Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll Amyloid-Aß-Plaques bei Alzheimer-Krankheit Mausmodellen mit methoxy-X04 für die Visualisierung, die die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissierten in dichten Kern Aß-Plaques gefunden Blätter. Es ermöglicht Vorabsiebung von Plaque-enthaltenden Gewebeschnitten vor Immunofärbung und Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie.
Abstract
Ein detailliertes Protokoll ist vorgesehen, um Amyloid-Aß-Plaques in Hirnschnitten von Alzheimer-Krankheit Mausmodellen vor pre-Einbettungs Immunofärbung (speziell für ionisiertes Calcium bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1), einem Calcium-Bindungsprotein exprimiert durch Mikroglia) und Gewebeverarbeitung identifizieren Elektronenmikroskopie (EM). Methoxy-X04 ist ein fluoreszierender Farbstoff, der die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissiert gefunden Blätter in dichten Kern Aß-Plaques. Injektion der Tiere mit methoxy-X04 vor der Tötung und Gehirn Fixierung ermöglicht Vorabsiebung und Auswahl der Plaque-enthaltenden Gehirnschnitte für die Weiterverarbeitung mit zeitaufwendige Manipulationen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie in spezifischen Hirnregionen oder Schichten studieren, die nur sehr wenige Plaques enthalten kann, in nur einem kleinen Teil der Abschnitte. Post-mortem-Verarbeitung von Gewebeschnitten mit Kongo-Rot, Thioflavin S und Thioflavin T (oder sogar mit Methoxy-X04) können β-Faltblättern beschriften, erfordert jedoch umfangreiche Clearing mit Ethanol überschüssige Farbe zu entfernen und diese Verfahren sind nicht kompatibel mit ultra Erhaltung. Es wäre auch ineffizient sein Kennzeichnung Aß auszuführen (und andere Zellmarker wie Iba1) auf allen Gehirnschnitte aus den Regionen von Interesse, nur eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Wichtig ist, dass Aß-Plaques noch sichtbar nach Gewebeverarbeitung für EM, für eine genaue Identifizierung der Bereiche, so dass (in der Regel bis auf wenige Quadratmillimeter) mit dem Elektronenmikroskop zu untersuchen.
Introduction
Amyloid Aß Plaquebildung ist die Hauptneuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD). Allerdings zunehmende Hinweise darauf , eine wichtige Rolle des Immunsystems in den Krankheitsverlauf 1,2. Insbesondere werden neue Daten aus präklinischen und klinischen Studien etabliert Immundysfunktion als Haupttreiber und Mitarbeiter AD Pathologie. Mit diesen Erkenntnissen zentralen und peripheren Immunzellen haben als vielversprechende therapeutische Ziele für AD 3 entstanden. Das folgende Protokoll verbindet Licht- und Elektronenmikroskopie (EM) neue Einblicke in die Beziehung zwischen Aß Plaqueablagerung und Mikroglia phänotypische Veränderungen in AD zu erzeugen. Dieses Protokoll ermöglicht die Markierung von Aß - Plaques in Mausmodellen von AD in vivo Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs unter Verwendung methoxy-X04. Methoxy-X04 ist ein Kongo-Rot-Derivat, das leicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden können das Hirnparenchym zu betreten und zu binden β-Faltblättern mit hoherffinity. Da der Farbstoff fluoreszierend ist, kann es für die in vivo Detektion von Aß Plaqueablagerung mit Zwei-Photonen - Mikroskopie 4 verwendet werden. Sobald an Aß gebunden, Methoxy-X04 nicht trennen oder neu verteilen weg von Plaques, und es behält seine Fluoreszenz über die Zeit. Es wird im allgemeinen 5 peripher zu ermöglichen , für die nichtinvasive Bildgebung von Hirndynamik verabreicht. Die Fluoreszenz bleibt auch folgende Aldehyd Fixierung, so dass für Korrelat post-mortem - Analysen, einschließlich der Untersuchung von neuronalen Tod in der Nähe von Aß - Plaques 6.
Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaften von Methoxy-X04 an Hirnschnitten von APP SWE / PS1A 246e Mäuse wählen (APP-PS1; Koexpression eine doppelte Mutation an APP - Gen Lys670Asn / Met671Leu und menschliche Presenilin PS1-A264E Variante) 7 , die Aß aufweisen Plaques in bestimmten Regionen von Interesse (Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare) Vor Immunfärbung gegen die Mikroglia-Marker ionisiertem Calcium-bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1 vorab Einbettung) Mikroglia-Zellkörper und Prozesse mit EM zu visualisieren. Die Mäuse werden intraperitoneal Injektion von methoxy-X04-Lösung, 24 Stunden vor der Fixierung durch Hirn transcardial Perfusion gegeben. Koronar Gehirnschnitte werden mit einem Vibratom erhalten. Abschnitte des Hippocampus CA1 enthalten, werden unter einem Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit von Aß-Plaques in Schichten radiatum und lacunosum-moleculare gescreent. Immunofärbung für Iba1, Osmiumtetroxid post-Fixierung und Kunststoffharzeinbettung werden dann an den ausgewählten Gehirnschnitten durchgeführt. Am Ende dieses Protokolls können die Abschnitte ohne weitere ultrastrukturelle Abbau archiviert werden, bereit für die Ultradünnschnitt und ultrastrukturelle Untersuchung. Wichtig ist, dass die Plaques noch glimmenden mit verschiedenen Antikörpern nach immunostaining zum Beispiel Iba1 wie im vorliegenden Protokoll. Sie werden dunkler than deren umgebenden Neuropil folgenden Osmiumtetroxid post-Fixierung unabhängig methoxy-X04-Färbung, die die Regionen von Interesse, in der Regel auf wenige Quadratmillimeter genau zu identifizieren hilft, mit dem Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht werden.
Das Korrelat Ansatz bietet eine effiziente Möglichkeit, spezifische Gehirnschnitte zu identifizieren, die auf der ultrastruktureller Ebene zu untersuchen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie, in spezifischen Hirnregionen oder Schichten zu studieren, die nur wenige Aß-Plaques, die in nur einem kleinen Bruchteil von Gewebeschnitten enthalten. Während dieser Zeiten besonders wäre es ineffizient sein Immunofärbung zu verwenden, um A & bgr; (und Dual Kennzeichnung für andere zelluläre Marker wie Iba1) auf mehreren Hirnschnitten lediglich eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Darüber hinaus kann die Injektion von lebenden Mäusen mit Methoxy-X04 vor der Tötung und Gewebeverarbeitung nicht compromise die Ultrastrukturerhaltung. Alternative Methoden wie Post-mortem - Färbung mit Kongo - Rot, Thioflavin S, Thioflavin T oder Methoxy-X04 auf Gewebeschnitten erfordern Färbung Differenzierung in Ethanol, 8-11 , die osmotischen Stress verursacht und stört die Ultrastruktur. Kongo - Rot ist auch ein bekanntes menschliches Karzinogen 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Alle Experimente wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutional Tierethikkommission, in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien durchgeführt, wie von der Animal Care Committee der Université Laval verabreicht. APP-PS1 männliche Mäuse zwischen 4 und 21 Monate alt verwendet wurden. Diese Tiere wurden unter einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus gehalten bei 22 - 25 ° C mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
1. Methoxy-X04 Herstellung der Lösung
- Eine 5 mg / ml Lösung von methoxy-X04 9 durch Lösen methoxy-X04 in eine Lösung von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), 45% Propylenglykol und 45% Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung (0,9% NaCl in 100 mM Phosphatpuffer , pH 7,4).
- Mit Hilfe einer Mikrowaage wiegen 5 mg der Methoxy-X04-Verbindung. Unter einem Abzug löst den methoxy-X04 in DMSO und rühren, bis eine klare grünlich Lösung erhalten wird. hinzufügen Nacheinander Propylenglykol und phosphate Salzpuffer, während mit jeder Zugabe gerührt wurde.
- Rühren Sie die Lösung bei 4 ° C auf einem Rotator O / N. Besorgen Sie sich eine gelblich-grüne Emulsion. Die Lösung kann bis zu zwei Monate ohne Verschlechterung bei 4 ° C gelagert werden.
2. Methoxy-X04-Lösung Injection
- 24 Stunden vor der Perfusion, wiegen die Mäuse und geben Sie jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Methoxy-X04 in einer Dosis von 10 mg / kg Körpergewicht über einen 27 ½ G Nadel.
3. transkardialer Perfusion des injizierten Mäusen
- Am Tag vor der Perfusion, entsprechende Mengen an Kochsalzlösung (PBS), 3,5% Acrolein, und 4% Paraformaldehyd (PFA) phosphat Herstellung von Lösungen 13 und speichert sie bei 4 ° CO / N.
Hinweis: Diese werden Lösungen sowohl für die Perfusion und verwendet werden, die Immunhistochemie Pre-Einbettung. Besondere Vorsicht, wenn sie mit Acrolein arbeiten, da sie ätzend und giftig für beide istForscher und die Umwelt. Da zusätzlich Acrolein zu Kunststoff korrosiv ist, verwenden Sie immer geeignete Gläser Acrolein Lösungen herzustellen. - Am Tag der Perfusion, filtern die PFA und Acrolein durch Grobfilterpapier von 25 um Partikelretention verwendet.
- Während der Perfusion verwenden, um eine peristaltische Pumpe 15 ml PBS zu liefern, 75 ml Acrolein und 150 ml PFA nacheinander in die Maus Zirkulation bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 25 ml / min.
Lass Vorsicht walten. Führen Sie die Perfusion streng innerhalb einer Abzugshaube schädliche Dämpfe aus PFA und Acrolein zu vermeiden.- So stellen Sie die Pumpe, legen Sie ein Ende in die PBS-Lösung, füllen Sie den Schlauch (hält ca. 15 ml) mit PBS und fixieren eine 25 G geflügelte Blutentnahme Nadel zum anderen Ende. Zu allen Zeiten, sicherzustellen, dass der Schlauch von irgendwelchen eingeschlossene Luftblasen frei ist.
- Das Röhrchen wird direkt in der Acrolein Flasche nach der Perfusion Pumpe mit dem Schlauch gefüllt mit PBS einstellen.
- Eineine Maus zu einem Zeitpunkt mit einer 90 mg / kg Körpergewicht Dosis von Natrium-Pentobarbital aesthetize intraperitoneal eine 27 ½ G Nadel injiziert werden. Beurteilen Sie Antworten auf Schwanz / Zeh drückt. Gehen Sie nur, wenn Sie die Maus auf eine solche aversiven, schmerzhafte Reize nicht mehr reagiert.
- Sichern Sie die Maus in der Rückenlage (auf dem Rücken liegend mit dem Gesicht nach oben) durch die Vorderpfoten und hindpaws auf die Arbeitsfläche Taping und sorgfältig das Herz aussetzen, ohne auf andere Organe zu beschädigen. Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, nachdem die Membran Punktierung.
- Führen Sie einen Schnitt durch die Haut mit chirurgischen Schere entlang der Brustmittellinie kaudal des ribcage beginnen und gehen rostral des Schlüsselbeins.
- Machen Sie zwei zusätzliche seitliche Einschnitte entlang der Basis des ventralen Brustkorbs. bewegen und Stift vorsichtig die beiden Klappen der Haut, so dass Sie sicher, dass die gesamte Brusthöhle zu belichten.
- Halten Sie die Xiphoidbasis mit stumpfen Pinzette die Brusthöhle zu entlarven und die spitzen Schere stabilisierens. Schnitt durch die Membran und Brustkorb, wobei darauf geachtet, zu vermeiden, dass die Lungen Punktierung und weiterhin den clavicles den Einschnitt rostral. Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, nachdem die Membran Punktierung.
- reißen Sie vorsichtig den Herzbeutel mit stumpfen Pinzette. Halten Sie das Herz ruhig mit stumpfen Pinzette, schneiden Sie den rechten Vorhof, und starten Sie die Infusion von PBS. einfügen sofort die Blutentnahme Nadel in den linken Ventrikel.
- Perfundieren die Maus mit PBS (in dem Schlauch) gefolgt von 3 min Acrolein (75 ml entspricht) dann 6 min zu PFA Schalter (entsprechend 150 ml). Achten Sie darauf, den Förderstrom zu unterbrechen, bevor Switching-Lösung, Blasen am Eindringen in das Rohr zu verhindern.
- Enthaupten die Maus und extrahieren die feste Gehirn und legen Sie sie direkt in einen Glaskolben mit 4% PFA für mindestens 2 Stunden bei 4 ° C.
- Um das Gehirn zu extrahieren, verwenden Schere und Pinzette durch die Haut zu schneiden, den Schädel zu belichten. brechen Sie vorsichtig den Schädel open zwischen den Augen, und kleine Stücke davon abplatzen die zugrunde liegende Gehirn aufzudecken.
- Entfernen Sie vorsichtig den freiliegenden Gehirn und Post-Fix mit 4% PFA für weitere 2 Stunden vor Vibratom Schnitte für fortfahren.
4. Gehirn Sectioning eine Vibratom Verwendung
- Waschen Sie die Fest brain 3 mal mit gekühltem PBS. Mit einem scharfen Rasierklinge, entfernen Sie den Riechkolben (es sei denn, diese Region untersucht wird) und schneiden Sie das Gehirn quer in 2 - 3 Stücke von ungefähr gleicher Höhe, die alle gleichzeitig um geschnitten werden kann, um den Vorgang zu beschleunigen.
- Kleben Sie die Stücke von Hirngewebe senkrecht auf die Probenplatte in das Fach gesichert. Stellen Sie sicher, dass die glatte Schnittfläche fest an der Probenplatte klebt und nicht während des Schneideverfahrens verdrängt gelangt. Fügen Sie genug PBS-Lösung in das Fach, bis die gesamte Hirnoberfläche vollständig eingetaucht ist. Es ist wichtig, th zu haltene Gehirn Stücke und nachfolgende Abschnitte vollständig in PBS in diesem Schritt eingetaucht.
- Setzen Sie das Fach in der Vibratom, stellen Sie die Schneidegeschwindigkeit auf 0,5 mm / sec, der Schnittfrequenz auf 90 Hz, und der Speisestärke bis 50 & mgr; m, um 50 & mgr; m dicke Abschnitte zu erhalten. Dann übertragen Sie die Abschnitte in 20-ml-Glasfläschchen mit Gefrierschutzmittel-Lösung (40% PBS, 30% Ethylenglykol und 30% Glycerin) mit einem feinen Pinsel. Lagern Sie die Fläschchen bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. Alternativ halten die Abschnitte in PBS für die sofortige Screening, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
5. Abschnitt Screening auf die Anwesenheit von Methoxy-X04-gefärbten Plaketten
- Mit der Hilfe eines stereotaktischen Maus - Gehirn - Atlas 14, wählen Gehirnschnitte , die Region von Interesse enthält, zum Beispiel, wie der Hippocampus CA1 in dem vorliegenden Beispiel verwendet. Setzen Sie jeden Abschnitt in einen Brunnen innerhalb einer 24-Well-Kulturplatte genug Gefrierschutzmittel-Lösung, dieum die Abschnitte vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Untersuchen Sie jeden Abschnitt nacheinander, zu vermeiden, dass die Abschnitte Austrocknen, mit dem folgenden Verfahren:
- Fügen Sie einen Tropfen PBS auf einem Objektträger mit einer Einwegpipette, und legen Sie den Abschnitt auf dem Tröpfchen.
- Überprüfen Sie den Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop Regionen zu identifizieren, enthält Methoxy-X04 markierte Aß-Plaques.
Hinweis: methoxy-X04 leicht sichtbar gemacht werden kann, einen Fluoreszenz Ultraviolett (UV) Filter (Anregung 340-380 nm).
- Machen Sie Bilder von Regionen von Interesse (ROI) im hellen Bereich als auch im Fluoreszenzmodus, ohne den Mikroskoptisch zu bewegen, da jedes Bild den gleichen Bereich in beiden Bereichen, um zeigen, muss die Anwesenheit der Plaques direkt mit dem Strukturbereich zu korrelieren von der Gewebeschnitt.
- Benennen und speichern Sie die Bilder entsprechend der Tiernummer genommen. notieren Sie auch die gut Nummer in der Platte und das Feld der Bilder taken. Zum Beispiel Ex: 9978A1B; Tierzahl: 9978; Nun Nummer: A1; Field: Bright. Platzieren Sie den Abschnitt wieder in seiner vorgesehenen gut, wenn die Bildgebung abgeschlossen ist.
Hinweis: Am Ende für jeden Abschnitt untersucht, zwei Bilder erhalten werden, ein in Hellfeld und ein weiteres im UV-Bereich. - Öffnen Sie die beiden Bilder von der gleichen ROI (ein in hellen Bereich und die andere im UV-Bereich) in Bild J, und mit Hilfe der MosaicJ Plugin, richten Sie die Ränder der beiden Bilder und speichern Sie die ausgerichtet und kombinierten Bildes nach der gut Nummer sie kam aus.
- Speichern Sie das Bild in einem separaten Ordner mit der Nummer des jeweiligen Tieres. Kombinieren Sie die Bilder zu identifizieren und die Plaques im Gewebeschnitt zu lokalisieren, und haben einen vollständigen Überblick über den gesamten Abschnitt in den zwei verschiedenen Feldern (hell und UV).
- Nach dem Screening-Prozess abgeschlossen ist, speichern Sie die untersuchten Abschnitte bei -20 ° C in einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen enthält, Gefrierschutzmittel, bis die Immunfärbung oder zur weiteren Verarbeitung ca istrried aus.
6. Pre-Embedding Immunostaining für Iba1
Hinweis: Führen Sie die Immunfärbung für Iba1 auf ausgewählten frei schwebenden Abschnitte von auf einem sich langsam bewegenden Wippe bei RT die Platte legen.
- Gründlich waschen Sie die Abschnitte 3-mal mit etwa 1 ml PBS, jeder Wäsche dauerten 10 min.
- endogene Peroxidasen mit 0,3% Wasserstoffperoxid in PBS-Lösung quenchen für 10 min. Dieser Schritt verhindert, dass nicht-spezifische Peroxidase-Aktivität, was wichtig ist, die Hintergrundfärbung zu vermeiden.
- Waschen Sie das Gewebe in PBS 3 mal für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren der Schnitte in 0,1% Natriumborhydrid in PBS-Lösung für 30 min. Dieser Schritt ist wichtig, um alle verbleibenden Aldehyde aus dem Fixierungsschritt zu reduzieren, und ist besonders wichtig, wenn Acrolein in Gewebefixierung verwendet wird.
- Waschen Sie das Gewebe in PBS 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit und stellen Sie sicher, alle Blasen zu entfernen.
- Blockieren Sie die Abschnitte 1 Stunde.Verschiedene Antikörper können unterschiedliche Sperrzeiten und Lösungen erfordern. Für Iba1 bereiten 10% fötalem Rinderserum, 3% Rinderserumalbumin und 0,01% Triton X-100 in 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung Blockierungspuffer enthält, (TBS, pH 7,4).
Hinweis: Der Blockierungsschritt unspezifischen Bindung des primären Antikörpers zu verhindern, ist. Die niedrige Konzentration von Triton X-100 ermöglicht geringfügige Permeabilisierung von Membranen für eine bessere Färbung und ist niedrig genug für die meisten ultrastrukturelle Merkmale des Gewebes unter EM zu bewahren. - Entfernen des Blockierungspuffers von dem Gewebe, und Inkubation in primärem Antikörper-Lösung (Kaninchen-anti-Iba1, verdünnt [1: 1,000] in Blockierungspuffer) bei 4 ° CO / N.
- Waschen in TBS 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit.
- Inkubieren in Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen zu Biotin konjugiert) [1: 200] in 0,05 M TBS für 90 min.
- Waschen in TBS 5 mal für jeweils 5 min.
- Inkubieren in Avidin-Biotin-Komplex-Lösung (Avidin [1: 100], Biotin [1: 100]) in TBSLösung für 1 Std.
- Waschen in TBS 5 mal für jeweils 5 min.
- Reveal die Iba1 Färbung mit 0,05% Diaminobenzidin (DAB) und 0,015% Wasserstoffperoxid in TBS für 8 min.
Anmerkung: Der Zeitpunkt des DAB Entwicklung von Protokoll zu Protokoll können variieren und sollten durch schnell Untersuchung der gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop bestimmt werden.
Hinweis: Für Iba1 sollte man in der Lage sein , klar die Zellkörper und Prozesse der Iba1 befleckten bei 20facher Mikroglia zu visualisieren (Abbildung 2 für repräsentatives Beispiel zu sehen). Seien Sie vorsichtig mit DAB, da es ein bekanntes Karzinogen ist. - Vermeiden Sie zu entwickeln, indem Sie bitte die Abschnitte Überwachung (wie oben beschrieben) in diesem Schritt. Die Reaktion durch die Abschnitte in gekühlten PB Waschen 5-mal für jeweils 5 min.
7. Verarbeitung für Elektronenmikroskopie
- Vorbereitung 1% Osmiumtetroxid-Lösung in PBS in einem Glasfläschchen. Osmiumtetroxid ist lichtempfindlich; decken die glass Fläschchen mit Aluminiumfolie, die Lösung vor Licht zu schützen.
Seien Sie vorsichtig, Osmiumtetroxid, da es eine sehr gefährliche Chemikalie ist. Führen Sie diese und die folgenden Schritte innerhalb einer Abzugshaube. - Entfernen Sie die PBS aus den Abschnitten und verteile sie flach einen feinen Pinsel. Führen Sie diesen Schritt ein gut zu einer Zeit, die Abschnitte zu halten vor dem Austrocknen. Achten Sie darauf, die Abschnitte unmittelbar vor der Zugabe von Osmiumtetroxid, als irgendwelche Falten in den Abschnitten zu glätten wird dauerhaft werden und versuchen, Gewebe Post Osmium Fixierung abflachen werden nur die Abschnitte brechen.
- Tauchen Sie die Abschnitte in Osmiumtetroxid 30 min bei RT, Zugabe eines Tropfens von Osmiumtetroxid zu einer Zeit mit einer Transferpipette, auf die Abschnitte verhindern Falten. Decken Sie die gut mit Aluminiumfolie, um die Abschnitte vor Licht zu schützen.
Anmerkung: Dieser Schritt legt die Lipide innerhalb der Abschnitte. Das Gewebe erscheint sehr dunkel nach Osmium Postfixierung. - Während Abschnitte sind in Osmium tetroXide, bereiten Kunststoffharz in einem Einweg-Becher von 20 g Komponente A mischen, 20 g Komponente B, 0,6 g Komponente C und 0,4 g Komponente D der Komponenten in der obigen Reihenfolge kombinieren und mischen sie gut 10 ml serologische Pipette bis eine einheitliche Farbe erhalten.
- Übertragen Sie die hergestellte Mischung auf Aluminium mit einem Gewicht von Gerichten. Sie werden die Gewebeschnitte erhalten, sobald sie entwässert wurden.
- Entwässern die Abschnitte in Konzentrationen von Ethanol für 2 min in der folgenden Reihenfolge zunehmender: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Zum Entfernen von Restethanol, tauchen die Abschnitte in Propylenoxid 3-mal 2 Minuten jedes Mal. Entfernen Sie die dehydriert Schnitte aus der 24-Well-Kulturplatte in 20 ml Glasfläschchen. Immer Glasfläschchen verwenden, wenn mit Propylenoxid funktioniert, wie es aus Kunststoff löst sich auf, und halten Vorsicht, da es gefährlich ist.
- Verwenden Sie eine gebogene Glaspipettenspitze oder mit einem feinen Pinsel die Abschnitte von Propylenoxid soluti zu übertragenauf in das Harz und O / N für die Infiltration bei RT verlassen. Achten Sie darauf, um das Harz mit Propylenoxid zu verdünnen.
- Einbetten den Abschnitt mit dem Harz auf Poly-Chlor-tri-Fluor-Ethylen (PCTFE) filmsheets:
- Legen Sie die Aluminium-Wägeschalen mit den Proben in einen 50 - 60 ° C Ofen 10 - 15 Minuten vor dem Einbetten der Abschnitte auf PCTFE filmsheets.
- Wenn Abschnitte Einbettung, arbeiten mit einer Aluminium zu einer Zeit Schüssel mit einem Gewicht. Mit einem feinen Pinsel, malen eine dünne Schicht aus Harz auf ein PCTFE Filmblatt.
- Bewegen eines Abschnitts des Gewebes in einer Zeit von der Aluminiumschale zum PCTFE Filmblatt mit einem Gewicht. Entfernen Sie überschüssiges Harz aus um das Gewebe, wobei darauf geachtet, sie nicht zu stören.
- alle Abschnitte von einem Gericht zum PCTFE Filmblatt mit einem Gewicht, legen Sie eine zweite PCTFE Blatt über die erste nach dem Verschieben ein Sandwich von Gewebe zu schaffen und zwischen zwei Blättern Harz.
- Polymerisieren des Harzes in einem Inkubator für 3 Tage bei 55-60 ° C.
- Das Material ist nun bereit für ultradünne Schnitte und ultrastrukturelle Untersuchung, spezielle Techniken, die häufig durchgeführt werden, durch EM Kernanlagen. Lagern Sie die Proben zwischen PCTFE Filmblätter sicher bei RT ohne ultrastrukturelle Abbau.
Hinweis: Die nachfolgenden Schritte für die Ultradünnschnitt und Transmissionselektronenmikroskopie Prüfung sind in einem separaten Protokoll 13 erläutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieser Abschnitt veranschaulicht die Ergebnisse, die an verschiedenen kritischen Schritte des Protokolls erhalten werden kann. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, Beispiele von Gehirnschnitten methoxy-X04 gefärbten Plaques in einem bestimmten Gebiet und Schichten von Interesse enthält: Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare. Die Plaques und regionale / Lamellen Organisation des Hippocampus werden mit einer Kombination aus UV- und Hellfeld Filter (Abbildung 1) , die nacheinander sichtbar gemacht . Die ausgewählten Gehirnschnitte werden anschließend immunhistochemisch und für EM verarbeitet , während Spur ihrer Aß - Plaques zu halten, wenn man bedenkt , dass sie weiterhin fluoreszierende folgenden Immunofärbung sind und dunkler als die umgebenden Neuropil nach der Behandlung mit Osmiumtetroxid und Einbetten (Abbildung 1). Dies erlaubt es, die Bereiche (in der Regel wenige Millimeter im Quadrat) zu identifizieren, mit dem Elektronenmikroskop zu untersuchen, basierend auf der location von Plaques. Darüber hinaus wird ein verbessertes Protokoll für die Pre-Einbettung Immunfärbung von Mikroglia mit Iba1 hier beschrieben. Dieses Protokoll liefert eine außergewöhnliche Visualisierung von Mikroglia - Zellkörpern, große und kleine Verfahren (Abbildung 2) sowie das Eindringen der Antikörper in den Gehirnschnitten. Es ermöglicht somit die Identifizierung von Mikroglia - Zellkörper und Prozesse auf ultrastruktureller Ebene und die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit Aß - Plaques (3 und 4).
Abbildung 1. Visualisierung von Aß Plaques in 21 Monate alten APP-PS1 Mäusen Lichtmikroskopie, nach systemischer Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs Methoxy-X04. AB) Dual Imaging eines Hippocampus - Abschnitt unter Verwendung von Hellfeld und Fluoreszenz - Modi. Die Regionen und Schichten von Interesse sind unter Hellfeld sichtbar gemacht(A) und die Aß-Plaques nacheinander lokalisierte einen UV-Filter in einem Bereich von 340 bis 380 nm (B). CD) Dual Imaging eines anderen hippocampal Abschnitt vor (C) und nach (D) vorgeEinbettungs für Iba1 Immunofärbung, gefolgt von Postfixierung in Osmiumtetroxid, Dehydration in Ethanol, und in einem Kunststoffharz einzubetten wie für die Transmissionselektronenmikroskopie erforderlich. Zu beachten ist, ist die Plakette (eingekreist durch eine gepunktete Linie) immer noch sichtbar auf der Gewebeverarbeitung für die Elektronenmikroskopie. für eine präzise Auswahl der Bereiche, Bild mit hoher räumlicher Auflösung die Plaques sichtbar machen, wenn erlaubt es, die Gewebeblöcke trimmen. Maßstabsbalken = 300 & mgr; m für A und B, 150 & mgr; m für C und D. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Vi alisierung von Mikroglia - Zellkörper und Fein Prozesse in 21 Monate alten APP-PS1 Mäusen durch Iba1 Färbung auf der Light mikroskopischer Ebene. AB) Beispiele für Iba1 gebeiztes Mikroglia einen gruppierten Verteilung zeigt, wenn sie durch Abbilden methoxy-X04 korrelativen Fluoreszenz mit Aß-Plaques (identifiziert assoziieren; durch eine gestrichelte Linie umgeben), wie vor Osmiumtetroxid post-Fixierung und Kunststoffharzeinbettungs beobachtet. CD) Beispiele für Iba1 befleckten Mikroglia im Zusammenhang mit Aß-Plaques nach Osmiumtetroxid Postfixierung und Kunstharzeinbettung. Beachten Sie, dass die Plaques dunkler als ihre Umgebung neuropil folgende Osmium Postfixierung, so Tracking von ihrem Standort zu ermöglichen. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Abbildung 3. Dual - Visualisierung von Aß - Plaques und Iba1-Immunfärbung in 6 Monate alten APP-PS1 - Mäuse auf dem ultrastruktureller Ebene. A) Beispiel für dichten Kern Aß Plaque durch seine kompakte fibrilläre Struktur erkannt (siehe kleines Bild) und die Assoziation mit dystrophischen Neuriten mit ultrastrukturellen Eigenschaften von Autophagie. B) Beispiel für Iba1 befleckten Mikroglia-Prozess (m; gefärbt in violett) gefunden in der Nähe der Aß-Plaques, die Amyloid-Ablagerungen enthält. Mitochondrial Veränderungen (durch Sternchen gezeigt) kann auch innerhalb der Mikroglia-Verfahren zu sehen. Zu beachten ist, wurde dieses Bild am Gewebe-Harz Grenze (weiß, an der rechten Seite des Bildes) erworben, wo das Eindringen von Antikörpern und Färbungsintensität maximal ist. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m für A, 1 & mgr; m für B. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Weitere Beispiele für Iba1-immunhistochemisch Mikroglia in 6 Monate alten APP-PS1 - Mäuse , die beobachtet wird mit Transmissionselektronenmikroskopie. AD) Beispiele für Iba1 gebeiztes Mikroglia Zellkörper und Prozesse (m) erworben weiter von dem Gewebe-Harzgrenz , eine hervorragende Penetration der Antikörper und Anfärbungsintensität tiefer in dem Abschnitt zeigt die dieses Protokoll verwenden. bv = Blutgefäß, d = Dendriten, in = Aufnahme, s = dendritischen Dorn, t = Axonterminal. Die Pfeilspitzen zeigen synaptischen Spalten. Maßstabsbalken = 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll erklärt ein Korrelat Ansatz für dichten Kern Aß-Plaques mit EM-Targeting. Methoxy-X04 in vivo - Injektion ermöglicht eine schnelle Auswahl von Hirnschnitten , die Aß - Plaques enthalten in bestimmten Regionen und Schichten von Interesse, zum Beispiel den Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare. Im vorliegenden Beispiel Methoxy-X04 Pre-Screening wurde mit kombinierten Pre-Einbettung immunostaining für Iba1 zu untersuchen, wie verschiedene Mikroglia-Phänotypen mit Synapsen auf ultrastruktureller Ebene in Gegenwart von dichten Kern Aß-Plaques in Wechselwirkung treten.
Mikroglia sind unglaublich, die auf ihre Umgebung und ihre Entzündungsaktivität wurde im Zusammenhang mit der Untergrabung normale Funktion des Gehirns und die Verbesserung der Förderung von AD lang untersucht. Insbesondere wurden diese Zellen bei neurodegenerativen Prozessen aufgrund ihrer umfangreichen Aktivierung und Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen beteiligt, was zu chrONIC neuroinflammation und die Störung der normalen Gehirn Homöostase 15. In den letzten Jahren jedoch sind diese resident Immunzellen wurden 16,17 neuronaler Schaltkreise in gesunden Gehirn, was zur Identifizierung von neuen pathogenen Mechanismen aktiv zu remodellieren gezeigt. Ihre physiologischen Rollen an den Synapsen während neuroinflammation in AD, was verschlimmert synaptischen Verlust, der derzeit besten pathologische Korrelat der kognitiven Fähigkeiten in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen 18,19 dysregulated werden.
Die vorgenommenen Änderungen zum vorherigen Pre-Einbettung Iba1 Färbemethode 13 nun ein besseres Eindringen von Antikörpern in den Gehirnschnitten, sowie die Visualisierung von Mikroglia - Zellkörpern und feine Prozesse auf ultrastruktureller Ebene ermöglichen. Insgesamt muss das Protokoll rigoros aus Maus Perfusion bis Kunstharz Einbettung der Gewebeschnitten durchgeführt werden, dass die ultrastrukturelle Abbau unter Berücksichtigungjeder in-zwischen Schritt auftreten könnte die Integrität der Zellmembranen beeinträchtigen, Organellen, Zytoskelett - Elemente usw.
Dieses Protokoll könnte ohne Immunostaining durchgeführt werden (nach § 6 weggelassen) ausschließlich auf dichten Kern Aß-Plaques sichtbar zu machen, aber es bietet auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplexen Mechanismen der AD Pathogenese mit Bezug auf Aß Ablagerung zu untersuchen, wie verschiedene Antikörper verwendet werden, um konzentrieren sich auf verschiedene Zelltypen, einschließlich peripher abgeleiteten Makrophagen, Mikroglia endogene, Astrozyten, Oligodendrozyten und deren Vorläufern, sowie viele neuronale Subtypen.
In Anbetracht der in vivo - Injektion von Methoxy-X04 kann dieses Protokoll nicht auf festen Gehirnschnitte durchgeführt werden, die mit postmortalen menschlichen Gehirnproben seine Verwendung ausschließt. Auch im Gegensatz zu Immunfärbung gegen Aß, die lösliche und unlösliche Formen von Aß-Etiketten, die Verwendung von Farbstoffen Bindung an ß-plissierten sheet Proteinstrukturen wie Methoxy-X04 erlaubt nur die Visualisierung von dichten Kern-Plaques, die eine weitere Einschränkung darstellt.
Dennoch umfassen wichtige Anwendungen könnten die Rollen von Mikroglia und andere verschiedene Zelltypen zu studieren, die ihre Aktivitäten überlappen und verstärken, und direkte Auswirkungen auf die Plaque-Homöostase und neuronale Funktion im Laufe der AD Pathologie haben könnte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
