Undersøgelse af Supramolekylær Organisationen af photosynthetic Membraner inden Freeze-brækkede Leaf Væv af Cryo-scanning Electron Microscopy
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
Cryo-scanning elektronmikroskopi (SEM) af fryse-brud prøver giver undersøgelse af biologiske strukturer på nær native betingelser. Her beskriver vi en teknik til undersøgelse af supramolekylær ordning af fotosyntetiske (thylakoid) membraner inden bladprøver. Dette opnås ved højt tryk indefrysning af bladvæv, fryse-frakturering, double-layer belægning og endelig cryo-SEM billeddannelse. Anvendelse af dobbelt-lags belægning metode gør det muligt at erhverve stor forstørrelse (> 100,000X) billeder med minimal stråle skade på de frosne hydreret prøver samt minimal opladning effekter. Ved hjælp af de beskrevne procedurer, vi undersøgte ændringerne i supramolekylære fordeling af fotosystem og lys høst antenne proteinkomplekser, der finder sted i løbet af dehydrering af opstandelsen plante Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
Oxygen fotosyntese, med oprindelse i det gamle cyanobakterier, blev arvet af alger og landplanter ved endosymbiotic begivenheder, der førte til udviklingen af kloroplast organel. I alle nutidens oxy- fototrofer, er fotosyntetiske elektrontransport og generering af proton-drivende kraft og reducere magt udføres inden flade sac-lignende vesikler betegnes "thylakoid" membraner. Disse membraner huse de proteinkomplekser, der udfører de lys-drevne reaktioner af fotosyntese og tilvejebringer et medium for energi transduktion. De thylakoid membraner af planter og (nogle) alger er differentieret i to forskellige morfologiske domæner: tæt tiltrykt membran regioner kaldet »grana« og stakkede membraner, der forbinder den grana, kaldet 'stroma lameller »1. Forskellige fryse-fraktur studier af planter og alger thylakoid membraner er blevet udført, starter i begyndelsen af 1970'erne. Når fryse-brækket, membraneropdelt langs deres hydrofobe kerne 2 generering af en exoplasmic flade (EF) og en protoplasmisk flade (PF), afhængigt af det cellulære rum, som de halvt membran grænser, som oprindeligt opfundet af Branton et al. . i 1975 tre Plant og alger thylakoider har fire forskellige brudfladerne: elementærfiler, EFU, PF og PFU, med 's' og 'U' betegner 'stablet' og 'stakkede "membran regioner, henholdsvis. Membranproteinet komplekser, som spaltede eller knuste, har tendens til at forblive med enten E eller P side af membranen. De første observationer, at de forskellige fraktur ansigter thylakoider indeholder partikler af forskellige størrelser og tætheder 4, og de mange undersøgelser, der fulgte, førte til identifikation og sammenhæng mellem de observerede partikler og membran protein komplekser, der udfører de lette reaktioner 5-13 (se også Bedømmelser 14,15).
FreEze-fraktur eksperimenter thylakoid membraner typisk udført på præparater af kloroplaster eller isolerede thylakoid membraner (men se 16,17), med risiko for enhver ændring i strukturel og / eller supramolekylær organisation, der kan forekomme under isolation procedure. Efter fraktur, er kopier fremstillet ved afdampning af platin / carbon (Pt / C), derefter med et tykt lag af carbon (C), og endelig spaltning af det biologiske materiale 18. Replikaer visualiseres ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). Den traditionelle fryse-fraktur-replica teknik fortsætter med at tjene som et vigtigt redskab til at studere den supramolekylære organisering af fotosyntetiske membraner og deres tilpasning til forskellige, f.eks., Lys, betingelser 19-23.
I vores seneste undersøgelse af homoiochlorophyllous opstandelse plante Craterostigma pumilum 24, vi havde til formål at undersøge ændringer i supramolekylær organisation of thylakoid membraner, såvel som i den samlede cellulære organisation, under dehydrering og rehydrering. Det unikke ved homoiochlorophyllous opstandelse arter er, at de er i stand til at overleve betingelserne for udtørring i deres vegetative væv (blade), samtidig beholder deres fotosyntetiske apparat. Når vand er til rådighed, disse planter genvinde og genoptage fotosyntetiske aktivitet inden for timer til et par dage 25. Til denne undersøgelse blev cryo-scanning EM (SEM) billeddannelse af fryse-brud bladprøver kombineret med højtryks-frysning for prøve kryo-immobilisering. Disse procedurer giver et middel til at visualisere frosne-hydreret biologiske prøver ved en tilstand tæt på deres oprindelige tilstand 26. En af de største fordel er, at prøverne undersøges direkte efter fryse-fraktur og belægning uden successive trin. Dette er særligt relevant for undersøgelsen af planter på forskellige relative vandindhold (RWC), som er fastholdt deres hydrering tilstand under forberedelse. Hvordannogensinde, en kritisk ulempe er, at frosne-hydreret prøver kan lide af stråle skader under billeddannelse, især når scannet ved høje forstørrelser, der er nødvendige til nøjagtig måling af størrelsen af fotosyntetiske komplekser. For at overvinde dette, en metode kaldet "double-layer belægning" (DLC) 27,28 kombineret med specifikke cryo-SEM imaging betingelser var udnyttet. Disse resulterede i prøver, der er betydeligt mindre stråle-følsomme og tilladt til belysning af værdifulde oplysninger om fotosyntetiske protein supramolekylær organisation og andre cellulære bestanddele af opstandelsen plante C. pumilum ved store forstørrelser in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den i dette dokument teknik tillader undersøgelse af fryse-brud membraner i forbindelse med velbevarede højtryks frosset plantevæv ved cryo-scanning elektronmikroskopi. Den største fordel ved anvendelse af disse procedurer er, at prøvefremstilling er rent fysisk; ingen trin involverer kemikalier eller dehydrering er nødvendige. Det tillader således studere biologiske strukturer på en nær-native tilstand 26,32. Fordelen ved at bruge bladvæv er, at man kan få oplysninger om den samlede cellulære org…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andres KAECH (Zürich Universitet) for hans gode råd om scanning elektronmikroskopi billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af Forsknings- og Udviklingsfond USA-Israel Binational Landbruget (bevilge nr. US-4334-10, ZR), Israel Science Foundation (bevilge nr. 1034/12, ZR), og Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). De elektron mikroskopi blev udført på Irving og Cherna Moskowitz Center for Nano og Bio-Nano Imaging på Weizmann Institute of Science.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
