El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
microscopía electrónica de Cryo-barrido (SEM) de las muestras de congelación-fractura permite la investigación de estructuras biológicas en condiciones nativas cerca. A continuación, describimos una técnica para el estudio de la organización supramolecular de fotosintéticos membranas tilacoides () dentro de las muestras de hojas. Esto se consigue mediante la congelación de alta presión de tejidos de las hojas, congelación-fractura, recubrimiento de doble capa y, finalmente, formación de imágenes cryo-SEM. El uso del método de recubrimiento de doble capa permite la adquisición de gran aumento (> 100,000X) imágenes con daño haz mínimo para las muestras congeladas hidratado así como los efectos de carga mínimas. Utilizando los procedimientos descritos investigamos las alteraciones en la distribución del fotosistema supramolecular y proteínas antena captador de luz complejos que tienen lugar durante la deshidratación de la planta de la resurrección Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
fotosíntesis oxigénica, originarios de la antigua cianobacterias, fue heredado por las algas y las plantas de la tierra por los acontecimientos que llevaron a endosymbiotic desarrollo del cloroplasto. En todos los oxigénica fototrofas de hoy en día, el transporte de electrones fotosintética y la generación de la fuerza protón-motriz y el poder reductor se llevan a cabo dentro de las vesículas en forma de sacos aplanados denominadas membranas tilacoides ''. Estas membranas albergan los complejos de proteínas que llevan a cabo las reacciones impulsada por la luz de la fotosíntesis y proporcionan un medio para la transducción de energía. Las membranas de los tilacoides de plantas y (algunos) las algas se diferencian en dos dominios morfológicas distintas: las regiones de membrana fuertemente adpresas llamados «grana» y las membranas apiladas que interconectan la grana, llamados 'estroma laminillas «1. Se han realizado diversos estudios de congelación-fractura de la planta y membranas tilacoides de algas, a partir de la década de 1970. Cuando por congelación fracturado, membranasdividir a lo largo de su núcleo hidrofóbico 2, generando una cara exoplasmic (EF) y una cara protoplasmática (PF), en función del compartimento celular que las fronteras de entramado de membrana, como acuñado originalmente por Branton et al. . en 1975 3 Planta y tilacoides de algas tienen cuatro diferentes caras de fractura: los EF, EFU, SLP y la UFP, con 's' y que denotan y regiones de membrana '' 'no apiladas apilados' 'U', respectivamente. Los complejos de proteínas de membrana, que no se dividen o se rompe, tienen la tendencia a permanecer ya sea con el E o P lado de la membrana. Las observaciones iniciales de que las diferentes caras de fractura de los tilacoides contienen partículas de diferentes tamaños y densidades 4, y las numerosas investigaciones que siguieron, condujeron a la identificación y correlación entre las partículas observadas y los complejos de proteínas de membrana que llevan a cabo las reacciones de luz 5-13 (véase también revisa 14,15).
Freexperimentos eze-fractura de membranas tilacoides se llevan a cabo normalmente en preparaciones de cloroplastos o membranas tilacoides aisladas (pero véase 16,17), con el riesgo de cualquier alteración en la organización estructural y / o supramolecular que pueda ocurrir durante el procedimiento de aislamiento. Después de la fractura, las réplicas se preparan por evaporación de platino / carbono (Pt / C), a continuación, por una gruesa capa de carbono (C), y finalmente digestión del material biológico 18. Réplicas se visualizan por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La técnica tradicional de congelación-fractura-réplica continúa sirviendo como una herramienta importante para el estudio de la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas y su adaptación a las diferentes, por ejemplo., La luz, las condiciones de 19-23.
En nuestro reciente estudio de la planta de la resurrección homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, que tuvo como objetivo investigar los cambios en la organización supramolecular omembranas tilacoides f, así como en la organización celular en general, durante la deshidratación y la rehidratación. La singularidad de las especies de resurrección homoiochlorophyllous es que son capaces de sobrevivir a las condiciones de desecación en sus tejidos vegetativos (hojas), al tiempo que conserva su aparato fotosintético. Una vez que se dispone de agua, estas plantas recuperar y reanudar la actividad fotosintética en cuestión de horas a unos pocos días 25. Para este estudio, EM crio-barrido (SEM) de imágenes de muestras de hojas de congelación-fractura se combinó con alta presión de congelación para la muestra crio-inmovilización. Estos procedimientos proporcionan un medio para visualizar muestras biológicas congelados-hidratados en un estado cercano a su estado natal 26. Un beneficio principal es que las muestras se examinan directamente después de congelación-fractura y revestimiento sin pasos sucesivos. Esto es particularmente pertinente para la investigación de las plantas en diferentes contenidos de agua relativos (RWC), ya que su estado de hidratación se mantiene durante la preparación. Cómosiempre, una desventaja fundamental es que las muestras congeladas hidratado pueden sufrir de daño haz durante la exploración, especialmente cuando se escanea con grandes aumentos, necesarias para la medición precisa del tamaño de los complejos fotosintéticos. Para superar esto, un método llamado "recubrimiento de doble capa '(DLC) 27,28 combinado con se utilizaron condiciones específicas de formación de imágenes cryo-SEM. Estos dieron lugar a muestras que son significativamente menos sensibles a la viga y se dejan para el esclarecimiento de información valiosa sobre la organización supramolecular proteína fotosintética y otros constituyentes celulares de la planta de la resurrección C. pumilum con grandes aumentos en situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica descrita en este documento permite la investigación de las membranas de congelación-fractura en el contexto de los tejidos vegetales congelados de alta presión bien conservados mediante microscopía electrónica de crio-escaneo. La principal ventaja de la utilización de estos procedimientos es que la preparación de la muestra es puramente físico; no hay pasos que involucran productos químicos o la deshidratación son necesarios. Por lo tanto, permite el estudio de las estructuras biológicas en un est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Andrés Kaech (Universidad de Zurich) por sus útiles consejos sobre el escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de los Estados Unidos e Israel Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (concesión no. US-4334-10, ZR), la Fundación de Ciencias de Israel (concesión no. 1034/12, ZR), y el Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Se llevaron a cabo los estudios de microscopía electrónica en el Irving Moskowitz y Cherna Centro de Nano y Bio-Imaging Nano en el Instituto de Ciencia Weizmann.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
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