לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
קריו סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) של דגימות-שבר הקפאה מאפשר חקירה של מבנים ביולוגיים בתנאי יליד קרובים. כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד הארגון המולקולרי של פוטוסינתטיים (תילקואיד) ממברנות בתוך דגימות עלים. זו מושגת על ידי הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלה, להקפיא-שבירה, ציפוי שכבה כפולה ולבסוף הדמית קריו-SEM. השימוש בשיטה ציפוי שכבה כפולה מאפשר רכישת הגדלה גבוהה (> 100,000X) תמונות עם נזק קרן מינימלי דגימות קפואות-hydrated כמו גם אפקטים טעינה מינימלית. שימוש בהליכים שתוארו חקרנו את השינויים בחלוקה מולקולרית של מתחמי photosystem וחלבון אנטנת אור-קציר המתרחשים במהלך ההתייבשות של pumilum Craterostigma צמח תחייתו, באתרו.
Introduction
פוטוסינתזה חמצנית, שמקורם כחוליות עתיקות, ירשה אצות וצמחים קרקע על ידי אירועי endosymbiotic שהובילו להתפתחות של אברון הכלורופלסט. בכל phototrophs חמצנית ימינו, הובלת האלקטרונים פוטוסינתטיים והדור בכוח פרוטון-מניע כוח צמצום מתבצעות בתוך שלפוחית דמויי השק פחוס כינה 'תילקואיד' ממברנות. ממברנות אלה לשכן את קומפלקסי חלבוני המבצעות תגובות מונחים-האור של פוטוסינתזה ולספק בינוני עבור תמרת אנרגיה. הממברנות תילקואיד של צמחים ובעלי (חלק) אצות הם מובחנים לשני תחומים מורפולוגיים ברורים: אזורים קרום appressed בחוזקה שנקרא 'Grana' וממברנות unstacked בו מקשרים בין Grana, שנקרא 'lamellae stroma' 1. להקפיא שבר שונים מחקרים של צמח וממברנות תילקואיד אצות נערכו, החל בשנות ה -1970 המוקדמות. כאשר שבר-הקפאה, ממברנותלפצל יחד Core 2 הידרופובי שלהם, יצירת פנים exoplasmic (EF) ופנים protoplasmic (PF), תלוי בתא הסלולר אשר לגבולות חצי קרום, כפי שטבע במקור על ידי Branton et al. יש ב -1975 3 צמחים תילקואיד אץ ארבעה פרצופים שברים שונים:. מקדמי פליטה, EFu, PFS ו Pfu, עם 's' ו 'U' 'מוערם' ו 'unstacked' קרום אזורים מציינים, בהתאמה. מתחמי חלבון הממברנה, אשר אינם לפצל או שבורים, יש נטייה להישאר עם או E או P צד של הממברנה. התצפיות הראשוניות כי פניהם שבר השונים של תילקואיד מכילים חלקיקים בגדלים שונים וצפיפות 4, ואת חקירות רבות שלאחר מכן, הובילו לזיהוי קורלציה בין החלקיקים הנצפים ואת קומפלקסי חלבונים בממברנה מבצעות תגובות האור 5-13 (ראה גם ביקורות 14,15).
freEze-שבר ניסויים של ממברנות תילקואיד בדרך כלל מבוצעים על הכנות של כלורופלסטים או ממברנות תילקואיד המבודדות (אך ראה 16,17), בסיכון של כל שינוי ב מבני ו / או ארגון מולקולרי אשר עלול להתרחש במהלך ההליך בבידוד. בעקבות שבר, העתקים מוכנים ידי אידוי של פלטינה / פחמן (Pt / C), ולאחר מכן על ידי שכבה עבה של פחמן (C), ולבסוף עיכול של החומר הביולוגי 18. רפליקות הם דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM). הטכניקה להקפיא שבר-ההעתק המסורתית ממשיכה לשמש ככלי חשוב ללימוד הארגון המולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיים והתאמתנו שונים, למשל., אור, תנאי 19-23.
במחקר האחרון שלנו של צמח תחיית homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, אנו בקשנו לבחון את השינויים שחלו o הארגון המולקולריממברנות תילקואיד f, כמו גם בארגון הסלולר הכוללת, במהלך התייבשות התייבשות. ייחודו של מיני תחייה homoiochlorophyllous הוא שהם מסוגלים לשרוד בתנאים של יובש ברקמות וגטטיבי שלהם (עלים), תוך שמירה על מנגנון הפוטוסינתזה שלהם. ברגע שמים זמינים, הצמחים האלה להתאושש ולהמשיך בפעילות פוטוסינתטיים בתוך שעות עד מספר ימים 25. לצורך המחקר, EM-סריקת קריו (SEM) הדמיה של דגימות עלים שבר הקפאה אוחדה עם בלחץ גבוה קופא-וקיבוע קריו מדגם. נהלים אלה לספק אמצעי לדמיין דגימות ביולוגיות קפוא hydrated בכל מדינה קרובה למצב הטבעי שלהם 26. יתרון עיקרי אחת הוא כי דגימות נבחנות ישירות לאחר שבר הקפאה וציפוי ללא מדרגות רצופות. זה רלוונטי במיוחד לחקירת צמחים תכולי מי ביחס שונה (RWC), כמדינת הידרציה שלהם נשמרת במהלך הכנה. אֵיךפעם, חיסרון קריטי אחד הוא כי דגימות קפואות-hydrated עלולים לסבול מנזק הקורה במהלך ההדמיה, במיוחד כאשר סרק בהגדלה גבוהה, נדרש עבור מדידה מדויקת של גודל של מתחמי פוטוסינתטיים. כדי להתגבר על זה, שיטה הנקראת 'ציפוי שכבה כפולה "(DLC) 27,28 בשילוב עם תנאי הדמית קריו-SEM ספציפיים נוצלו. אלה באו לידי ביטוי דגימות כי הם פחות קורה רגיש ואפשרנו להבהרת מידע רב ערך על ארגון פוטוסינתטיים חלבון מולקולרי ומרכיבים תאיים אחרים של הצמח ותחייתו ג pumilum בהגדלה גבוהה באתרו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשר חקירה של ממברנות-שבר הקפאת בהקשר של השתמרו היטב רקמות הצמח קפוא בלחץ גבוה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים קריו-סריקה. היתרון העיקרי של שימוש נהלים אלה הוא כי הכנת מדגם היא פיזית גרידא; שום צעדי שימוש בחומרים כימיים או התייבשות נחוצים. לכן, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אנדרס Kaech (אוניברסיטת ציריך) עבור עצות מועילות שלו על סריקת הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי המחקר החקלאי הדו-לאומית ארה"ב-ישראל ופיתוח הקרן (מענק לא. ארה"ב-4334-10, ZR), הקרן הלאומית למדע (מענק לא. 1034/12, ZR), והתכנית מדע האדם Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). המחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים נערכו בבית אירווינג צ'רנה מוסקוביץ 'מרכז ננו וביו-ננו הדמיה במכון ויצמן למדע.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
