Korrelat ljus- och elektronmikroskopi att studera mikroglia Interaktioner med P-amyloid plack
Summary
Den här artikeln beskriver ett protokoll för att visualisera amyloida Ap plack i Alzheimers sjukdomsmodeller mus med hjälp av metoxi-X04, som passerar blod-hjärnbarriären och selektivt binder till p-veckade ark som finns i tät kärna Ap plack. Den tillåter pre-screening av plack innehållande vävnadssnitt före immunfärgning och bearbetning för elektronmikroskopi.
Abstract
En detaljerad protokoll finns här för att identifiera amyloid Ap plack i hjärnan sektioner från Alzheimers sjukdomsmodeller mus innan pre-inbäddning immunfärgning (speciellt för joniserad kalciumbindande adaptermolekyl en (IBA1), en kalciumbindande protein som uttrycks av mikroglia) och vävnadsbehandling för elektronmikroskopi (EM). Metoxi-X04 är en fluorescerande färg som passerar blod-hjärnbarriären och binder selektivt till p-veckade ark som finns i tät kärna Ap-plack. Injektion av djuren med metoxi-X04 före avlivning och hjärnan fixering tillåter pre-screening och val av plack innehållande hjärnan sektioner för vidare bearbetning med tidskrävande manipulationer. Detta är särskilt användbart när man studerar tidig AD patologi inom specifika områden i hjärnan eller skikt som kan innehålla mycket få plack, som förekommer i endast en liten del av sektionerna. Obduktion behandling av vävnadssnitt med kongorött, Thioflavin S, och Thioflavin T (eller ens med metoxi-X04) kan märka p-veckade ark, men kräver omfattande röjning med etanol för att avlägsna överskott av färgämne och dessa förfaranden är oförenliga med ultra bevarande. Det skulle också vara ineffektivt för att utföra märkning av aP (och andra cellulära markörer såsom IBA1) på samtliga hjärnsektioner från regionerna av intresse, bara för att ge en liten fraktion som innehåller Ap-plack på rätt plats. Viktigt, Ap plack är fortfarande synliga efter vävnadsbehandling för EM, vilket möjliggör en exakt identifiering av de områden (i allmänhet ner till några kvadratmillimeter) att undersöka med elektronmikroskop.
Introduction
Amyloid Ap plackbildning är den huvudsakliga neuropatologiska kännetecken för Alzheimers sjukdom (AD). Men allt fler bevis tyder viktiga roller i immunsystemet i sjukdomsförloppet 1,2. I synnerhet, nya data från prekliniska och kliniska studier etablerade immundysfunktion som de främsta pådrivarna och bidrar till AD patologi. Med dessa resultat har centrala och perifera immunceller framträtt som lovande terapeutiska mål för AD 3. Följande protokoll kombinerar ljus och elektronmikroskopi (EM) för att generera nya insikter i förhållandet mellan Ap plack nedfall och microglial fenotypiska förändringar i AD. Detta protokoll möjliggör märkning av Ap plack i musmodeller av AD med hjälp av in vivo injektion av fluorescerande färgämne metoxi-X04. Metoxi-X04 är en kongorött-derivat som lätt kan passera blod-hjärnbarriären för att komma in i hjärnparenkymet och binda β-veckade ark med högffinity. Eftersom färgämnet är fluorescent, kan den användas för in vivo detektion av Ap plack nedfall med två-foton-mikroskopi 4. Efter bindning till AP, inte metoxi-X04 inte dissociera eller omfördela bort från plack, och det behåller sin fluorescens över tiden. Det är allmänt administreras perifert för att möjliggöra för icke-invasiv avbildning av hjärnan dynamik 5. Fluorescensen är också fortfarande efter aldehyd fixering, vilket möjliggör korrelat obduktion analyser, inklusive undersökning av neuronal död i närheten av A-beta plack 6.
Detta protokoll drar fördel av egenskaperna hos metoxi-X04 för att välja hjärnsektioner från APP SWE / PS1A 246E möss (APP-PS1, samuttrycker en dubbel mutation vid APP-genen Lys670Asn / Met671Leu och human presenilin PS1-A264E variant) 7 som uppvisar Ap plack i specifika regioner av intresse (hippocampus CA1, skikt radiatum och lacunosum-moleculare) Före pre-inbäddning immunfärgning mot microglial markör joniserat kalciumbindande adaptermolekyl en (IBA1) att visualisera microglial cellkroppar och processer med EM. Mössen ges intraperitoneal injektion av metoxi-X04 lösning, 24 timmar före hjärnan fixering genom transcardial perfusion. Koronala hjärnan sektioner erhålls med hjälp av en vibratome. Sektioner som innehåller hippocampus CA1 screenas under ett fluorescensmikroskop för närvaron av Ap-plack i strata radiatum och lacunosum-moleculare. Immunfärgning för IBA1, är osmiumtetroxid efter fixering, och plast harts inbäddning sedan på de valda hjärnsektioner. I slutet av detta protokoll, kan sektionerna arkiveras utan ytterligare ultra nedbrytning, redo för ultratunn sektionering och ultra undersökning. Viktigt är placken fortfarande fluorescerande efter immunfärgning med olika antikroppar, till exempel IBA1 som i det nuvarande protokollet. De blir mörkare tHan deras omgivande neuropil efter osmiumtetroxid efter fixering, oberoende av metoxi-X04 färgning, vilket bidrar till att exakt identifiera de områden av intresse, i allmänhet ner till några kvadratmillimeter, som skall undersökas med transmissionselektronmikroskop.
Detta korrelat metod ger ett effektivt sätt att identifiera specifika hjärnsektioner att undersöka på ultra nivå. Detta är särskilt användbart när man studerar tidig AD patologi, inom specifika områden i hjärnan eller skikt som bara kan innehålla några Ap plack, som förekommer i endast en liten del av vävnadssnitt. Under dessa tider särskilt, skulle det vara ineffektivt att använda immunfärgning för AP (och dubbel märkning för andra cellulära markörer som IBA1) på flera hjärnsektioner helt enkelt för att ge en liten fraktion som innehåller Ap plack på rätt plats. Dessutom injektion av levande möss med metoxi-X04 före avlivning och vävnadsbehandling inte compromise den ultra bevarande. Alternativa metoder såsom obduktion färgning med kongorött, Thioflavin S, Thioflavin T eller metoxi-X04 på sektioner fixerade vävnads kräver färgning differentiering i etanol, 8-11 som orsakar osmotisk stress och stör ultra. Congo Red är också en känd mänsklig carcinogen 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll förklarar en motsvarande metod för att rikta tät kärna Ap plack med EM. Metoxi-X04 in vivo injektion möjliggör snabb urval av hjärnsektioner som innehåller Ap plack inom vissa regioner och lager av intresse, till exempel hippocampus CA1, skikt radiatum och lacunosum-moleculare. I föreliggande exempel, var metoxi-X04 pre-screening i kombination med pre-inbäddning immunfärgning för IBA1 att studera hur olika microglial fenotyper interagerar med synapser vid ultrastrukturell nivå i nä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine Lévesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Québec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Faculté de médecine of Université Laval.
Materials
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer’s disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
