دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
البرد المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) العينات بكسر تجميد يسمح التحقيق في الهياكل البيولوجية في الظروف المحلية القريبة. هنا، نحن تصف تقنية لدراسة تنظيم supramolecular من التمثيل الضوئي الأغشية (الثايلاكويد) في عينات الأوراق. ويتحقق ذلك عن طريق الضغط العالي تجميد الأنسجة ورقة، تشميد، طلاء طبقة مزدوجة وأخيرا التصوير البرد ووزارة شؤون المرأة. استخدام طريقة طلاء طبقة مزدوجة يسمح الحصول على التكبير عالية (> 100،000X) صور مع الحد الأدنى من الضرر شعاع للعينات المجمدة المائية فضلا عن آثار فرض الحد الأدنى. باستخدام الإجراءات الموضحة نحن التحقيق في إحداث تغييرات في توزيع supramolecular المجمعات الضوئي وضوء حصاد البروتين الهوائي التي تحدث أثناء جفاف النبات القيامة Craterostigma pumilum، في الموقع.
Introduction
الضوئي الاوكسجينية، والتي تنشأ في البكتيريا الزرقاء القديم، ورثته الطحالب والنباتات البرية الأحداث endosymbiotic التي أدت إلى تطوير عضية بلاستيدات الخضراء. في كل phototrophs الاوكسجينية في العصر الحديث، وتجرى الضوئي نقل الإلكترون وتوليد قوة البروتون الدافع والحد من السلطة في غضون الحويصلات مثل كيس بالارض وصف الأغشية "الثايلاكويد". هذه الأغشية تأوي مجمعات البروتين التي تنفذ ردود الفعل مدفوعة للضوء من التمثيل الضوئي، وتوفير وسيلة لتنبيغ الطاقة. وتختلف الأغشية الثايلاكويد من النباتات و(بعض) الطحالب في مجالين المورفولوجية متميزة: appressed بإحكام المناطق غشاء يسمى "جرانة" والأغشية unstacked أن ربط وجرانة، ودعا 'سدى صفاحات "1. وقد أجريت دراسات تجميد كسر مختلفة من النباتات والأغشية الثايلاكويد الطحالب، ابتداء من أوائل 1970s. عندما-بكسر تجميد والأغشيةتقسيم على طول الأساسية مسعور. 2، وتوليد وجه exoplasmic (EF) ووجه جبلي (PF)، اعتمادا على مقصورة الخلوية التي حدود نصف الغشاء، كما صاغ في الأصل من قبل Branton وآخرون. . في عام 1975 3 النبات والطحالب ثايلاكويد لها أربعة أنواع مختلفة من وجوه كسر: التماثلية، EFU، PFS وPFU، مع الصورة "وتدل على" مكدسة "و" unstacked "المناطق غشاء 'ش'، على التوالي. المجمعات بروتين الغشاء، والتي لا تقسيم أو كسر، لديهم ميل للبقاء مع إما E أو الجانب P من الغشاء. الملاحظات الأولية التي تواجهها كسر مختلفة من ثايلاكويد تحتوي على جزيئات من مختلف الأحجام والكثافة 4، والعديد من التحقيقات التي تلت ذلك، أدى إلى تحديد وجود ارتباط بين الجسيمات لوحظ ومجمعات البروتين غشاء التي تنفذ ردود الفعل الخفيفة 5-13 (انظر أيضا يستعرض 14،15).
الصحائفوتجرى تجارب إز كسر الأغشية الثايلاكويد عادة خارجا على الاستعدادات من البلاستيدات الخضراء أو الأغشية الثايلاكويد معزولة (ولكن انظر 16،17)، في خطر من أي تغيير في / أو التنظيم الهيكلي وsupramolecular التي قد تحدث أثناء إجراء العزل. بعد كسر، وعن طريق التبخر من البلاتين / الكربون (حزب العمال / ج) إعداد النسخ المتماثلة، ثم بطبقة سميكة من الكربون (C)، وأخيرا هضم المواد البيولوجية (18). وتصور المقلدة من قبل انتقال المجهر الإلكتروني (تيم). تواصل تقنية تجميد كسر طبق الأصل التقليدية ليكون بمثابة أداة هامة لدراسة تنظيم supramolecular الأغشية الضوئي ومواكبة لمختلف، على سبيل المثال، الضوء، وظروف 19-23.
في دراستنا الأخيرة من النبات القيامة homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24، كنا نهدف إلى تحقيق التغييرات في تنظيم س supramolecularالأغشية و الثايلاكويد، وكذلك في تنظيم الخلوية بشكل عام، خلال الجفاف ومعالجة الجفاف. تفرد الأنواع القيامة homoiochlorophyllous هو أن تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة ظروف جفاف في الأنسجة النباتية الخاصة بهم (يترك)، مع الاحتفاظ أجهزتها الضوئي. مرة واحدة يتوفر الماء، وهذه النباتات على التعافي واستئناف النشاط الضوئي في غضون ساعات إلى بضعة أيام 25. لهذه الدراسة، تم الجمع بين البرد مسح EM (SEM) تصوير عينات أوراق بكسر تجميد مع الضغط العالي تجميد لعينة البرد تجميد. توفر هذه الإجراءات وسيلة لتصور العينات البيولوجية المجمدة-المائية في حالة قريبة من الحالة الأصلية الخاصة بهم 26. واحد الفائدة الرئيسية هي أن العينات يتم فحص مباشرة بعد تجميد كسر وطلاء مع أي خطوات متتالية. وينطبق ذلك بشكل خاص على التحقيق في النباتات على مختلف محتويات المياه النسبي (RWC)، كما حافظت دولة ترطيب أثناء الإعداد. كيفمن أي وقت مضى، واحد عيب الحاسم هو أن العينات المجمدة رطب قد تعاني من التلف شعاع أثناء التصوير، وخصوصا عندما تم مسحها ضوئيا في تكبير عالية، اللازمة لقياس دقيق لحجم المجمعات الضوئي. للتغلب على هذه، وهي طريقة تسمى "طلاء طبقة مزدوجة" (DLC) 27،28 جنبا إلى جنب مع استخدمت شروط محددة التصوير البرد ووزارة شؤون المرأة. أدت هذه في العينات التي هي أقل بكثير الحزم حساسة ويسمح لاستجلاء معلومات قيمة عن تنظيم supramolecular البروتين الضوئي وغيرها من المكونات الخلوية من محطة القيامة C. pumilum في تكبير عالية في الموقع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية الموضحة في هذه الورقة تسمح التحقيق في الأغشية كسر التجميد في سياق الأنسجة النباتية المجمدة ذات الضغط العالي المحفوظة جيدا من البرد المجهر الإلكتروني. والميزة الرئيسية لاستخدام هذه الإجراءات هي أن إعداد العينات هو مادي بحت. ضرورية أية خطوات تنطوي على مواد كيمي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر اندريس Kaech (جامعة زيوريخ) للحصول على المشورة المفيدة له على مسح التصوير المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل صندوق الولايات المتحدة-إسرائيل ثنائية القومية للبحوث الزراعية والتنمية (منح رقم 4334-10 الولايات المتحدة، ZR)، ومؤسسة العلوم اسرائيل (منح رقم 1034/12، ZR)، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (RGP0005 / 2013، ZR). أجريت دراسات المجهر الإلكتروني في ايرفينغ موسكوفيتش ومركز Cherna للنانو والحيوية نانو التصوير في معهد وايزمان للعلوم.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
