Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
microscopia elettronica Cryo-scansione (SEM) di campioni freeze-fratturato permette di indagine delle strutture biologiche in condizioni vicine native. Qui, descriviamo una tecnica per studiare l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane (tilacoidali) all'interno di campioni di foglie. Ciò si ottiene alta pressione congelamento del tessuto fogliare, liofilizzazione fratturazione, rivestimento a doppio strato e infine l'imaging crio-SEM. L'utilizzo del metodo di rivestimento a doppio strato consente l'acquisizione di alto ingrandimento (> 100,000X) le immagini con danni raggio minimo per i campioni congelati idratata così come gli effetti di ricarica minimi. Usando le procedure descritte abbiamo studiato le alterazioni nella distribuzione del fotosistema supramolecolare e proteine antenna luce raccolta complessi che si svolgono durante la disidratazione della pianta risurrezione Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
la fotosintesi Oxygenic, originari di antica cianobatteri, fu ereditato da alghe e piante terrestri da eventi endosimbiontica che hanno portato allo sviluppo del organello cloroplasto. In tutti i fototrofi Oxygenic moderni, di trasporto degli elettroni fotosintetica e la generazione di forza proton-motrice e potere riducente sono svolte all'interno di vescicole sac-come appiattite denominati membrane 'tilacoidali. Queste membrane ospitano complessi proteici che effettuano le reazioni luce-driven di fotosintesi e forniscono un mezzo per la trasduzione di energia. Le membrane tilacoidi di piante e di (alcuni) alghe si differenziano in due domini morfologiche distinte: le regioni di membrana strettamente appressed chiamati 'grana' e membrane unstacked che interconnettono la grana, chiamati 'stroma lamelle' 1. sono stati condotti diversi studi freeze-frattura degli impianti e delle membrane tilacoidi algali, a partire dai primi anni 1970. Quando freeze-fratturato, membraneraggruppati lungo il loro core idrofobico 2, generando una faccia exoplasmic (EF) e una faccia protoplasmatico (PF), a seconda del compartimento cellulare cui i confini semi-membrana, come originariamente coniato da Branton et al. . nel 1975 3 Impianti e tilacoidi alghe hanno quattro diverse facce della frattura: EF, EFU, FP e PFU, con 's' e che denotano e regioni 'u' '' 'impilati unstacked' membrana, rispettivamente. I complessi di proteine di membrana, che non sono tagliati o rotti, hanno la tendenza a rimanere sia con la E o laterale P della membrana. Le osservazioni iniziali che le diverse facce della frattura dei tilacoidi contengono particelle di diverse dimensioni e densità 4, e le numerose indagini che seguirono, ha portato all'identificazione e correlazione tra le particelle osservate ed i complessi proteici di membrana che svolgono le reazioni luce 5-13 (vedi anche 14,15).
freesperimenti di Eze-frattura delle membrane tilacoidi sono in genere effettuate su preparazioni di cloroplasti o isolate membrane tilacoidi (ma si veda 16,17), con il rischio di ogni cambiamento di / organizzazione strutturale e supramolecolare o che possono verificarsi durante la procedura di isolamento. A seguito della frattura, repliche sono preparati mediante evaporazione del platino / carbonio (Pt / C), poi da uno spesso strato di carbonio (C), ed infine la digestione del materiale biologico 18. Repliche vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La tecnica di congelamento-frattura-replica tradizionale continua a servire come un importante strumento per lo studio della organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche e il loro adattamento al diverso, ad esempio., La luce, le condizioni di 19-23.
Nel nostro recente studio della pianta risurrezione homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, abbiamo voluto indagare i cambiamenti nell'organizzazione o supramolecolaremembrane tilacoidi f, nonché in grado di organizzazione cellulare, durante la disidratazione e reidratazione. L'unicità di specie resurrezione homoiochlorophyllous è che sono in grado di sopravvivere in condizioni di disidratazione nelle loro tessuti vegetativi (foglie), pur mantenendo la loro fotosintetico. Una volta che l'acqua è disponibile, queste piante recuperare e riprendere l'attività fotosintetica in poche ore ad alcuni giorni 25. Per questo studio, crio-scanning EM (SEM) per immagini di campioni di foglie freeze-fratturato è stato combinato con alta pressione congelamento per il campione crio-immobilizzazione. Queste procedure forniscono un mezzo per visualizzare campioni biologici congelati idratati in uno stato vicino al loro stato nativo 26. Un vantaggio principale è che i campioni vengono esaminati direttamente dopo freeze-frattura e rivestimento senza passaggi successivi. Ciò è particolarmente rilevante per l'indagine di piante a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), come il loro stato di idratazione viene mantenuto durante la preparazione. Comemai, uno svantaggio fondamentale è che i campioni congelati-idratato possono soffrire di danni fascio durante l'imaging, soprattutto quando scansione ad alti ingrandimenti, necessari per la misurazione accurata delle dimensioni di complessi fotosintetici. Per ovviare a questo, un metodo chiamato 'rivestimento a doppio strato' (DLC) 27,28 combinata con state utilizzate condizioni specifiche di imaging crio-SEM. Questi hanno portato in campioni che sono significativamente meno-fascio sensibile e ha permesso per la delucidazione delle preziose informazioni sulla proteina fotosintetica organizzazione supramolecolare e di altri costituenti cellulari della pianta risurrezione C. pumilum ad alti ingrandimenti in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica descritta in questo documento permette di indagine di membrane freeze-fratturato nel contesto dei tessuti vegetali congelati alta pressione ben conservate mediante microscopia elettronica crio-scansione. Il principale vantaggio di utilizzare queste procedure è che la preparazione del campione è puramente fisica; non sono necessarie operazioni che coinvolgono sostanze chimiche o disidratazione. Quindi, consente lo studio delle strutture biologiche in uno stato quasi native 26,32. Il vantaggio di u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Andres Kaech (Università di Zurigo) per i suoi consigli utili sulla scansione di immagini al microscopio elettronico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Stati Uniti-Israele binazionale di ricerca agricola e lo sviluppo (concessione n. US-4334-10, ZR), la Israel Science Foundation (Grant n. 1034/12, ZR), e la Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Gli studi di microscopia elettronica sono stati condotti presso l'Irving e Cherna Moskowitz Center for Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
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