알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
동결 시료의 파단 크라이 주사 전자 현미경 (SEM)의 근처 기본 조건에서 생물학적 구조를 조사 할 수있다. 여기, 우리는 잎 샘플에서 광합성 (틸라코이드) 막의 초분자 조직을 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이는 고압 잎 조직의 동결, 동결 파쇄, 이중층 코팅 최종적 극저온 SEM 촬영에 의해 달성된다. 이중 층 코팅 방법의 사용은 고배율 취득 수 (> 100,000X) 냉동 수화 샘플 최소 빔의 손상뿐만 아니라, 최소한의 충전 효과 이미지. 설명 된 절차를 사용하여 우리는 현장에서, 부활 공장 Craterostigma의 pumilum의 탈수시 발생하는 광계 빛 수확 안테나 단백질 복합체의 초분자 분포의 변화를 조사 하였다.
Introduction
산소를 광합성, 고대 시아 노 박테리아에서 원래는 엽록체 세포 기관의 개발을 주도 endosymbiotic 이벤트에 의해 조류와 육상 식물에 의해 계승되었다. 모든 현대 산소를 광 영양 생물에서 광합성 전자 수송 및 양성자 동기 힘의 생성과 환원력은 '틸라코이드'막이라고 평평 주머니 같은 소포 내에서 수행된다. 이러한 막은 광합성 광 구동 반응을 수행 및 에너지 전달을위한 매체를 제공하는 단백질 복합체를 집. 식물과 (일부) 조류의 틸라코이드 막은 두 가지 형태 도메인으로 구분됩니다 : '기질 라멜라'라는 '그라나'와 그라나을 상호 언 스택 막이라고 단단히 appressed 막 지역 1. 식물과 조류 틸라코이드 막의 다양한 동결 골절 연구는 1970 년대 초반부터 진행되고있다. 때 동결 골절, 막세포 구획에 따라 한 exoplasmic 얼굴 (EF)와 원형질 얼굴 (PF)를 생성, 자신의 소수성 코어 (2)에 따라 분할되는 반 막 테두리, 원래 Branton 등에 의해 화폐로 주조있다. . 각각의 '와'U '나타내는'누적 '과'언 스택 '막 지역으로, EFS, EFU, PF에와 PFU : 1975 년 3 식물과 조류 틸라코이드 네 가지 골절면이있다. 분할 또는 파손되지 않은 막 단백질 복합체, 전자 또는 멤브레인의 P의 양쪽으로 유지하는 경향이있다. 틸라코이드의 다른 골절면이 서로 다른 크기의 입자 밀도 (4), 다음에 많은 연구를 포함하는 초기의 관찰은 광 반응을 수행 관찰 된 입자와 세포막 단백질 복합체 사이의 식별과 상관되었다 5-13 (참조 또한 14, 15 리뷰).
FRE틸라코이드 막 랑 골절 실험은 일반적으로 분리 절차를 수행하는 동안 발생할 수있는 구조 및 / 또는 초분자 조직의 모든 변화의 위험, (그러나 16, 17 참조) 엽록체 또는 격리 된 틸라코이드 막 준비에 수행된다. 파쇄 후에, 레플리카들은 다음의 탄소 (C)의 두꺼운 층으로 백금 / 탄소 백금 (Pt / C)의 증발에 의해 제조되고, 생체 물질 (18)의 마지막으로 소화. 복제본은 투과형 전자 현미경 (TEM)에 의해 가시화된다. 기존의 동결 골절 – 복제 기술은 다른에 초분자 광합성 막의 조직 및 적응 연구를위한 중요한 도구, 예를 들어 역할을하고 있습니다., 빛, 조건 19-23.
Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous 부활 식물의 우리의 최근의 연구에서 우리는 초분자 조직 오의 변화를 조사하는 것을 목표로탈수 및 재수 동안 F 틸라코이드 막뿐만 아니라 전반적인 세포 조직. homoiochlorophyllous 부활 종의 고유성은 자신의 광합성 장치를 유지하면서, 자신의 식물 조직 (잎)에서 탈수의 조건 살아남을 수 있다는 것입니다. 물을 사용할 수있게되면,이 식물은 복구하고 몇 일 25 시간 내에 광합성 활동을 다시 시작합니다. 이 연구를 위해 동결 파쇄 판 시료의 극저온 주사 EM (SEM) 이미지는 고압 샘플 크라이 고정화 냉동실과 결합시켰다. 이러한 절차는 기본 상태 (26)에 가까운 상태에서 냉동 수화 생물학적 시료를 시각화하기위한 수단을 제공한다. 하나의 주요 장점은 샘플이없는 연속적인 단계를 동결 골절 및 코팅 후 직접 조사하는 것입니다. 자신의 수화 상태가 준비하는 동안 유지되는이 다른 상대 수분 함량 (RWC)에서 식물의 조사에 특히 관련이있다. 방법지금까지 하나의 중요한 단점은 광합성 단지의 크기의 정확한 측정에 필요한 높은 배율에서 스캔 할 때 냉동 – 수화 샘플 특히, 영상 중에 빔 손상으로 고통 수 있다는 것이다. 이것을 극복하기 위해서, 방법은 "이중층 코팅 '(DLC) 특정 극저온 SEM 촬상 조건을 사용 하였다 결합 27,28했다. 이들은 훨씬 적은 빔 구분 샘플 결과 및 광합성 단백질 초분자 조직과 부활의 식물 C.의 다른 세포 성분에 대한 가치있는 정보의 해명에 대해 허용 현장에서 높은 배율에서 pumilum.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 기재된 기술은 극저온 사형 전자 현미경으로 잘 보존 고압 동결 식물 조직의 컨텍스트 내에서 동결 파쇄 막의 조사를 허용한다. 이러한 절차를 사용하는 주요 장점은 시료 준비 순전히 물리적 점이다; 화학 물질이나 탈수를 포함하는 어떤 단계가 필요하지 않습니다. 따라서, 거의 원시 상태 26,32에서 생물학적 구조를 연구 할 수 있습니다. 잎 조직을 사용하는 장점은 하나의 엽?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전자 현미경 이미지를 스캔에 대한 자신의 도움이 조언을 안드레스 Kaech (취리히 대학) 감사합니다. 이 작품은 미국 – 이스라엘 Binational 농업 연구 개발 기금 (더 부여합니다. US-4334-10를, ZR을) 이스라엘 과학 재단 (더 부여합니다. 12분의 1,034을, ZR)을하고, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다 (RGP0005 / 2013, ZR). 전자 현미경 연구는 과학의 와이즈만 연구소의 어빙과 나노 Cherna 모스코 위츠 센터 및 바이오 나노 이미징에서 실시 하였다.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
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