本文介绍了一种研究冷冻断裂植物组织的方法。将高压冷冻的叶片样品进行冷冻断裂并双层镀膜，获得保存良好的冷冻水合样品，随后使用冷冻扫描电子显微镜在高倍率下成像，且电子束损伤最小。
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方法文章
通过冷冻断裂叶片组织的低温扫描电子显微镜研究光合膜的超分子结构 关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜
本文内容
摘要
摘要
对冷冻断裂样品进行冷冻扫描电子显微镜（SEM）观察，可使生物结构在接近天然状态下得到研究。本文介绍一种用于研究叶片样品中光合作用（类囊体）膜超分子结构的方法。该方法包括对叶片组织进行高压冷冻、冷冻断裂、双层镀膜，最后进行冷冻SEM成像。采用双层镀膜技术，可在对冷冻水合样品造成最小电子束损伤和最小电荷效应的前提下，获得高倍率（>100,000X）图像。利用所述方法，我们原位研究了复苏植物Craterostigma pumilum在脱水过程中光系统及捕光天线蛋白复合物超分子分布的变化。
引言
产氧光合作用起源于古老的蓝细菌，随后通过内共生事件被藻类和陆生植物继承，从而形成了叶绿体这一细胞器。在所有现代产氧光合生物中，光合电子传递以及质子动力势和还原力的生成均发生在被称为“类囊体”膜的扁平囊状膜结构内。这些膜含有执行光合作用光反应的蛋白复合物，并为能量转换提供了介质。植物和（某些）藻类的类囊体膜分化为两个形态上不同的区域：紧密贴合的膜区称为“基粒”（grana），以及连接基粒的非堆叠膜区，称为“基质片层”（stroma lamellae）1。自20世纪70年代初以来，已开展了多项针对植物和藻类类囊体膜的冰冻断裂研究。在冰冻断裂过程中，膜沿其疏水核心裂开2，形成外裂面（exoplasmic face, EF）和原生质裂面（protoplasmic face, PF），具体命名取决于半膜所邻接的细胞区室，该术语最初由Branton et al. 于1975年提出3。植物和藻类的类囊体膜具有四种不同的断裂面：EFs、EFu、PFs 和 PFu，其中“s”和“u”分别代表“堆叠”和“非堆叠”膜区域。膜蛋白复合物在断裂过程中通常保持完整，倾向于保留在膜的E侧或P侧。早期观察发现，类囊体的不同断裂面上存在大小和密度各异的颗粒4，随后大量研究进一步揭示并建立了这些观察到的颗粒与执行光反应的膜蛋白复合物之间的对应关系5–13（亦见综述14,15）。
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方案
1. 通过高压冷冻对叶片组织进行冷冻固定
注意：本节介绍如何对叶片组织进行高压冷冻，以用于冷冻断裂实验。有关植物样品的相关注意事项，请参见29。本方法经适当修改后，也可适用于其他类型的组织或样品。
- 使用剃刀刀片的角部，在 0.1/0.2 mm 铝质载片的 0.1 mm 凹面底部进行刮擦（图 1）。至少准备十几个载片（6 个样品）。注意不要在圆盘边缘留下刀痕。
- 刮擦后，用无水乙醇清洗载片，使其自然干燥，并保存在洁净的培养皿中。
- 根据制造商的说明准备高压冷冻仪。向高压冷冻仪的酒精室中加入异丙醇。
- 自制一个真空辅助渗透装置，用于将叶片组织中的气体置换为液体。
- 将一个 200 µl 移液器吸头紧密连接到 10 ml 注射器的末端。剪去吸头约 1 cm 的尖端。在 1.5 ml 微离心管的盖子上打一个孔，使剪短后的吸头能够紧密插入。通过拉动注射器活塞可在管内产生真空。
- 使用剃刀刀片从植物上切下一小片叶片，用镊子将叶片放入装有一半 1-十六碳烯的微离心管中。通过轻轻拉动活塞产生真空，维持约 30 秒，然后缓慢释放活塞，使液体渗透进入叶片的细胞间隙。
- 用镊子将叶片从管中取出。若叶片厚度超过 0.2 mm，需用剃刀刀片修整，并切割成....
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结果
图1展示了含有高压冷冻、冷冻断裂的Craterostigma pumilum叶片片段的载片的冷冻扫描电镜图像。在某些样品中，可获得大面积的断裂细胞区域（图1A）。而在其他样品中，叶片片段仍紧密附着于上部圆盘，并随其一同被撞落（图1B）。然而，即使在第二种情况下，部分叶片组织可能仍附着在载片的刀片沟槽上（图1B，箭头所示），只要这些组织经过断裂，仍可通过成像这些叶片“残留物”获取大量数据。在找到成功断裂的区域后，首先采集细胞的低倍图像，以确定感兴趣区域，本实验中为叶绿体（图2）。
C. pumilum 叶片类囊体膜的高倍图像如图3和图4所示。可以区分出四种不同的断裂面：EFs、EFu、PFs 和 PFu（
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讨论
本文所述技术可通过低温扫描电子显微镜，在高压冷冻保存良好的植物组织背景下，对冷冻断裂的膜结构进行观察。该方法的主要优势在于样品制备过程完全为物理性操作，无需使用化学试剂或脱水步骤，因而能够以接近天然状态研究生物结构。 关键词：低温扫描电子显微镜，高压冷冻，冷冻断裂，植物组织，近天然状态26,32使用叶片组织的优点在于，可以在其天然生理环境中获得有关整体细胞结构的信息，并研究特定膜结构（如类囊体膜）。 即，位于叶绿体内部。另一个优势，对于研究而言至关重要 C. pumilum 在不同相对含水量（RWC）下取材的植物样品，其优势在于制备过程中水合状态不会发生改变，而若以分离的叶绿体或类囊体膜作为冰冻断裂实验的起始材料则不具备这一特点。此外，后者在细胞器或膜的分离过程中，很可能已发生某些结构和/或超分子水平上的改变，这一点也需予以考虑。
处理相对厚实的植物组织样本，>50 - 100 µm，且根据组织类型和物种的不同可显著更厚]，决定了必须采用高压冷冻（HPF）对样品进行玻璃化。施加高压[2,100 bar]，在此压力下.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
我们感谢苏黎世大学的Andres Kaech在扫描电子显微镜成像方面提供的宝贵建议。本研究由美国-以色列双边农业研究与发展基金（资助号：US-4334-10，Z.R.）、以色列科学基金会（资助号：1034/12，Z.R.）以及人类前沿科学计划（RGP0005/2013，Z.R.）提供资助。电子显微镜研究在魏茨曼科学研究所的欧文和切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | Bio-Lab | 052505 | |
| 异丙醇 | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-十六碳烯 | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 型载片 | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, 瑞士 | 241 | 载片直径为 3 mm，厚度为 0.5 mm（A 型），带有深度为 0.1/0.2 mm、直径为 2 mm 的凹腔。类似载片可从 Leica Microsystems 获取。 |
| 高精度镊子 | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont（瑞士）Durostar #5 型镊子；可用其他高精度镊子替代。 |
| 高压冷冻仪 | Bal-Tec | HPM 010 | 高压冷冻替代设备：1. HPF Compact 02，Wohlwend GmbH；2. HPM 010，RMC Boeckeler；3. EM PACT2，Leica Microsystems；4. EM HPM 100，Leica Microsystems；5. EM ICE，Leica Microsystems。 |
| 冷冻断裂系统 | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| 冷冻制样装载台 | Leica Microsystems | 16770228 | |
| 通用冷冻断裂样品 holder | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | 用于直径为 3 mm 的样品载体的夹持 holder |
| 真空冷冻转移 shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| 扫描电子显微镜 | Zeiss | Ultra 055 | |
| 冷冻 SEM 样品台 | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| 图像采集软件 | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| 图像分析软件 | Fiji/Image J, 美国国立卫生研究院 | http://fiji.sc/Fiji |
参考文献
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Pro....
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重印与许可
