Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von gefrier gebrochenen Proben ermöglicht Untersuchung biologischer Strukturen mit nahezu nativen Bedingungen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der supramolekulare Organisation von photo (thylakoid) Membranen innerhalb Blattproben. Dies wird durch die Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe erreicht, gefrier Fracturing, Double-Layer-Beschichtung und schließlich Kryo-SEM-Bildgebung. Die Verwendung der Doppelschicht-Beschichtungsverfahren ermöglicht eine hohe Vergrößerung (> 100.000 ·) Bilder mit minimaler Strahlen Schäden an den tiefgefrorenen Proben sowie minimale Aufladungseffekte zu erwerben. Mit den beschriebenen Verfahren untersuchten wir die Veränderungen in der supramolekularen Verteilung des Photosystems und lichtsammelnden Antenne Proteinkomplexe, die während der Dehydratisierung der Auferstehungspflanze Craterostigma pumilum stattfinden, in situ.
Introduction
Oxygenic Photosynthese, mit Ursprung in der alten Cyanobakterien, wurde von Algen und Landpflanzen von endosymbiontischen Ereignisse geerbt, die zur Entwicklung des Chloroplasten Organell geführt. In allen heutigen oxygenic phototrophs, photosynthetischen Elektronentransport und die Erzeugung von Protonen-Antriebskraft und Reduktionskraft innerhalb abgeflachten sackartige Bläschen genannt 'thylakoid' Membranen durchgeführt. Diese Membranen beherbergen die Proteinkomplexe, die die lichtgetriebene Reaktionen der Photosynthese durchführen und ein Medium für die Energieübertragung zur Verfügung stellen. Die Thylakoidmembran von Pflanzen und (etwas) Algen sind in zwei verschiedene morphologische Domänen unterschieden: eng anliegend Membranbereiche genannt "grana" und unstacked Membranen, die das Grana miteinander verbinden, "Stroma Lamellen" genannt 1. Verschiedene Gefrierbruch-Studien von Pflanzen- und Algen Thylakoidmembran durchgeführt wurden, in den frühen 1970er Jahren beginnen. Wenn gefrier gebrochen, Membranenaufgeteilt entlang ihrer hydrophoben Kern 2, Erzeugen einer exoplasmic Fläche (EF) und eine protoplasmatische Fläche (PF), in Abhängigkeit von der zellulären Kompartiment der die Halbmembran grenzt, wie ursprünglich von Branton geprägt et al. . 1975 3 Pflanzen- und Algen thylakoids haben vier verschiedene Bruchflächen: EFs, EFU, PFs und PFU, mit "s" und "u" bezeichnet "gestapelt" und "ungestapelt 'Membranbereiche sind. Die Membranproteinkomplexe, die nicht gespalten oder gebrochen sind, haben die Tendenz, mit entweder der E- oder P-Seite der Membran zu bleiben. Die anfänglichen Beobachtungen , die die verschiedenen Bruchflächen der Thylakoide Teilchen unterschiedlicher Größen enthalten und Dichten 4 und die zahlreichen Untersuchungen , die folgten, führte zur Identifizierung und Korrelation zwischen den beobachteten Teilchen und den Membranproteinkomplexen, die die Lichtreaktionen durchzuführen 5-13 (siehe auch Bewertungen 14,15).
freEze-Bruchversuche von Thylakoidmembran sind in der Regel auf die Vorbereitung von Chloroplasten oder isolierten Thylakoidmembran durchgeführt (siehe aber 16,17), auf die Gefahr einer inhaltlichen Änderung in strukturellen und / oder supramolekulare Organisation , die während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Folgende Fraktur werden Repliken durch Verdampfung von Platin / Kohlenstoff (Pt / C) hergestellt, dann mit einer dicken Schicht aus Kohlenstoff (C) und schließlich Verdau des biologischen Materials 18. Replikate werden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht. Die traditionelle Gefrierbruch-Replikatechnik weiterhin für die Untersuchung der supramolekulare Organisation von photosynthetischen Membranen und deren Anpassung an verschiedene, z. B. Licht, Bedingungen 19-23 als wichtiges Instrument dienen.
In unserer aktuellen Studie der homoiochlorophyllous Auferstehungspflanze Craterostigma 24 pumilum wollten wir die Veränderungen in der Supramolekularen Organisation o zu untersuchenf Thylakoidmembranen sowie in Gesamtzellorganisation während der Dehydratisierung und Rehydratisierung. Die Einzigartigkeit der homoiochlorophyllous Auferstehung Spezies ist, dass sie in der Lage sind die Bedingungen des Austrocknens, um zu überleben in ihren vegetativen Geweben (Blätter), während ihre Photosyntheseapparat zu halten. Sobald Wasser zur Verfügung steht, stellen sich diese Pflanzen und photosynthetische Aktivität wieder aufzunehmen innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen 25. Für diese Studie cryo-scanning EM (SEM) Abbilden von gefrier frakturiert Blattproben wurde in Verbindung mit Hochdruck-Gefrieren für Probe Kryo-Immobilisierung. Diese Verfahren stellen ein Mittel zur Visualisierung tiefgefrorenen biologischen Proben in einem Zustand nahe ihrem nativen Zustand 26. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Proben untersucht werden direkt nach dem Gefrierbruch und Beschichtung ohne aufeinanderfolgenden Schritten. Dies ist besonders relevant für die Untersuchung der Pflanzen bei unterschiedlichen relativen Wassergehalt (RWC), deren Hydratationszustand während der Herstellung beibehalten wird. Wieje ist ein entscheidender Nachteil, dass gefrorene hydratisierte Proben von Strahlenschäden während der Bebilderung kann leiden, insbesondere wenn sie bei hohen Vergrßerungen abgetastet, um eine genaue Messung der Grße der photo Komplexen erforderlich. Um dies zu überwinden, wird ein Verfahren 'Double-Layer – Beschichtung "(DLC) 27,28 kombiniert mit spezifischen Kryo-SEM – Bildgebung Bedingungen wurden verwendet genannt. Diese in Proben ergab , dass deutlich weniger Strahlenempfindlich sind und für die Aufklärung von wertvollen Informationen über die photosynthetische Protein supramolekulare Organisation und andere zelluläre Bestandteile der Auferstehungspflanze erlaubt C. pumilum bei hohen Vergrößerungen in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Technik in diesem Papier beschrieben ermöglicht Untersuchung von gefrier frakturiert Membranen im Zusammenhang mit gut erhaltenen Hochdruck eingefroren Pflanzengewebe durch Kryo-Rasterelektronenmikroskopie. Der große Vorteil dieser Verfahren zu verwenden, ist, dass die Probenvorbereitung rein physikalisch ist; keine Stufen Chemikalien oder Dehydrierung sind beteiligt notwendig. Somit ermöglicht es 26,32 biologische Strukturen in einer nahezu nativen Zustand zu studieren. Der Vorteil von Blattgeweben be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Andres Kaech (Universität Zürich) für seine hilfreiche Ratschläge auf Rasterelektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde von den Vereinigten Staaten und Israel Binationale landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung Fonds unterstützt (Förder-Nr. US-4334-10, ZR), der Israel Science Foundation (Grant Nr. 1034/12, ZR) und der Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Die Elektronenmikroskopie-Studien wurden an der Irving und Cherna Moskowitz Center for Nano und Bio-Nano-Imaging am Weizmann Institute of Science durchgeführt.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
