Estudar a Organização supramolecular de fotossintéticas membranas dentro de tecidos foliares Freeze-fraturados por Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
microscopia eletrônica de crio-varredura (MEV) das amostras fraturou-congelamento permite investigação de estruturas biológicas em condições nativas próximas. Aqui, descrevemos uma técnica para estudar a organização supramolecular de fotossintéticos membranas (tilacói) dentro de amostras de folhas. Isto é conseguido através de congelamento de alta pressão de tecidos foliares, congelar-fractura, o revestimento de camada dupla e, finalmente, imagiologia Cryo-SEM. A utilização do método de revestimento de camada dupla permite que a aquisição de ampliação elevada (>) 100,000X imagens com danos feixe mínima para as amostras congeladas-hidratado, bem como efeitos de carregamento mínimo. Utilizando os procedimentos descritos investigamos as alterações na distribuição supramolecular de complexos fotossistema e proteína antena luz-colheita que ocorrem durante a desidratação da planta ressurreição Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
fotossíntese aeróbica, originários de cianobactérias antiga, foi herdada por algas e as plantas terrestres por eventos endosymbiotic que levaram ao desenvolvimento da organela cloroplasto. Em todos os fototróficas oxigênicos modernos, fotossintética de transporte de elétrons ea geração de força motriz protónica e poder redutor são realizadas dentro de vesículas saco-como achatadas denominadas membranas 'tilacói'. Estas membranas abrigar os complexos de proteínas que realizam as reações luz-driven de fotossíntese e fornecem um meio para a transdução de energia. Os tilacóides de plantas e (alguns) algas são diferenciados em dois domínios morfológicas distintas: regiões da membrana firmemente apresso chamados «grana» e membranas não empilhados que interligam a grana, chamados 'estroma lamelas «1. Foram realizados vários estudos de fractura por congelação de plantas e tilacóides de algas, começando no início de 1970. Quando fraturou-congelantes, membranasdividido ao longo do seu núcleo hidrofóbico 2, gerando uma face exoplasmic (EF) e uma cara de protoplasma (PF), dependendo do compartimento celular onde as fronteiras meia-membrana, como originalmente inventado por Branton et ai. ., em 1975 3 Plant and thylakoids algas têm quatro diferentes faces da fratura: FE, EFU, PFs e UFP, com 's' e que denotam e regiões 'U' 'empilhados' 'unstacked' de membrana, respectivamente. Os complexos de proteína da membrana, que não são divididos ou partidos, têm a tendência de permanecer tanto com a E ou P lado da membrana. As observações iniciais de que as diferentes faces de fratura dos tilacóides contêm partículas de diferentes tamanhos e densidades de 4, e as numerosas investigações que se seguiram, levou à identificação e correlação entre as partículas observadas e os complexos de proteína de membrana que realizam as reações luz 5-13 (ver também analisa 14,15).
freexperimentos Eze-fratura de tilacóides são normalmente realizados em preparações de cloroplastos ou tilacóides isolados (mas veja 16,17), correndo o risco de qualquer alteração na organização estrutural e / ou supramolecular que podem ocorrer durante o processo de isolamento. Seguindo fractura, réplicas são preparados por evaporação de platina / carbono (Pt / C), seguida por uma camada espessa de carbono (C), e, finalmente, a digestão do material biológico 18. Réplicas são visualizados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A técnica de congelamento e fratura-replica tradicional continua a servir como uma importante ferramenta para o estudo da organização supramolecular das membranas fotossintéticas e sua adaptação a diferentes, por exemplo., Luz, condições 19-23.
Em nosso estudo recente da planta de ressurreição homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, que teve como objetivo investigar as mudanças na organização supramolecular omembranas de f tilacói, bem como na organização celular em geral, durante a desidratação e reidratação. A singularidade da espécie ressuscitados homoiochlorophyllous é que eles são capazes de sobreviver em condições de dessecação nos seus tecidos vegetativos (folhas), mantendo a sua aparelho fotossintético. Uma vez que a água está disponível, essas plantas se recuperar e retomar a atividade fotossintética dentro de horas a poucos dias 25. Para este estudo, EM crio-varredura (MEV) de imagem de amostras de folhas fraturou-congelamento foi combinado com a alta pressão de zero por amostra crio-imobilização. Estes procedimentos fornecem um meio de visualizar amostras biológicas frozen-hidratado em um estado perto de seu estado nativo 26. Um dos principais benefícios é que as amostras são examinadas logo após congelação-fractura e revestimento sem etapas sucessivas. Isto é particularmente relevante para a investigação de plantas em diferentes teores de água relativo (RWC), como seu estado de hidratação é mantido durante a preparação. Comosempre, uma desvantagem crítica é que as amostras congeladas-hidratado podem sofrer danos durante o feixe de imagem, especialmente quando digitalizada a elevadas ampliações, necessários para a medição exacta da dimensão dos complexos fotossintéticos. Para superar este problema, um método chamado de "revestimento de camada dupla" (DLC) 27,28 combinados foram utilizados com as condições específicas de imagens crio-SEM. Estes resultaram em amostras que são significativamente menos sensível-beam e permitiu a elucidação de informações valiosas sobre a organização supramolecular proteína fotossintética e outros constituintes celulares da planta ressurreição C. pumilum em grandes ampliações in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica descrita neste artigo permite a investigação de membranas fraturou-congelamento dentro do contexto de alta pressão tecidos vegetais congelados bem preservados por microscopia eletrônica de crio-digitalização. A principal vantagem da utilização destes procedimentos é que a preparação da amostra é puramente físico; há etapas que envolvem produtos químicos ou desidratação são necessárias. Assim, ele permite estudar estruturas biológicas em um estado quase original 26,32. O benefíc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Andres Kaech (Universidade de Zurique), por sua conselhos úteis sobre a digitalização de imagens de microscopia eletrônica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Estados Unidos-Israel Binacional Pesquisa e Desenvolvimento Agrícola (conceder no. US-4334-10, ZR), o Israel Science Foundation (conceder no. 1034/12, ZR), ea Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Os estudos de microscopia eletrônica foram realizados no Irving e Cherna Moskowitz Centro de Nano e Nano Bio-imagem latente no Instituto Weizmann de Ciência.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
