、マウスの循環に順次PBS 15mlを、アクロレイン75mlの、及びPFA 150mlのを送達するために蠕動ポンプを使用します。
十分注意してください。 PFAおよびアクロレインの有害な煙を避けるために、厳密にヒュームフード内部の灌流を行います。- 、ポンプを設定するPBS溶液に一端を挿入し、PBSでチューブ（約15ミリリットルを保持）を記入し、もう一方の端に25 G翼付採血針を修正します。すべての回で、チューブが閉じ込められた気泡がないことを確認してください。
- PBSで満たされたチューブと灌流ポンプを設定した後、アクロレインボトルに直接チューブを置きます。
- アン腹腔27半G針を用いて注入ペントバルビタールナトリウムの体重の用量の90 mgの/ kgの時に一つのマウスaesthetize。テール/つま先ピンチへの応答を評価します。マウスは、このような嫌悪、痛みを伴う刺激に応答しない場合にのみ進んでください。
- 作業面に前足と後足をテーピングすることによって（上向きの顔と背中の上に横たわる）仰臥位でマウスを確保し、慎重に他の臓器に損傷を与えることなく、心臓を露出。ダイアフラムを穿刺した後、迅速に作業してください。
- 胸郭に尾を開始胸部正中線に沿って手術用ハサミで皮膚を通して切開を行い、鎖骨に吻側を進みます。
- 腹側胸郭のベースに沿って二つの追加の横方向の切開を行います。ゆっくり移動し、全体の胸腔を公開することを確認すること、皮膚の2つのフラップを固定します。
- 胸腔を露出するように鈍鉗子で剣状突起を持ち、尖ったハサミを安定秒。 、横隔膜と胸郭を切って肺を刺さないように注意して、および鎖骨に切開吻側を続けます。ダイアフラムを穿刺した後、迅速に作業してください。
- 優しく鈍ピンセットで心膜を引き裂きます。 、鈍鉗子で安定した心を持ち、右心房を切断し、PBSの注入を開始します。すぐに左心室に採血針を挿入します。
- その後、6分（150ミリリットルに相当）のためのPFAに切り替え3分（75ミリリットルに相当する）のためにアクロレインが続く（チューブ内）PBSでマウスを灌流。チューブを気泡が入らない解決策を切り替える前に、ポンプ流量を一時停止するようにしてください。
- マウスを刎ねると固定脳を抽出し、4℃で少なくとも2時間、4％PFAを含むガラスバイアルに収めます。
- 脳を抽出するには、頭蓋骨を露出させるために皮膚を介してカットするハサミやピンセットを使用しています。慎重に頭蓋骨のオペアンプを破りますアン目、基礎となる脳を公開することの小片オフチップ間インチ
- 慎重に露出した脳を除去し、ポストビブラトーム切片用に進む前に、さらに2時間、4％PFAで固定します。
ビブラトームを使用してセク4.脳
- チルドPBSで固定した脳を3回洗浄。鋭利なカミソリの刃を使用して、（この領域は調査中である場合を除く）嗅球を除去し、2に横方向に脳をカット - 手順を加速するために同時に区分することができますこれらのすべてはほぼ同じ高さの3個、。
- トレイに固定され、試料プレート上に垂直に脳組織の小片を接着。滑らかな切断面が試料プレートにしっかりとスティックとセクショニング手順中に外れませんことを確認してください。脳全体の表面が完全に水没するまでトレイに十分なPBS溶液を追加します。番目を維持することが重要です電子脳片とそれに続くセクションでは、完全にこのステップを通してPBSに浸漬しました。
- 50μmの厚さの切片を得るために50μmの90ヘルツ、およびフィード厚さに、0.5ミリメートル/秒にセクショニング周波数をセクショニング速度を調整し、ビブラトームにトレイを置きます。その後細かい絵筆を用いて凍結保護溶液（40％PBS、30％エチレングリコール、30％グリセロール）を含有する20mLのガラスバイアルにセクションを移します。さらに使用するまで-20℃でバイアルを保管してください。次の手順で説明するように別の方法として、即時のスクリーニングのために、PBS中でのセクションを保持。
メトキシX04-染色斑の存在5.セクションスクリーニング
- 定位マウス脳アトラス14、例えば、関心のある領域を含む選択脳切片、本実施例で使用される海馬のCA1を用いて。十分な凍結保護溶液を含む24ウェル培養プレート内のウェルに各部を配置乾燥からセクションを防止するようになっています。
- 次の手順を使用して、セクションを乾燥を避けるために、連続して各セクションを調べます。
- 使い捨てピペットを用いて顕微鏡スライドにPBSの滴を追加し、液滴のセクションを配置します。
- メトキシ-X04標識Aβ斑を含む領域を同定するために蛍光顕微鏡下でセクションを調べます。
注：メトキシX04は容易に蛍光紫外線（UV）フィルター（励起340nm - 380nmで）を用いて可視化することができます。
- 各画像はの構造領域に直接プラークの存在を相関させるために、両方のフィールドに同じ領域を表示しなければならないので、顕微鏡ステージを移動させることなく、明視野ならびに蛍光モードで関心領域（ROI）の画像をキャプチャ組織切片。
- 保存して、動物の数に応じて撮影した画像に名前を付けます。また、プレート内のウェル数と画像のフィールドタを記録県。たとえば、例：9978A1B。動物番号：9978;まあ番号：A1。フィールド：明るいです。バック撮影が完了すると、そのほかの指定セクションを配置します。
注意：最後に、検討セクションごとに、二つの絵は、明視野での1とUVフィールドに別のものを得ています。 - イメージJで同じROI（明視野での1とUVフィールド内の他）の2つの画像を開き、MosaicJプラグインを使用して、2つの画像の端を揃え、よく番号、それに応じて整列して合成画像を保存から来た。
- 特定の動物の数と別のフォルダに画像を保存します。特定し、組織切片中のプラークをローカライズし、2つの異なるフィールド（明るく、UV）でのセクション全体の完全なビューを持つように画像を合成。
- スクリーニングプロセスが完了した後に免疫染色またはさらなる処理がCAになるまで、凍結防止剤を含有する24ウェル培養プレート中で-20℃で調べたセクションを保存しますアウトrried。
6.事前に埋め込むIBA1の免疫染色
注：RTでゆっくりと動いてロッカーにプレートを配置することによって選択された自由浮遊切片上IBA1のための免疫染色を行います。
- 十分に約1mlのPBS、10分間持続し、各洗浄で切片を3回洗浄します。
- 10分間PBS溶液中の0.3％過酸化水素で内因性のペルオキシダーゼをクエンチします。この工程は、非特異的ペルオキシダーゼ活性を阻止する、バックグラウンド染色を回避することが重要です。
- PBS中で10分間、3回組織を洗ってください。
- 30分間、PBS溶液中の0.1％の水素化ホウ素ナトリウムで切片をインキュベートします。このステップは、固定工程から残りのアルデヒドを低減することが重要であり、アクロレインは、組織固定に使用される場合に特に重要です。
- PBSで10分間、3回毎に組織を洗浄し、すべての気泡を除去するようにしてください。
- 1時間のセクションをブロックします。異なる抗体は、異なるブロッキング時間やソリューションが必要な場合があります。 IBA1については、10％ウシ胎児血清、3％ウシ血清アルブミン、および50 mMトリス緩衝生理食塩水（; pH7.4のTBS）中の0.01％のTriton X-100を含むブロッキング緩衝液調製。
注：ブロッキング工程は、一次抗体の非特異的結合を防止するためです。トリトンX-100の低濃度は、より良好な染色のための膜のわずかな透過を可能にし、EM下組織の最も超微細構造の特徴を保存するのに十分に低いです。 - 組織からブロッキング緩衝液を除去し、一次抗体溶液中でインキュベートする（ウサギ抗IBA1、希釈された[1：1,000]ブロッキング緩衝液中で）4°CO / Nで。
- 10分毎の時間のためにTBSで3回洗浄します。
- 90分間、0.05M TBSで：[200 1]二次抗体（ビオチンに結合したヤギ抗ウサギ）でインキュベートします。
- 5分毎の時間のためにTBSで5回洗浄します。
- TBSにアビジン - ビオチン複合体溶液（：[100 1]、ビオチンアビジン[100 1]）インキュベート1時間のためのソリューション。
- 5分毎の時間のためにTBSで5回洗浄します。
- 0.05％ジアミノベンジジン（DAB）および8分間TBS中0.015％過酸化水素でIBA1染色を明らかにする。
注：DAB開発のタイミングがプロトコルにプロトコルと異なる場合があり、すぐに光学顕微鏡下で染色した切片を調べることによって決定されるべきです。
注：IBA1について、1は明らかに20XでIBA1染色ミクログリア細胞の細胞体とプロセスを可視化することができる必要があります（代表的な例については、 図2を参照）。それが知られている発がん性物質であるとして、DABを用いて、十分に注意してください。 - （上記のように）注意深くこのステップの間にセクションを監視することにより、過現像避けます。 5分間冷やしたPBで毎回5回セクションを洗浄することによって反応を停止させます。
電子顕微鏡のための7の処理
- ガラスバイアルに、PBS中の1％四酸化オスミウム溶液を調製します。四酸化オスミウムは感光性です。グラムをカバー光からソリューションを保護するためにアルミホイルで小娘バイアル。
それは非常に危険な化学物質であるように、四酸化オスミウムを用いて、十分に注意してください。これとヒュームフードの内側には、次の手順を実行。 - セクションからPBSを取り外し、平らな細かい絵筆を使用してそれらを広げました。乾燥からのセクションを保持する時に、このステップ1つのウェルを実行します。すぐにセクション内の任意の折り目が永続的になるように、四酸化オスミウムを追加し、セクションのみを破壊する組織ポストオスミウム固定を平坦化しようとする前にセクションを平らにしてください。
- 折り畳みのセクションを防止するために、移送ピペットを用いて一度に四酸化オスミウムの一滴を添加、室温で30分間、四酸化オスミウムのセクションを浸し。光からセクションを保護するためにアルミホイルで十分にカバーしています。
注：このステップでは、セクション内の脂質を修正します。組織は、オスミウム後固定後、非常に暗い表示されます。 - セクションでは、オスミウムテトロ過去を殺した男にいる間xide、20gの成分A、20gの成分B 0.6 G成分C、およびDは上記の順に成分を一緒に合わせ、10mlの血清学的ピペットを使用して十分に混合0.4 G成分を混合することにより、使い捨てのビーカーにプラスチック樹脂を調製均一な色が得られるまで。
- アルミニウム秤量皿に調製した混合物を転送します。彼らは脱水された後、彼らは組織切片を受け取ることになります。
- 次の順序で2分間、エタノールの濃度の増加のセクションを脱水：35％、35％、50％、70％、80％、90％、100％、100％、100％。
- 残留エタノールを除去し、2分間のプロピレンオキシドで毎回3回のセクションを浸します。 20ミリリットルのガラスバイアルに24ウェル培養プレートからの脱水セクションを削除してください。常にそれがプラスチックを溶解するようにプロピレンオキシドを扱うときガラスバイアルを使用し、それが危険であるとして、注意を維持します。
- プロピレンオキシドsolutiのセクションを転送するために曲げガラスピペットチップまたは細かい絵筆を使用樹脂へ上、室温で浸潤について、O / Nを残します。プロピレンオキシドと樹脂を希釈しないように注意してください。
- ポリクロロトリフルオロエチレン（PCTFE）filmsheetsに樹脂のセクションを埋め込みます：
- PCTFEのfilmsheetsのセクションを埋め込む前に15分 - 10のための60℃のオーブン - 50に検体を含むアルミニウム秤量皿を置きます。
- セクションを埋め込む場合、一度に一つのアルミニウム秤量皿で動作します。細かい絵筆を使用して、1 PCTFEフィルムシート上に樹脂の薄層をペイント。
- PCTFEフィルムシートにアルミニウム計量皿から一度に組織の一つのセクションを移動します。それを乱さないように注意しながら、組織の周りから余分な樹脂を除去します。
- PCTFEフィルムシートに1計量皿からすべてのセクションを移動した後、最初の上に第二PCTFEシートを配置し、2枚の間に組織と樹脂のサンドイッチを作ります。
- 5で3日間培養器内の樹脂を重合5から60°C。
- 材料は現在、超薄切片及び超微細構造検査、多くの場合、EMの中核施設で実行される特殊な技術のための準備ができています。超微細構造劣化させずに安全にRTでPCTFEフィルムシート間のサンプルを保管してください。
注意：超薄切片および透過型電子顕微鏡検査のために後続のステップは、別のプロトコル13で説明されています。
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Representative Results
このセクションでは、プロトコルの別の重要なステップで得られる結果を示します。海馬CA1、地層radiatum、およびlacunosum-moleculare：特に結果は、特定の地域や関心のある層におけるメトキシX04染色されたプラークを含む脳切片の例を示しています。斑および海馬のラメラ/地域組織を順次UV及び明視野フィルタ（ 図1）の組み合わせを用いて可視化されます。選択された脳切片はその後、免疫染色およびそれらのAβプラークのトラックを維持しながら、彼らはまだ、蛍光以下の免疫染色であることを考慮すると、EMのために処理され、四酸化オスミウムと埋め込 み（ 図1）で処理した後の周囲の神経網よりも暗くなっています。これは、1つは、LOCAに基づいて電子顕微鏡で調べるために、（一般的に数ミリ平方）領域を識別することができますプラークの化。さらに、IBA1とミクログリアのプレ埋め込む免疫染色のための改良されたプロトコルは、ここで説明されています。このプロトコルは、ミクログリア細胞体の例外的な可視化、大小のプロセス（ 図2）と同様に脳切片内の抗体の浸透をもたらします。したがって、超微細構造レベルでのミクログリア細胞体およびプロセスの識別、およびAβ斑（ 図3と図4）との相互作用の研究を促進します。
1明視野を使用して、海馬部分と蛍光モードの蛍光色素メトキシX04。AB）デュアルイメージングの全身注射後、光学顕微鏡を用いて21ヶ月齢のAPP-PS1マウスにおけるAβプラークの図1.視覚化 。関心領域および層は、明視野下で視覚化されています380nmの（B） - （A）、およびAβ斑を順次340の範囲のUVフィルターを用いて局在化。 CD）（C）の前及び（D）プレ埋め込み四酸化オスミウム中で後固定続いIBA1ための免疫染色、エタノール中で脱水し、透過型電子顕微鏡観察のために必要とされるプラスチック樹脂に包埋した後、別の海馬部分のデュアルイメージング。留意しなければ、（点線で囲まれた）プラークは、電子顕微鏡のための組織処理の際に表示されたままです。組織ブロックをトリミングする際にプラークを可視化することは、高い空間分解能で画像への領域の正確な選択を可能にします。 AとBの= 300μmのスケールバーは、CおよびDの150μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. Viに光学顕微鏡レベルでIBA1染色により21ヶ月齢のAPP-PS1マウスにおけるミクログリア細胞体およびファインプロセスのsualization。クラスタ化された分布を示すIBA1染色ミクログリアのAB）例として、彼らはメトキシ-X04の相関蛍光イメージングによって識別Aβ斑（関連付ける;四酸化オスミウム後固定し、プラスチック樹脂の埋め込み前に観察されるように点線で囲みました）。四酸化オスミウム後固定し、プラスチック樹脂包埋後にAβプラークに関連したIBA1染色ミクログリアのCD）の例。プラークは、このように自分の位置の追跡を可能にする、オスミウム後固定、次の自分の周囲の神経網よりも暗くなることに注意してください。スケールバー=250μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3.デュアルAβプラークの可視化と高密度コアのAβそのコンパクトな線維構造によって認識プラーク（挿入図を参照）、ジストロフィー性神経突起との関連の超微細レベル。A）の例では6カ月齢のAPP-PS1マウスでIBA1、免疫染色オートファジーの超微細構造の特徴を持ちます。 B）IBA1染色ミクログリアプロセス（メートルの例;紫色に着色）は近くのアミロイド沈着物が含まれているAβ斑を発見しました。 （アスタリスクで示す）ミトコンドリアの変化はまた、ミクログリアプロセス内で見ることができます。留意すべきは、この絵は、抗体および染色強度の浸透が最大である（画像の右側に、白）組織樹脂国境で取得しました。 A、Bの1μmのため=2μmのスケールバーは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
透過型電子顕微鏡で観察されたように6カ月齢のAPP-PS1マウスにおけるIBA1-免疫染色ミクログリアの図4.その他の例。組織樹脂国境から遠い取得IBA1染色ミクログリア細胞体とプロセス（メートル）のAD）の例、このプロトコルを使用して、セクション内のより深い抗体および染色強度の優れた浸透を示します。 BV =血管、D =デンドライト、中=インクルージョン、S =樹状突起棘は、tは軸索終末を=。矢じりは、シナプスの裂け目を示しています。スケールバー=1μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、EMと高密度コアAβ斑を標的とするための相関手法を説明しています。メトキシX04 in vivoでの注入は、例えば海馬CA1、地層radiatum、およびlacunosum-moleculareのために、関心の特定の領域と層内のAβ斑が含まれている脳切片の迅速な選択を可能にします。本実施例では、メトキシX04事前スクリーニングは、ミクログリアの表現型は、高密度コアAβ斑の存在下での超微細構造レベルでのシナプスとの対話方法の異なる研究するIBA1の免疫染色前埋め込むと合わせました。
小膠細胞は、それらの周囲に非常に反応性であり、それらの炎症活性が長く正常な脳機能を損なうとADの進行を促進する文脈で検討されています。特に、これらの細胞は、CHRにつながる、それらの広範囲の活性化および炎症性サイトカインの放出を、神経変性過程に関与しました。onic神経炎症、および正常な脳のホメオスタシス15の破壊。しかし、近年、これらの居住者の免疫細胞は、積極的に新たな病原性のメカニズム16,17の同定をもたらす、健康な脳内の神経回路を改造することが示されました。シナプスにおけるそれらの生理学的役割は悪化シナプス損失、さまざまな神経変性状態18,19全体の認知機能低下の現在最高の病理学的な相関が得られ、ADの神経炎症の間に調節不全になることがあります。
前のプレ埋め込 むIBA1染色法13に対して行われた変更は、今より良い脳切片全体の抗体の浸透だけでなく、超微細構造レベルでのミクログリア細胞体および微細プロセスの可視化を可能にします。全体として、プロトコルは、超劣化を考慮し、組織切片のプラスチック樹脂包埋までマウス灌流から厳密に行う必要があります任意の中間の段階で発生するなど 、細胞膜、細胞小器官、細胞骨格要素の完全性を損なう可能性があります。
このプロトコルは、単に高密度コアAβプラークを可視化する（セクション6を省略して）任意の免疫染色することなく行うことができたが、それはまた別の抗体がするために使用することができるように、Aβ沈着に関連して、ADの病因の複雑なメカニズムを研究するための強力なツールを提供します末梢由来マクロファージ、内因性ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞、ならびに多くの神経細胞のサブタイプを含む種々の細胞型、に焦点を当てます。
メトキシX04のインビボ注射を考慮すると、このプロトコルは、死後のヒト脳サンプルとの使用を排除する、固定された脳切片上で行うことができません。また、逆にAβの可溶性および不溶性のフォームにラベルを付けAβに対する免疫染色に、染料の使用がs-プリーツβに結合します例えばメトキシ-X04などheetのタンパク質構造は別の制限を構成する、高密度のコアプラークの可視化を可能にします。
それにもかかわらず、重要なアプリケーションが重複し、その活動を補強し、AD病理の過程でプラーク恒常性と神経機能に直接影響を持つことができミクログリアおよび他の種々の細胞型、の役割を研究含めることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
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