Abstract
Cryo-scanning elektronenmicroscopie (SEM) van-freeze gebroken monsters maakt onderzoek naar biologische structuren op near native omstandigheden. We beschrijven een techniek voor het bestuderen van supramoleculaire organisatie van fotosynthetisch (thylakoid) membranen binnen bladmonsters. Dit wordt bereikt door hoge druk bevriezing van bladweefsel, vries-breken, double-layer coating en tenslotte cryo-SEM beeldvorming. Gebruik van een dubbele-bekleding werkwijze maakt het verkrijgen hoge vergroting (> 100,000X) met minimaal beam schade aan de bevroren gehydrateerd monsters en minimale effecten opladen. Met behulp van de beschreven procedures die we onderzoek gedaan naar de veranderingen in de supramoleculaire distributie van fotosysteem en lichte oogsten antenne eiwitcomplexen die plaatsvinden tijdens uitdroging van de opstanding fabriek Craterostigma pumilum in situ.
Introduction
Oxygenic fotosynthese, van oorsprong uit het oude cyanobacteriën, werd overgenomen door algen en landplanten door endosymbiotic gebeurtenissen die hebben geleid tot de ontwikkeling van de chloroplast organel. In alle hedendaagse oxygenic fototroof zijn fotosynthetische elektronen transport en het genereren van proton-motive force en het verminderen van de macht binnen afgeplatte sac-achtige blaasjes zogenaamde 'thylakoid' membranen uitgevoerd. Deze membranen huis van de eiwitcomplexen die de light-driven reacties van fotosynthese uit te voeren en een medium voor energie transductie. De thylakoïdmembranen van planten en (sommige) algen worden onderverdeeld in twee afzonderlijke morfologische domeinen: strak appressed membraan regio genaamd 'grana' en gestapelde membranen die de grana met elkaar te verbinden, de zogenaamde 'stroma lamellen "1. Diverse freeze-fractuur studies van planten en algen thylakoïdmembranen zijn uitgevoerd, te beginnen in de vroege jaren 1970. Bij bevriezing gebroken, membranenverdelen langs hun hydrofobe kern 2, genereren van een exoplasmatische vlak (EF) en een protoplasma vlak (PF), afhankelijk van de cellulaire compartiment dat helft membraan grenzen, zoals oorspronkelijk bedacht door Branton et al. . in 1975 3 Plant en algen thylakoiden hebben vier verschillende breuk gezichten: EF, efu, PF en PFU, met een 's' en 'u' aanduiding 'gestapeld' en 'gestapelde' membraan regio's, respectievelijk. Het membraan eiwitcomplexen, die niet gesplitst of gebroken, hebben de neiging met ofwel de E of P zijde van het membraan blijft. De initiële observaties dat de verschillende breukvlakken van de thylakoiden bevatten deeltjes van verschillende afmetingen en dichtheden 4, en de talrijke onderzoeken die volgde, leidde tot de identificatie en correlatie tussen de waargenomen deeltjes en het membraaneiwit complexen die de lichtreacties uitvoeren 5-13 (beoordelingen zie ook 14,15).
Freeze-fractuur experimenten van thylakoïdmembranen worden gewoonlijk uitgevoerd over de voorbereidingen van de chloroplasten of geïsoleerde thylakoïdmembranen (maar zie 16,17), met het risico van een wijziging in de structurele en / of supramoleculaire organisatie die zich kunnen voordoen tijdens de isolatie procedure. Na breuk worden replica's bereid door verdamping van platina / koolstof (Pt / C), vervolgens een dikke laag koolstof (C), en tenslotte digestie van het biologische materiaal 18. Replica's zijn gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De traditionele freeze-fractuur-replica techniek blijft om te dienen als een belangrijk instrument voor het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van de fotosynthetische membranen en hun aanpassing aan verschillende, bijv., Licht, condities 19-23.
In onze recente studie van de homoiochlorophyllous opstanding fabriek Craterostigma pumilum 24, we gericht op de veranderingen in de supramoleculaire organisatie o onderzoekenf thylakoïdmembranen, evenals de totale cellulaire organisatie gedurende dehydratatie en rehydratatie. Het unieke van homoiochlorophyllous opstanding soort is dat ze in staat zijn om de voorwaarden van uitdroging overleven in hun vegetatieve weefsels (bladeren), met behoud van hun fotosynthese-apparaat. Zodra water beschikbaar is, deze planten herstellen en hervatten fotosynthetische activiteit in uren tot enkele dagen 25. Voor dit onderzoek, cryo-EM scanning (SEM) beeldvorming van gevries- gebroken bladmonsters werd gecombineerd met hogedruk freezing sample cryo-immobilisatie. Deze procedures bieden een middel om de bevroren gehydrateerd biologische monsters te visualiseren in een staat dicht bij hun natieve toestand 26. Een belangrijk voordeel is dat de monsters direct na bevriezen-breuk en coating zonder verschillende stappen worden onderzocht. Dit is vooral relevant voor het onderzoek van planten op verschillende relatieve inhoud water (RWC), als hun hydratie toestand tijdens de bereiding wordt gehandhaafd. Hoeooit een belangrijke nadeel is dat bevroren gehydrateerd monsters tijdens beeldvorming kunnen lijden aan beam opleveren, met name wanneer gescand bij hoge vergrotingen, vereist voor nauwkeurige meting van de grootte van fotosynthetische complexen. Om dit te overwinnen, een methode genaamd 'double-layer coating' (DLC) 27,28 gecombineerd met specifieke cryo-SEM beeldvorming omstandigheden werden gebruikt. Deze resulteerden in monsters die zijn aanzienlijk minder beam-gevoelig en toegestaan voor de opheldering van waardevolle informatie over fotosynthetische eiwit supramoleculaire organisatie en andere cellulaire bestanddelen van de opstanding fabriek C. pumilum bij hoge vergrotingen in situ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cryo-fixatie van Leaf Tissues door Hogedruk Bevriezing
Opmerking: Dit deel beschrijft hoe uit te voeren onder hoge druk bevriezing van blad weefsels voor een freeze-fractuur experiment. Voor de overwegingen in verband met planten monsters te zien 29. Dit kan worden aangepast voor andere typen weefsels of monsters met enkele wijzigingen.
- Gebruik de hoek van een scheermesje, krassen op de bodem van de 0,1 mm holte van een 0,1 / 0,2 mm aluminium plaatjes (figuur 1). Maak minstens tien bloedplaatjes (6 monsters). Wees voorzichtig mes merken te creëren op de omtrek van de schijf.
- Na krabben, wassen schijven in absolute ethanol, laten drogen en bewaren op een schone schotel.
- Bereid de hoge druk bevriezing machine volgens de instructies van de fabrikant. Vul het hoge druk bevriezing machine alcohol kamer met isopropanol.
- Bereid een zelfgemaakte vacuüm bijgestaan infiltration apparaat om gas te vinden in het blad weefsel met vloeibare vervangen.
- Aansluitbare verbinding een 200 ul pipetpunt het einde van een 10 ml spuit. Snijd ~ 1 cm van de tip. Maak een gat in de dop van een 1,5 ml microcentrifugebuis om strak de cut tip. Vacuüm kan in de buis worden gemaakt door aan de zuiger van de spuit.
- Snijd een klein stukje blad van de plant met behulp van een scheermesje en met een pincet plaatst het blad in een microcentrifugebuis half gevuld met 1-hexadeceen. Infiltreren in de intercellulaire ruimten van het blad met de vloeistof door zachtjes trekken van de zuiger om vacuüm te creëren, houdt ongeveer 30 seconden, en dan langzaam de zuiger los.
- Verwijder het blad stuk uit de buis met behulp van een pincet. Trim het blad met een scheermesje in geval is dikker dan 0,2 mm en snijd een klein stukje dat past in een bloedplaatjes.
- Plaats een schone bloedplaatjes met de bekraste kant naar boven in de houder van de bevriezing machine en plaats de cut stuk leaf in de bloedplaatjes. Vul de resterende ruimte rondom het blad met 1-hexadeceen. Sluit de sandwich met een andere plaatjes, met de krassen tegenover het blad.
- Sluit en draai de houder en steek hem in de kamer van de machine. Druk vervolgens op de 'Jet' knop te bevriezen (~ 2100 staven voor 300-500 msec), en snel de houder te zetten in vloeibare stikstof. Haal de bevroren sandwich uit de houder met behulp van pre-gekoelde pincet, het verzorgen van de sandwich niet te breken.
Opmerking: Gesloten bevroren broodjes kunnen bevriezen gebroken onmiddellijk of bewaard in vloeibare stikstof voor later gebruik. Gebruik beschermende kleding en een veiligheidsbril bij het hanteren van vloeibare stikstof.
2. Freeze-breuk en Double-layer Coating 27,28
- Bereid de bevriezing breuk machine voor gebruik, zowel pistolen voor de verdamping van platina / koolstof (Pt / C) en koolstof, volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de Pt / C pistool op 45 graden eennd de carbon pistool op 90 graden.
- Pre-programma een bekleding schema van een 2-nm laag van Pt / C (bekledingssnelheid 0,02-0,04 nm / sec) en een 6-nm laag van koolstof (bij ~ 0,1 nm / sec).
- Voer de setup op het scherm van de freeze-fractuur machine. Selecteer een gebruikersnummer waar de coating-systeem wordt opgeslagen.
- Kies Pt / C "Layer 1 '. Selecteer een tijdsbestek, bijv., 5 min (de noodzakelijke tijd nodig om de coating te voltooien overschrijden). Gebruik de omhoog-omlaag om een dikte van 2 nm te bepalen.
- Druk op de 'Layer' knop om naar 2. Herhaal stap 2.1.1.2 Laag, behalve dat je koolstof en definiëren een dikte van 6 nm.
- Te testen en aan te passen pistool operatie.
- Selecteer 'Layer 1'. Selecteer de Pt / C pistool door het indrukken van de 'gun1 "knop en druk op de" ON "knop op de verdamping regeleenheid van de freeze-fractuur machine. Bewaken van de verdampingssnelheid en stel met behulp van de spanning en emissie knoppen until bereiken van een snelheid van 0,02-0,04 nm / sec. Druk op 'UIT' de Pt / C pistool uit te schakelen.
- Selecteer 'Layer 2'. Herhaal 2.1.2.1, behalve dat je 'GUN2' en aan te passen voor een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec.
- Pre-programma een bekleding schema van een 2-nm laag van Pt / C (bekledingssnelheid 0,02-0,04 nm / sec) en een 6-nm laag van koolstof (bij ~ 0,1 nm / sec).
- Koel de bevriezing breuk systeem etappe naar -140 ° C of -160 ° C (voor gehydrateerd of gedroogde bladeren, respectievelijk). Bevestig het vacuüm cryo shuttle transfer naar de machine en vul de kamer met vloeibare stikstof. De druk in de gekoelde vries-breuk kamer ligt gewoonlijk tussen 1-8 x 10 -7 mbar.
- Plaats een freeze breken preparaathouder (geschikt voor 3-mm bloedplaatjes) in het laadstation. Overspoelen de laadstation kamer met vloeibare stikstof.
- Plaats twee bevroren broodjes op de houder één voor één met behulp van hoge-precisie-kwaliteit pincet. Draai de eerste sandwich in de houder en klap de houder over om te controleren of het past stevig op zijn plaats. Herhaal dit voor de tweede sandwich.
- Detach de afgekoelde shuttle van het bevriezen breuk machine en sluit deze aan op het laadstation. Open de shuttle ventiel, introduceren de terugtrekkende arm in de houder en zet deze op zijn plaats. Opnieuw in te voeren de arm met de houder in de shuttle en sluit de shuttle klep met behulp van de laadstation knop. Bevestig de shuttle naar de freeze-fractuur machine en de houder te introduceren in de kamer met het terugtrekken arm. Maak de shuttle uit de machine.
- Lijn de bevriezing breuk microtoom mes om een zodanige hoogte dat het zal kloppen de top plaatjes van de broodjes.
- De microtoom mes snel breken de broodjes, en onmiddellijk op- getrokken tot contaminatie van monsters door puin vasthouden voorkomen dat het mes en draai de gekoelde sluiter boven de nieuw blootgestelde vlak op de monsters van mogelijke verontreiniging te beschermen door watermoleculen in de Kamer.
- Coat de monsters met platina en koolstof.
- Voer 'Layer 1' op de screen. Schakel de Pt / C pistool door het indrukken van de 'gun1' knop, gevolgd door de 'ON' knop. Onderzoek de verdampingssnelheid en als het eenmaal heeft bereikt 0,02 - 0,04 nm / sec, tegelijkertijd bloot de monsters en druk op de 'Measure' om de dikte van de afgezette laag te bewaken.
Opmerking: Gun wordt automatisch uitgeschakeld wanneer de dikte van de vooraf ingestelde waarde heeft bereikt. - Bedek de monsters met een foto wanneer Pt / C verdamping is voltooid.
- Druk op de 'Layer' knop om naar 'Layer 2'. Herhaal stap 2.8.1 en 2.8.2, behalve selecteren 'GUN2' (voor koolstof) en een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec.
- Voer 'Layer 1' op de screen. Schakel de Pt / C pistool door het indrukken van de 'gun1' knop, gevolgd door de 'ON' knop. Onderzoek de verdampingssnelheid en als het eenmaal heeft bereikt 0,02 - 0,04 nm / sec, tegelijkertijd bloot de monsters en druk op de 'Measure' om de dikte van de afgezette laag te bewaken.
- Verwarm de bevriezing breuk systeem etappe naar -120 ° C.
3. Cryo-scanning elektronenmicroscopie
- Bereid de scanning elektronenmicroscoop voor cryo werk.
- Selecteer Stage / Stage initialiseren in het hoofdmenu en bevestig.
- Selecteer Extra / GotO-paneel en open het paneel 'Airlock' door deze in de lijst te selecteren. Klik op 'Sluiten Column Chamber Valve' knop. Vent de microscoop kamer door te klikken op de Vent knop onder het tabblad 'Vacuum'.
- Selecteer Extra / Goto Configuratiescherm en open de 'Stage Points List' panel. Selecteer de cryo-uitwisseling plaats op het podium te verplaatsen naar de juiste coördinaten voor het accepteren van de monsterhouder. Opmerking: De "cryo-uitwisselstand 'is ingesteld om in aanpassing aan de positie van het vacuüm transporteenheid.
- Open het monster kamer met een schone paar handschoenen en steek de cryo-podium op het grote podium van de microscoop. Sluit de kamer en klik op de knop Pump onder het 'Vacuum tabblad'.
- Koel de microscoop naar -120 ° C. Vul het microscoop Dewar met vloeibare stikstof. Activeer de functie hitte op de cryo-overdracht regeleenheid -120 ˚C zodra de temperatuur van het podium daalt tot onder -120 ° C.
- attACH de cryo-overdracht shuttle naar de microscoop en de overdracht van de monsterhouder met behulp van de terugtrekkende arm in de microscoop cryo fase (zoals in stap 2.5). Maak de shuttle van de microscoop.
- Klik op de 'Open Column Chamber Valve' knop in het Airlock Panel.
- verplaats de monsterhouder in de buurt van het objectief (werk afstand 1-2 mm) voorzichtig met behulp van de joystick. Selecteer een 10-um opening in het tabblad 'openingen'. Dubbelklik op het veld EHT in het tabblad 'Gun'. Voer 10 (kV) voor de EHT target en klik op OK. Klik op het tabblad onderkant EHT en selecteer 'EHT On'.
- Selecteer 'InLens' uit de detectoren drop-down lijst in het tabblad 'detectoren'. Optimaliseer imaging voorwaarden (focus, helderheid en contrast, de koplampen, astigmatisme), naargelang het geval.
- Klik op het tabblad 'Scannen'. Kies een snelle scan ( 'Scan Speed = 1', wat overeenkomt met een verblijftijd van 100 nanoseconden per pixel) te stralen schade te minimaliseren, eneen 'Store resolutie "van 1024 x 768 pixels. Selecteer 'Line Gem' in de 'Noise Reduction' drop-down lijst. Stel de waarde van N tot 20 - 30 lijnen voor het zoeken. Verplaats het monster met behulp van de functie van het 'Centre Point' (door te drukken op de controle-tab op het toetsenbord) om te zoeken naar regio's met een gebroken cellen en chloroplasten (Figuren 2A en 2B).
- Acquire beelden van gebroken chloroplasten bij lage vergrotingen (50-70 kX) (figuur 2C en 2D). Gebruik de functie 'Centre Feature' (door te drukken control-shift-tab op het toetsenbord) in interessante chloroplast breuk gezichten te zoomen en afbeeldingen te verwerven bij hoge vergrotingen (100-200 kX figuren 3 en 4). Gebruik dezelfde parameters als in stap 3.6 voor het verwerven, maar verander de Line Gem waarde N> 100 voor ruisonderdrukking 30.
- Druk op Freeze op de belangrijkste microscoop controle-eenheid of in het tabblad 'Scannen' om het scannen te stoppen en op te slaanhet beeld door te drukken op de 'Save TIFF' knop.
4. Beeldanalyse
Opmerking: Dit deel beschrijft een korte procedure voor segmentatie van membraan deeltjes uit freeze-fractuur SEM beelden met behulp van de Fiji-31 open-source-pakket. Soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met andere beeldanalyse software.
- Open afbeelding met Fiji door image-bestand te slepen naar het hoofdvenster van het programma. Omzetten op de afbeelding om 8-bit door het selecteren van Image / Type / 8-bit. Kies Afbeelding / Aanpassen / Helderheid / Contrast en pas als dat nodig is (figuur 5A).
- Met behulp van de rechte lijn gereedschap, trek een lijn van de grootte van de ingesloten afbeelding schaal bar. Selecteer Analyseren / Set Scale. Voer de juiste schaal informatie (bekend afstand en de Eenheid van de lengte) en klik op OK. Sla deze geschaald beeld aangepast.
- Select Process / Filters / Gaussiaanse vervaging (1,5 nm straal) en klik op OK (Figuur 5B).
- Afbeelding selecteren / aanpassen / Auto Lokale Threshold (met behulp van de Niblack methode) en klik op OK (figuur 5C).
- Selecteer Bewerken / omkeren en vervolgens Proces / Binary / Watershed (figuur 5D).
- Teken een rand rond de regio van belang (ROI) met het gereedschap Selectie uit vrije hand. Voeg de selectie om de ROI manager door Bewerken / Selectie / Voeg toe aan Manager of door 't' klikken.
- Selecteer Bewerken / Clear Outside (Figuur 5E).
- Selecteer Analyseren / Set Metingen, kiest u de juiste parameters (bijv gebied, fit ellips).
- Selecteer Analyze / Analyseer Deeltjes. Voer een passend aanbod voor de grootte van de deeltjes en markeer 'Toon resultaten', 'Toevoegen aan Manager' en, indien nodig, de 'Uitsluiten op de randen' optie en klik op OK. Het resultaat wordt getoond in figuur 5F.
- Open het opgeslagen geschaald afgebeeld bestand (stap 4.2). Selecteer 'Show All' en schakel 'Labels' in de ROI Manager. Geef je mening over de geselecteerde particles gelegd op het oorspronkelijke beeld en handmatig toevoegen of verwijderen van selecties met behulp van de 'toevoegen' of 'Verwijderen' knoppen van de ROI Manager. Corrigeer selecties nodig met behulp van de functie Selectie uit vrije hand en de knop 'Update' van de ROI Manager (Figuren 5G en 5H).
- Analyseer de gegevens waarbij de verkregen metingen. In het venster Resultaten, klikt u op Resultaten / Vat te verkrijgen, bijvoorbeeld, de gemiddelde omgeving, en de gemiddelde Major en Minor assen van de in de ROI Manager opgenomen deeltjes. Klik Uitslagen / Distribution, selecteer een parameter (zoals Area) en klik op OK om een histogram voor deze parameter te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont cryo-SEM beelden van plaatjes met hoge druk bevroren, bevriezen-gebroken Craterostigma pumilum blad stukken. In sommige monsters worden grote gebieden van gebroken cellen verkregen (Figuur 1A). In andere gevallen blijft het blad stuk strak gebonden aan de bovenste schijf en wordt geklopt met zich mee (Figuur 1B). Zelfs in het tweede geval kunnen sommige bladweefsel blijft vastzitten aan het mes groeven op de bloedplaatjes (Figuur 1B, pijlpunten) en een redelijke hoeveelheid data kan nog worden verzameld door beeldvorming van het blad "restanten", mits ze gebroken waren. Na succesvolle breuk wordt gevonden, worden lage vergroting afbeeldingen cellen verworven gebieden identificeren plaats, in dit geval chloroplasten (figuur 2).
Hogere vergroting beelden van thylakoïdmembranen in C. pumilum bladeren worden getoond in figuren 3 en 4. De vier verschillende breukvlakken, EF, efu, PF en PFU kunnen worden onderscheiden (figuur 3). Fotosysteem II (PSII), welke de grootste eiwitcomplex gevonden in de membranen, is gelegen in zowel het EF (grana) en EFU (stroma lamellen). Bij gehydrateerde omstandigheden PSII dichtheid ~ 3 maal hoger dan in EFs EFU (~ 1550 um complexen -2 versus ~ 550 urn complexen -2, figuur 3). Dit is een basis voor het onderscheid tussen deze twee continue vlakken. Een ander is het verschil in hun achtergrond. Terwijl de EF achtergrond gladde weergegeven, de efu gezicht is ruw en gaten bevat die de voetafdrukken van losgemaakte PSI complexen, die breuk de complementaire gezicht, de PFU 10 (figuur 3) zijn. Een voorbeeld voor de segmentatie van PSII complexen van de EF gezicht van de thylakoidmembraan wordt getoond in figuur 5.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Tijdens uitdroging van C. pumilum, de dichtheid van PSII in de grana membranen (EF) geleidelijk afneemt, het bereiken van ongeveer de helft (~ 700 complexen micrometer -2 bij ~ 15 % RWC, figuur 4C) van hun dichtheid bij gehydrateerde omstandigheden (100% RWC, Figuur 4A) met name bij verdere uitdroging, tot 5 -. 10% RWC, PSII complexen organiseren in rijen en arrays (pijlen, figuren 4D en 4E). voor de volledige dataset, zie 24. de vorming van een dergelijke PSII arrays noodzakelijk dat sommige van hun gebonden antenne complexen, LHCII, los van PSII. Een voorbeeld van LHCII complexen in de PF in rijen georganiseerd die complementair zijn aan georganiseerde PSII complexen zou zijn (in de EF ) wordt getoond in figuur 4E (pijlpunt). PSII complexen in de matrices, alsmede de vrijstaande LHCII, waarschijnlijk in een fotochemisch afgebroken toestand waar een foto-beschermende rol. Deze structurele herschikkingen zijn een deel van de mechanismen die gebruikt worden door de opstanding fabriek C. pumilum om zichzelf te beschermen in de gedehydrateerde toestand 24.
Figuur 1. lage vergroting Cryo-SEM Beelden van Bloedplaatjes met Freeze-gebroken C. pumilum Leaf Pieces. (A) Een groot gebied van de gebroken cellen (gestippelde lijnen) van een C. pumilum blad. (B) Het blad stuk werd geklopt met de top bloedplaatjes, maar bladweefsel bleef bevestigd aan het mes merken onder bloedplaatjes (pijlpunten markeren sommige). De regio's rond het blad stukken zijn ingevroren 1-hexadeceen (sterretjes). Schaal bars. 200 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. zoemen chloroplasten. (A) Een groep gebroken fotosynthetische (mesofyl) cellen (sterretjes) van gehydrateerde bladweefsel. De meeste celvolume omvat een grote centrale vacuole, alle cytoplasmatische bestanddelen rond de vacuole in een smalle strook. (B) Twee naburige gebroken cellen - de celwand (CW) markeert de grens tussen de cellen. Vijf chloroplasten (c) zijn zichtbaar in het beeld, waarvan slechts één is gebroken (gebroken vlak aangeduid door de pijlpunt). (C en D) Voorbeelden van enkele gebroken chloroplasten van gehydrateerd (C) en gedehydrateerd (D, ~ 15% relatieve vochtgehalte [RWC]) planten. De kleine witte stippen (bijv, pijlpunten) zijn de membraaneiwit complexen gevonden binnen de thylakoïdmembranen van de chloroplast. Let op de enorme blaasjes SURRounding de chloroplast in het gedroogde blad (D). Schaalbalken: 10 urn (A); 1 pm (B); 200 nm (C en D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De Supramoleculaire organisatie van thylakoïdmembranen in plantenweefsels Een gebroken chloroplast waarin de verschillende thylakoid breukvlakken te zien. Exoplasmatische de breukvlakken (EF) van beide gestapelde (EF) en gestapelde (efu) membraan gebieden bevatten fotosysteem II (PSII) -complexen; De protoplasmische breuk gezicht van gestapelde gebieden (PFS) bevat de perifere licht-oogst antenne complexen van PSII, LHCII; Fotosysteem I (PSI) en ATP synthase breuk aan de protoplasmische breuk gezicht van gestapelde gebieden (PFU); Cytochroom b 6 f Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Veranderingen in fotosysteem II Organisatie tijdens Uitdroging van C. pumilum EF gezichten van thylakoïdmembranen plantendelen bij verschillende RWC: (A) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, en (D en E) 5-10%.. Tijdens dehydratatie, de dichtheid van PSII in de EF gezicht geleidelijk afneemt van ~ 1500 um complexen -2 (A) tot ~ 700 urn complexen -2 (~ 15% RWC, C). Met name bij drogere omstandigheden (5-10% RWC), een aantal PSII complexen organiseren in rijen en arrays (D en E, pijlen). De pijlpunt (E) markeert de PF gezicht, met LHCII antenne verschijnen ook in rijen worden georganiseerd, waartussen PSII rijen zou worden gevonden in de complementaire EF. Voor meer informatie over deze gegevens te zien 24. Schaal bars. 100 nm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Een voorbeeld voor segmentatie van fotosysteem II deeltjes. Met behulp van de Fiji-open-source pakket, eiwitcomplexen kunnen worden gesegmenteerd van de beelden met een paar stappen (compleet gedetailleerde procedure in deel 4 van de sectie Protocol). Afbeeldingen (A, original image) zijn wazig met de Gauss-filter (B); het beeld is thresholded met behulp van een auto lokale threshold gereedschap (C); het beeld wordt omgekeerd en de waterscheiding algoritme wordt toegepast om afzonderlijke objecten gevonden in nauw contact (D); een van belang wordt geselecteerd en de buitenzijde wordt gewist (E); deeltjes (binnen een ingestelde groottebereik) zijn geselecteerd met het deeltjesanalysator functie. Het verkregen masker wordt weergegeven in (F). Deeltjes worden toegevoegd aan de ROI Manager en overlay op de oorspronkelijke afbeelding (G) om te controleren op fouten of defecte of gemiste deeltjes. De lijst van de ROI's kunnen handmatig worden bewerkt, vervangen, verwijderen of toevoegen van nieuwe ROI, naargelang het geval. De eindgebruiker bewerkte selectie wordt getoond in (H). Schaal bar:. 200 nm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit document beschreven techniek maakt onderzoek gevries- gebroken membranen in de context van goed bewaarde hogedruk bevroren plantenweefsel door cryo-scanning elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van het gebruik van deze procedures is dat de bereiding van de monsters is puur lichamelijk; geen stappen met chemische stoffen of uitdroging zijn noodzakelijk. Zo staat het bestuderen van biologische structuren op een near-native state 26,32. Het voordeel van bladweefsel is dat informatie over de totale cellulaire organisatie, evenals onderzoek specifiek membranen, zoals de thylakoïdmembranen kunnen verkrijgen, binnen hun eigen fysiologische context, dat wil zeggen, in de chloroplast. Een ander voordeel, noodzakelijk om te studeren C. pumilum planten aan verschillende relatieve inhoud water (RWC), is dat hun hydratie toestand niet tijdens de bereiding wordt gewijzigd. Dit is in tegenstelling tot gebruik geïsoleerde chloroplasten of thylakoïdmembranen als uitgangsmateriaalvoor een freeze-fractuur experiment. In het laatste, men moet ook rekening mee houden dat een aantal structurele en / of supramoleculaire wijzigingen waarschijnlijk plaatsvinden tijdens organel / membraan isolement.
Werken met planten weefselmonsters, die relatief dik [> 50 - 100 urn, en kan aanzienlijk dikker afhankelijk van het type weefsel en vissoort], dicteert het gebruik van hoge druk invriezen (HPF) voor monster verglazing. Toepassing van hoge druk [2100 bar], waarbij de smelttemperatuur van water is ongeveer -22 ° C, beïnvloedt de waterstofbinding netwerk van het water zodat het vertraagt de snelheid van ijskristalvorming. Daarom is de kans op een verglaasd monster hoog zelfs bij relatief lage koelsnelheden. HPF is op dit moment de enige beschikbare methode voor verglazing van dik, maar niet meer dan 200 micrometer, samples. Een cruciale stap voor HPF van plantenweefsels is infiltratie van hun intercellulaire luchtruimten met een inert4;. Space filler "voor het invriezen, weefsel bezwijken onder hoge druk te voorkomen (zie reviews 29,33) In het geval van C. pumilum bladeren, waarvan de dikte kan tot 1 mm, de bladeren ook worden bijgesneden of verdund voorafgaand aan HPF.
In wezen kan de techniek van replica preparaat 18 ook worden toegepast tegen vorst-gebroken bladweefsel. Echter, in onze ervaring, voldoende opbrengst van intacte gebroken gebieden niet werd verkregen, omdat replica's vaak fragmenteren in kleine stukjes. Bovendien, op zoek naar een specifieke regio van belang, zoals chloroplasten kan onpraktisch binnen gefragmenteerde replica van plantaardige weefsels. Dit komt vooral omdat mesofyl (fotosynthetische) cellen bestaan uit een grote centrale vacuole omgeven door een smalle strook cytoplasma (Figuur 2A), die de kern, chloroplast en alle andere organellen omvat. Aldus chloroplasten slechts een zeer kleine fractie van de totale oppervlakte van gebrokenbladmoes weefsels. Cryo-SEM beeldvorming van gevries- gebroken monsters biedt een oplossing voor dit probleem, omdat monsters direct gevisualiseerd na breuk (en coating / schaduw). Echter, deze werkwijze heeft de beperking dat bevroren gehydrateerd monsters beam-gevoelig en derhalve scannen bij sterke vergrotingen snel beschadigt het monster op de eerste scan. Double-layer coating (DLC) 27,28 biedt een oplossing voor dit ernstige nadeel.
In DLC worden gebroken monsters gecoat op een manier vergelijkbaar met hoe ze te bereiden replica. Eerst wordt een dunne laag - is (1 3 nm) Pt / C afgedampt op het monster, die contrast en geleidbaarheid. Dit wordt gevolgd door een dikkere (5-10 nm), beschermende laag koolstof. DLC combinatie met een hoge versnellingsspanning (10 kV) werd gebruikt om beeldmonsters met de verstrooide elektronen (BSE) 28 signaal. De BSE-signaal, afkomstig van de platinalaag voor zorgt dat oppervlak informatie via het koolstofatoomen eventueel waterdamp contaminant laag die nagenoeg transparant is voor de BSE bij hoge versnelling spanningen (waterverontreiniging accumuleert in experimenten waarin een vacuüm cryo overdrachtseenheid niet wordt gebruikt en de gebroken oppervlak wordt blootgesteld aan de atmosfeer, ook al is een fractie van een seconde). Bovendien, beeldvorming met behulp van de BSE-signaal tot een minimum beperkt het probleem van het laden effecten die duidelijk in het secundair elektron (SE) detectie 27 zijn. Met de microscoop setup hier beschreven, beeldvorming van de SE signaal met de In-lens SE detector op 10 kV leverde informatie gelijkwaardig is aan die verkregen wanneer monsters uitsluitend werden gecoat met 2-3 nm Pt / C en afgebeeld bij lage voltages te versnellen. Het verschil is dat monsters bereid door DLC en afgebeeld zoals beschreven waren aanzienlijk minder licht-gevoelig. Dit stelde ons in staat om ze te scannen op hoge vergrotingen en in veel gevallen zelfs herhaaldelijk, en liet het verkrijgen van waardevolle informatie over fotosynthetische eiwit supramolecular organisatie en andere celbestanddelen (figuren 2-4) 24.
Tenslotte kan de hier beschreven procedures worden aangepast aan de structuur en / of organisatie membraaneiwit in andere soorten monsters te bestuderen. We hebben met succes gebruikt de techniek om de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen in cyanobacteriën en algen cellen te bestuderen (Shperberg-Avni et al. Ongepubliceerde gegevens). De belangrijkste overweging is het vinden van de balans tussen het hebben van een zo dun monster mogelijk om de kans op verglazing verhogen, terwijl monster intact. Voor verschillende soorten monsters, die kunnen worden suspensies of dierlijke / plantaardige weefsels dienen verschillende verpakkingen worden gebruikt (bijvoorbeeld in termen van het type bloedplaatjes gebruikt voor hoge druk bevriezen). Zodra succesvolle cryo-immobilisatie wordt bereikt, de combinatie van bevriezen-breuk, DLC en cryo-SEM beeldvorming verschaft een uitstekend middel voor het verkrijgen informatie over membraaneiwit organisatie bij een hoge vergrotingsfactor met minimale straal schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Andres Kaech (Universiteit van Zurich) voor zijn nuttig advies over het scannen van elektronen microscopie beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Verenigde Staten en Israël binationale Agricultural Research and Development Fund (verlenen no. US-4334-10, ZR), de Israel Science Foundation (verlenen nr. 1034/12, ZR) en het Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronen microscopie studies werden uitgevoerd bij de Irving Moskowitz en Cherna Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| High-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| High-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| Vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| Cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
