Summary
Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.
Abstract
Un protocole détaillé est fourni ici pour identifier les plaques amyloïdes de Aß dans des coupes de cerveau à partir des modèles de souris de la maladie d'Alzheimer avant le pré-enrobage immunocoloration (spécialement pour ionisée adaptateur molécule de liaison du calcium 1 (IBA1), une protéine de liaison du calcium exprimée par la microglie) et le traitement des tissus pour la microscopie électronique (EM). Méthoxy- X04 est un colorant fluorescent qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à des feuilles plissé ß trouvées dans les plaques de Aß noyau dense de manière sélective. L'injection des animaux avec des méthoxy-X04 avant le sacrifice et le cerveau de fixation permet de pré-criblage et le choix des coupes de cerveau contenant plaque dentaire pour un traitement ultérieur avec des manipulations consommatrices de temps. Cela est particulièrement utile lorsque l'on étudie la pathologie AD précoce au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui peuvent contenir très peu de plaques, présents dans seulement une petite fraction des sections. traitement post-mortem des coupes de tissus avec le Congo-Rouge, thioflavine S et Thioflavin T (ou même avec méthoxy-X04) peuvent étiqueter des feuilles ß plissés, mais nécessite une vaste clairière avec de l'éthanol pour éliminer l'excès de colorant et ces procédures sont incompatibles avec la préservation ultrastructural. Il serait également inefficace pour effectuer l'étiquetage pour Aß (et d'autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur toutes les sections du cerveau des régions d'intérêt, seulement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. Fait important, les plaques Aß sont encore visibles après le traitement des tissus pour EM, permettant une identification précise des zones (généralement jusqu'à quelques millimètres carrés) d'examiner avec le microscope électronique.
Introduction
Amyloïde Aß formation de plaque est la principale caractéristique neuropathologique de la maladie d'Alzheimer (MA). Cependant des preuves croissantes suggèrent des rôles importants du système immunitaire dans la progression de la maladie 1,2. En particulier, de nouvelles données provenant d'études précliniques et cliniques établies dysfonctionnement immunitaire en tant que principal moteur et contributeur à la pathologie AD. Avec ces résultats, les cellules immunitaires centrales et périphériques ont émergé comme des cibles thérapeutiques prometteuses pour AD 3. Le protocole suivant combine la lumière et microscopie électronique (EM) pour générer de nouvelles connaissances sur la relation entre Aß dépôt de plaque et les modifications phénotypiques microgliales dans AD. Ce protocole permet l'étiquetage des plaques Aß dans des modèles murins de AD à l' aide de l'injection in vivo du colorant fluorescent méthoxy-X04. Méthoxy-X04 est un dérivé du rouge Congo qui peut facilement traverser la barrière hémato-encéphalique pour entrer dans le parenchyme cérébral et lier des feuilles β-plissés à haute uneffinity. Etant donné que le colorant est fluorescent, il peut être utilisé pour la détection in vivo de Aß dépôt de plaques avec microscopie biphotonique 4. Une fois lié à Aß, méthoxy-X04 ne se dissocie pas ou redistribuer loin des plaques, et il conserve sa fluorescence au fil du temps. Il est généralement administré périphériquement pour permettre l'imagerie non invasive de la dynamique du cerveau 5. La fluorescence reste également suivant l' aldéhyde fixation, permettant des analyses corrélative post-mortem, y compris l' enquête de la mort neuronale dans le voisinage des plaques Aß 6.
Ce protocole tire profit des propriétés de méthoxy-X04 pour sélectionner des coupes de cerveau de souris APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpression une double mutation au gène APP Lys670Asn / Met671Leu, et la variante de la préséniline PS1-A264E humaine) 7 qui présentent Aß plaques dans les régions d'intérêt spécifiques (hippocampe CA1, radiatum strates, et lacunosum-moleculare) Avant d'effectuer une pré-enrobage immunocoloration contre le marqueur microglial ionisé molécule adaptatrice liant le calcium 1 (IBA1) pour visualiser les organes et processus avec EM cellules microgliales. Les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de solution méthoxy-X04, 24 heures avant le cerveau fixation par perfusion transcardial. des sections coronales de cerveau sont obtenues en utilisant un vibratome. Les articles contenant le CA1 de l'hippocampe sont examinés sous un microscope à fluorescence pour la présence de plaques Aß en radiatum strates et lacunosum-moleculare. Immunocoloration pour IBA1, tétroxyde d'osmium post-fixation, et plastique enrobage de résine sont ensuite effectuées sur les sections du cerveau sélectionnées. A la fin de ce protocole, les sections peuvent être archivés sans autre dégradation ultrastructural, prêt pour ultramince tronçonnage et l'examen ultrastructural. Fait important, les plaques sont encore fluorescentes après immunocoloration avec des anticorps différents, par exemple IBA1 comme dans le présent protocole. Ils deviennent plus sombres than leur de neuropile environnant suivant tétroxyde d'osmium post-fixation, indépendamment de méthoxy-X04 coloration, ce qui permet d'identifier avec précision les régions d'intérêt, généralement jusqu'à quelques millimètres carrés, à examiner au microscope électronique à transmission.
Cette approche corrélative offre un moyen efficace pour identifier les sections spécifiques du cerveau à examiner au niveau ultrastructural. Cela est particulièrement utile lors de l'étude au début de pathologie AD, au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui ne peut contenir que quelques plaques de Aß, présents dans seulement une petite fraction des coupes de tissus. Pendant ces temps surtout, il serait inefficace d'utiliser immunocoloration Aß (et double étiquetage pour d'autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur plusieurs sections du cerveau simplement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. En outre, l'injection de souris vivantes avec méthoxy-X04 avant le sacrifice et le traitement des tissus ne fait pas compromise la préservation ultrastructural. D' autres méthodes telles que post-mortem coloration au rouge Congo, thioflavine S, thioflavine T ou méthoxy-X04 sur des coupes de tissus fixes nécessitent une différenciation de coloration dans l' éthanol, 8-11 qui provoque un stress osmotique et perturbe l'ultrastructure. Congo - Rouge est également un cancérogène humain connu 12.
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Protocol
Note: Toutes les expériences ont été approuvés et réalisés selon les directives du comité d'éthique animale institutionnelle, en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux administré par le Comité de l'Université Laval Animal Care. APP-PS1 souris mâles entre 4 et 21 mois ont été utilisés. Ces animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 h à 22-25 ° C avec un accès libre à la nourriture et de l'eau.
1. Méthoxy-X04 Préparation de la solution
- Préparer une solution à 5 mg / ml de méthoxy-X04 9 en dissolvant méthoxy-X04 dans une solution contenant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), 45% de propylène - glycol et 45% de phosphate de sodium , une solution saline tamponnée (0,9% de NaCl dans 100 mM de tampon phosphate , pH 7,4).
- En utilisant une microbalance, peser 5 mg du composé méthoxy-X04. Sous une hotte, dissoudre le méthoxy-X04 dans le DMSO et mélanger jusqu'à l'obtention d'une solution verdâtre clair. ajouter Successivement propylèneglycol et phosphate tampon saline tout en agitant avec chaque addition.
- Agiter la solution à 4 ° C sur un dispositif de rotation O / N. Obtenir une émulsion vert jaunâtre. La solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à deux mois sans dégradation.
2. Méthoxy-X04 Solution injectable
- 24 heures avant la perfusion, les souris pèsent et donner à chaque souris une injection intrapéritonéale de méthoxy-X04 à une dose de 10 mg / kg de poids corporel en utilisant une aiguille 27 G ½.
3. Transcardial Perfusion des souris Injecté
- Le jour avant la perfusion, de préparer des volumes appropriés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 3,5% d' acroléine et 4% de paraformaldehyde (PFA) de 13 solutions et de les stocker à 4 ° CO / N.
Note: Ces solutions seront utilisées à la fois pour la perfusion et l'immunohistochimie pré-enrobage. Faites attention lorsque vous travaillez avec l'acroléine, comme il est corrosif et toxique à la foisles chercheurs et l'environnement. En outre, étant donné que l'acroléine est corrosif pour le plastique, utilisez toujours la verrerie appropriée pour préparer des solutions d'acroléine. - Le jour de la perfusion, on filtre le PFA et de l'acroléine à l'aide d'un papier filtre grossier de rétention de particules de 25 um.
- Au cours de la perfusion, en utilisant une pompe péristaltique pour fournir 15 ml de PBS, 75 ml d'acroléine et 150 ml de PFA successivement dans la circulation sanguine de la souris, à un débit de 25 ml / min.
Faites attention. Effectuer perfusion strictement à l'intérieur d'une hotte pour éviter les fumées nocives de PFA et de l'acroléine.- Pour mettre en place la pompe, insérez une extrémité dans la solution PBS, remplir la tubulure (maintenant environ 15 ml) avec du PBS, et fixer une aiguille ailée de collecte de sang 25 G à l'autre extrémité. En tout temps, veiller à ce que le tube est exempt de bulles d'air.
- Placer le tube directement dans la bouteille d'acroléine après le réglage de la pompe de perfusion avec le tube rempli avec du PBS.
- Unesthétiser une souris à la fois avec 90 mg / kg de dose de poids corporel de pentobarbital de sodium injecté par voie intrapéritonéale en utilisant une ½ aiguille 27 G. Évaluer les réponses aux pincements arrière / orteil. Procéder seulement si la souris ne répond pas à ces répulsifs, des stimuli douloureux.
- Fixer la souris en position couchée (couché sur le dos avec le visage vers le haut) en collant les pattes et pattes arrière à la surface de travail et d'exposer soigneusement le cœur sans causer de dommages à d'autres organes. Assurez-vous de travailler rapidement après la perforation de la membrane.
- Effectuer une incision à travers la peau avec des ciseaux chirurgicaux le long de la ligne médiane thoracique commençant caudale à la cage thoracique et procéder rostrale à la clavicule.
- Faire deux incisions latérales supplémentaires le long de la base de la cage thoracique ventrale. Déplacez doucement et épinglez les deux volets de la peau, en veillant à exposer l'ensemble de la cavité thoracique.
- Tenir le processus xiphoïde avec des pinces émoussées pour exposer la cavité thoracique et stabiliser les ciseaux pointuss. Couper à travers le diaphragme et la cage thoracique, en prenant soin d'éviter de percer les poumons, et continuer l'incision rostrale aux clavicules. Assurez-vous de travailler rapidement après la perforation de la membrane.
- déchirer doucement le sac péricardique avec une pince contondants. Tenez le cœur stable avec pince émoussée, couper l'oreillette droite, et commencer la perfusion de PBS. insérer immédiatement l'aiguille de collecte de sang dans le ventricule gauche.
- Perfuser la souris avec du PBS (dans les tubes), suivie d'acroléine pendant 3 min (ce qui correspond à 75 ml), puis passer à PFA pendant 6 min (ce qui correspond à 150 ml). Assurez-vous de mettre en pause le débit de la pompe avant de solution de commutation pour empêcher les bulles d'entrer dans le tube.
- Décapitez la souris et extraire le cerveau fixe et le placer directement dans un flacon en verre contenant 4% PFA pendant au moins 2 heures à 4 ° C.
- Pour extraire le cerveau, utiliser des ciseaux et des pinces pour couper à travers la peau pour exposer le crâne. Casser soigneusement l'op du crâneen entre les yeux, et ébrécher petits morceaux de celui-ci pour exposer le cerveau sous-jacent.
- Retirez délicatement le cerveau et après correction exposée avec 4% PFA pour 2 h de plus avant de procéder pour vibratome tronçonnage.
4. Cerveau Sectionnement L'utilisation d'un Vibratome
- Laver le cerveau fixe 3 fois avec PBS refroidi. En utilisant une lame de rasoir, retirez le bulbe olfactif (à moins que cette région est sous enquête) et couper le cerveau transversalement dans 2 - 3 pièces d'environ la même hauteur, qui peuvent tous être sectionnés simultanément afin d'accélérer la procédure.
- Coller les morceaux de tissu cérébral verticalement sur la plaque d'échantillon fixé dans le bac. Assurez-vous que la surface lisse de coupe colle fermement à la plaque d'échantillon et ne soit pas délogée pendant la procédure de découpe. Ajouter suffisamment de solution PBS dans le bac jusqu'à la surface du cerveau entier est complètement immergé. Il est important de garder ee morceaux de cerveau et les sections suivantes complètement immergés dans du PBS tout au long de cette étape.
- Placer le plateau dans le vibratome, régler la vitesse de coupe de 0,5 mm / s, la fréquence de sectionnement à 90 Hz, et l'épaisseur de la charge à 50 um, pour un rendement de 50 um d'épaisseur des sections. Puis transférer les sections dans des flacons de verre 20 ml contenant une solution cryoprotectrice (40% PBS, 30% d'éthylène glycol, et 30% de glycérol) à l'aide d'un pinceau fin. Conserver les flacons à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Vous pouvez également conserver les sections dans du PBS pour le dépistage immédiat comme décrit dans les étapes suivantes.
5. L'article Dépistage de la présence de plaques Méthoxy-X04-tachés
- À l'aide d'un cerveau de souris stéréotaxique atlas 14 sections, sélectionner le cerveau contenant la région d'intérêt, par exemple, l'hippocampe CA1 tel qu'il est utilisé dans le présent exemple. Placez chaque section dans un puits dans une plaque de culture de 24 puits contenant assez de solution cryoprotectricede manière à empêcher les sections de sécher.
- Examinez chaque section successivement, pour éviter le dessèchement des sections, en utilisant la procédure suivante:
- Ajouter une goutte de PBS à une lame de microscope avec une pipette jetable, et placer la section sur la goutte.
- Examinez la section sous un microscope à fluorescence pour identifier les régions contenant des plaques Aß méthoxy-X04 marqués.
Note: méthoxy-X04 peut être facilement visualisé en utilisant une fluorescence ultraviolette (UV) filtre (excitation à 340-380 nm).
- Capture d'images de régions d'intérêt (ROI) dans le champ lumineux, ainsi que dans le mode de fluorescence sans bouger la platine du microscope, car chaque image doit montrer la même région dans les deux domaines afin de corréler la présence des plaques directement à la région structurelle de la section de tissu.
- Enregistrez et nommez les images prises en fonction du nombre d'animaux. Notez aussi le nombre de puits dans la plaque et le champ des images taKentucky Par exemple, Ex: 9978A1B; Numéro animale: 9978; Bien numéro: A1; Champ: Bright. Placez la section arrière dans son bien désigné une fois que l'imagerie est terminée.
Remarque: En fin de compte, pour chaque section examinée, deux images sont obtenues, l'un dans le champ lumineux et une autre dans le domaine UV. - Ouvrez les deux images de la même ROI (un dans le champ lumineux et l'autre dans le domaine UV) dans l'image J, et en utilisant le plugin MosaicJ, aligner les bords des deux images et enregistrer l'image alignées et combinées en fonction du nombre de puits, il est venu.
- Enregistrez l'image dans un dossier séparé avec le numéro de l'animal particulier. Combiner les images pour identifier et localiser les plaques dans la section de tissu, et d'avoir une vue complète de l'ensemble de la section dans les deux champs différents (lumineux et UV).
- Après le processus de sélection est terminée, stocker les sections examinées à -20 ° C dans une plaque de culture à 24 puits contenant cryoprotecteur jusqu'à immunocoloration ou le traitement ultérieur est carried out.
6. Pré-enrobage immunocoloration pour IBA1
Remarque: Effectuez l'immunocoloration pour IBA1 sur des sections choisies librement flottantes en plaçant la plaque sur une bascule se déplaçant lentement à température ambiante.
- Laver soigneusement les sections 3 fois avec environ 1 ml de PBS, chaque lavage durable pendant 10 min.
- Étancher peroxydases endogènes avec 0,3% de peroxyde d'hydrogène dans une solution PBS pendant 10 min. Cette étape empêche une activité de peroxydase non spécifique, ce qui est important pour éviter la coloration de fond.
- Laver le tissu dans du PBS 3 fois pendant 10 minutes chacune.
- Incuber les sections de borohydrure de sodium à 0,1% dans une solution PBS pendant 30 min. Cette étape est importante pour réduire les aldéhydes restants de l'étape de fixation, et il est particulièrement important si l'acroléine est utilisé dans la fixation du tissu.
- Laver le tissu dans du PBS 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois et assurez-vous d'enlever toutes les bulles.
- Bloquer les sections pendant 1 h.Différents anticorps peuvent nécessiter des temps et des solutions de blocage. Pour IBA1, préparer le tampon de blocage contenant 10% de sérum bovin fœtal, 3% d'albumine de sérum bovin et 0,01% de Triton X-100 dans 50 mM de solution saline tamponnée au Tris (TBS, pH 7,4).
Remarque: L'étape de blocage est d'empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps primaire. La faible concentration de Triton X-100 permet une légère perméabilisation des membranes pour une meilleure coloration, et est suffisamment faible pour conserver la plupart des caractéristiques ultrastructurales des tissus sous EM. - Retirer le tampon de blocage à partir du tissu et laisser incuber dans une solution d'anticorps primaire (anticorps de lapin anti-IBA1, dilué [1: 1000] dans un tampon de blocage) à 4 ° CO / N.
- Laver à TBS 3 fois pendant 10 min à chaque fois.
- Incuber dans un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin conjugué à la biotine) [1: 200] dans TBS 0,05 M pendant 90 min.
- Laver à TBS 5 fois pendant 5 min à chaque fois.
- Incuber dans avidine-biotine solution complexe (avidine [1: 100], biotine [1: 100]) dans TBSla solution pendant 1 heure.
- Laver à TBS 5 fois pendant 5 min à chaque fois.
- Révéler la coloration IBA1 avec 0,05% de diaminobenzidine (DAB) et 0,015% de peroxyde d'hydrogène dans du TBS pendant 8 min.
Remarque: Le calendrier de développement DAB peut varier d'un protocole à protocole et devrait être déterminé en examinant rapidement les sections colorées sous un microscope optique.
Note: Pour IBA1, on devrait être en mesure de visualiser clairement les corps cellulaires et les processus des microglies IBA1 tachés au 20X (voir la figure 2 par exemple représentatif). Soyez prudent en utilisant DAB, car il est un cancérigène connu. - Évitez de trop développer en surveillant attentivement les sections (comme décrit ci-dessus) au cours de cette étape. Arrêter la réaction par lavage des coupes PB refroidi à 5 fois pendant 5 min à chaque fois.
7. Traitement de microscopie électronique
- Préparer une solution de tétroxyde d'osmium à 1% dans du PBS dans un flacon en verre. Tétroxyde d'osmium est photosensible; couvrir la gflacon lass de papier d'aluminium pour protéger la solution de la lumière.
Soyez prudent en utilisant le tétroxyde d'osmium, car il est un produit chimique très dangereux. Effectuez cela et les étapes suivantes à l'intérieur d'une hotte. - Retirez le PBS des sections et étaler à plat à l'aide d'un pinceau fin. Effectuez cette étape un puits à la fois pour maintenir les sections de se dessécher. Assurez-vous d'aplatir les sections immédiatement avant d'ajouter tétroxyde d'osmium, comme les plis dans les sections deviendront permanents et de tenter d'aplatir le tissu après l'osmium fixation ne fera que briser les sections.
- Immerger les sections de tétroxyde d'osmium pendant 30 min à température ambiante, en ajoutant une goutte de tétroxyde d'osmium à la fois avec une pipette de transfert, afin d'empêcher les sections de pliage. Couvrir le puits avec du papier d'aluminium pour protéger les sections de la lumière.
Remarque: Cette étape fixe les lipides dans les sections. Le tissu apparaît très sombre après l'osmium post-fixation. - Alors que les sections sont en osmium tetroxyde, préparer la résine de plastique dans un bécher jetable en mélangeant le composant 20 g A, 20 g composant B, 0,6 g composant C, et 0,4 g composante D. Combiner les composants ensemble dans l'ordre ci-dessus et bien mélanger à l'aide d'une pipette de 10 ml sérologiques jusqu'à ce qu'une couleur uniforme soit obtenue.
- Transférer le mélange préparé à des plats en aluminium pesant. Ils recevront les sections de tissu une fois qu'ils ont été déshydratés.
- Déshydrater les sections dans des concentrations croissantes d'éthanol pendant 2 min dans l'ordre suivant: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Pour éliminer l'éthanol résiduel, immerger les sections dans de l'oxyde de propylène 3 fois pendant 2 min à chaque fois. Retirer les déshydratées-sections de la plaque de culture de 24 puits dans 20 ml des flacons en verre. Toujours utiliser des flacons en verre lorsque l'on travaille avec de l'oxyde de propylène se dissout en plastique, et maintenir la prudence, car il est dangereux.
- Utiliser un embout de pipette en verre courbé ou un pinceau fin pour transférer les sections de soluti d'oxyde de propylènesur dans la résine et laisser O / N pour l'infiltration à la température ambiante. Veillez à ne pas diluer la résine avec de l'oxyde de propylène.
- Incorporer la section avec la résine de poly-chloro-tri-fluoro-éthylène (PCTFE) filmsheets:
- Placer les boîtes en aluminium pesant contenant les échantillons dans un 50 - four à 60 ° C pendant 10 à 15 minutes avant l'enrobage sur les sections filmsheets PCTFE.
- Lors de l'incorporation des sections, travailler avec une pesée en aluminium plat à la fois. L'utilisation d'un pinceau fin, peindre une fine couche de résine sur la feuille de film d'un PCTFE.
- Déplacer une section de tissu à un moment de la pesée en aluminium plat à la feuille de film de PCTFE. Retirer l'excès de résine à travers le tissu, en faisant attention de ne pas le déranger.
- Après avoir déplacé toutes les sections d'une coupelle de pesage à la feuille de film de PCTFE, placer une seconde feuille de PCTFE sur la première, la création d'un sandwich de tissu et de la résine entre les 2 feuilles.
- Polymériser la résine dans un incubateur pendant 3 jours à 55-60 ° C.
- Le matériel est maintenant prêt pour ultramince tronçonnage et l'examen ultrastructural, des techniques spécialisées qui sont souvent effectuées par EM installations de base. Conserver les échantillons entre films PCTFE feuilles en toute sécurité à la température ambiante sans dégradation ultrastructural.
Remarque: Les étapes suivantes pour ultramince sectionner et de transmission Examen de microscopie électronique sont expliquées dans un protocole séparé 13.
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Representative Results
Cette section illustre les résultats qui peuvent être obtenus à différentes étapes critiques du protocole. En particulier, les résultats montrent des exemples de coupes de cerveau contenant méthoxy-X04 plaques colorées dans une région spécifique et des couches d'intérêt: le CA1 de l'hippocampe, radiatum strates, et lacunosum-moleculare. Les plaques et de l' organisation régionale / lamellaire de l'hippocampe sont successivement visualisées en utilisant une combinaison de filtres de champ lumineux (Figure 1) UV et. Les coupes de cerveau sélectionnées sont ensuite immunocolorées et traitées pour EM tout en gardant la trace de leurs plaques Aß, considérant qu'ils sont encore fluorescente immunocoloration suivante et deviennent plus sombres que le neuropile environnant après un traitement avec le tétroxyde d' osmium et l' incorporation (Figure 1). Cela permet d'identifier les zones (généralement de quelques millimètres au carré) à examiner au microscope électronique en fonction de la location des plaques. Par ailleurs, un protocole amélioré de pré-enrobage de la microglie immunocoloration avec IBA1 est décrite ici. Ce protocole donne une visualisation exceptionnelle des corps cellulaires microgliales, petits et grands processus (figure 2) ainsi que la pénétration des anticorps dans les sections du cerveau. Il facilite ainsi l'identification des corps et des processus cellulaires microgliales au niveau ultrastructural, et l'étude de leurs interactions avec les plaques Aß (figures 3 et 4).
Figure 1. Visualisation de Aß en plaques 21-month-old souris APP-PS1 Utilisation Lumière Microscopy, Après injection systémique de l'Fluorescent Dye Méthoxy-X04. AB) double imagerie d'une section hippocampique en utilisant les modes de champ et de fluorescence lumineux. Les régions et les couches d'intérêt sont visualisés sous champ lumineux(A), et les plaques de Aß localisées successivement à l'aide d'un filtre UV à une gamme de 340-380 nm (B). CD) à double imagerie d'une autre section hippocampique avant (C) et après (D) de pré-enrobage immunocoloration pour IBA1, suivie d'une post-fixation dans du tétroxyde d'osmium, une déshydratation dans de l'éthanol, et l'incorporation dans une résine plastique tel que requis pour la microscopie électronique à transmission. A noter, la plaque (encerclée par une ligne pointillée) est encore visible sur le traitement des tissus pour la microscopie électronique. Visualisation des plaques à découper les blocs de tissus permet une sélection précise des zones à l'image à haute résolution spatiale. Les barres d'échelle = 300 um pour A et B, 150 um pour C et D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Vi sualization de microglial cellules du corps et des processus Beaux en 21-month-old souris APP-PS1 par IBA1 Coloration au niveau microscopique Lumière. AB) Exemples de microglies IBA1 tachés montrant une distribution en cluster quand ils associent avec des plaques Aß (identifiées par imagerie de fluorescence corrélative de méthoxy-X04, encerclées par une ligne en pointillés) comme observé avant le tétroxyde d'osmium post-fixation et résine plastique plongement. CD) Exemples de microglies IBA1 tachés associée à des plaques Aß après tétroxyde d'osmium post-fixation et l'incorporation de résine plastique. Notez que les plaques deviennent plus sombres que leur neuropile environnant suivant osmium post-fixation, permettant ainsi le suivi de leur emplacement. Barre d' échelle = 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Double visualisation des plaques Aß et IBA1-immunocoloration en 6-month-old souris APP-PS1 au niveau ultrastructural. A) Exemple de dense noyau Aß plaque reconnue par sa structure fibrillaire compact (voir encadré) et l' association avec neurites dystrophiques avec des caractéristiques ultrastructurales de autophagie. B) Exemple de processus microgliales IBA1 teinté (m; coloré en violet) trouvé à proximité de la plaque Aß qui contient des dépôts amyloïdes. altérations mitochondriales (représentées par des astérisques) peut également être vu dans le processus de la microglie. A noter, cette image a été acquise à la frontière tissu-résine (blanche, à la droite de l'image) où la pénétration d'anticorps et de l'intensité de coloration est maximale. Barres d'échelle = 2 pm A, 1 pm pour B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Exemples supplémentaires de IBA1-immunocolorées microglie dans 6-month-old souris APP-PS1 observée avec microscopie électronique à transmission. AD) Exemples de corps IBA1 tachés cellule microgliale et les processus (m) acquis plus loin de la frontière tissu-résine , montrant une excellente pénétration des anticorps et de l'intensité plus profonde au sein de la section en utilisant ce protocole de coloration. bv = vaisseau sanguin, d = dendrite, en = inclusion, s = épines dendritiques, t = terminaison axonale. Les flèches montrent la fente synaptique. Barres d'échelle = 1 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole explique une approche corrélative pour le ciblage noyau dense plaques Aß avec EM. Méthoxv-X04 dans l' injection in vivo permet la sélection rapide des coupes de cerveau qui contiennent des plaques d' Aß à l' intérieur des régions particulières et les couches présentant un intérêt, par exemple CA1 de l' hippocampe, radiatum strates et lacunosum-moleculare. Dans le présent exemple, méthoxy-X04 pré-sélection a été combiné avec pré-enrobage immunocoloration pour IBA1 d'étudier comment les différents phénotypes microgliales interagissent avec des synapses au niveau ultrastructural, en présence de noyau dense plaques Aß.
Les microglies sont incroyablement sensibles à leur environnement et leur activité inflammatoire a été longtemps étudié dans le contexte de saper la fonction cérébrale normale et l'amélioration de l'avancement de la MA. En particulier, ces cellules ont été impliqués dans les processus neurodégénératifs en raison de leur vaste activation et la libération de cytokines pro-inflammatoires, conduisant à chrneuroinflammation onic, et la perturbation du cerveau normal homéostasie 15. Ces dernières années, cependant, ces cellules immunitaires résidentes ont également été montrées pour remodeler activement les circuits neuronaux dans le cerveau en bonne santé, ce qui conduit à l' identification de nouveaux mécanismes pathogéniques 16,17. Leurs rôles physiologiques au niveau des synapses peuvent devenir dérégulée pendant neuroinflammation dans AD, entraînant une perte synaptique exacerbée, actuellement la meilleure corrélation pathologique de déclin cognitif dans diverses conditions neurodégénératives 18,19.
Les modifications apportées à la méthode de pré-enrobage précédente IBA1 coloration 13 permettent maintenant une meilleure pénétration des anticorps à travers les sections de cerveau, ainsi que la visualisation des corps cellulaires microgliales et processus fines au niveau ultrastructural. Dans l'ensemble, le protocole doit être réalisée rigoureusement de la perfusion de la souris jusqu'à enrobage de résine plastique des sections de tissus, étant donné que la dégradation ultrastructuralese produisant à une étape quelconque entre pourrait compromettre l'intégrité des membranes cellulaires, des organites, des éléments du cytosquelette, etc.
Ce protocole pourrait être réalisée sans aucune immunocoloration (par l'article 6 omettant) pour visualiser uniquement noyau dense plaques Aß, mais il fournit également un outil puissant pour étudier les mécanismes complexes de la pathogenèse de la MA par rapport aux dépôts Aß, comme des anticorps différents peuvent être utilisés pour mettre l'accent sur différents types de cellules, y compris les macrophages dérivés périphériquement, microglie endogène, les astrocytes, les oligodendrocytes et leurs précurseurs, ainsi que de nombreux sous-types de neurones.
Compte tenu de l'injection in vivo de méthoxy-X04, ce protocole ne peut être effectuée sur des coupes de cerveau fixes, ce qui exclut son utilisation avec des échantillons post-mortem du cerveau humain. Aussi, contrairement à l 'immunocoloration contre Aß qui marque les formes solubles et insolubles de Aß, l'utilisation de colorants se liant à la ß-plissésstructures protéiques Heet comme méthoxy-X04 permet uniquement la visualisation des plaques de base denses, ce qui constitue une autre limitation.
Néanmoins, d'importantes applications pourraient inclure l'étude des rôles des microglies et d'autres divers types de cellules qui se chevauchent et augmenter leurs activités, et pourraient avoir des effets directs sur l'homéostasie plaque et la fonction neuronale au cours de la MA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
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