Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Center for Biomedical Experimentation aan Gyeongsang National University.
1. De voorbereidingen voor de Animal Procedure
- Bereid de volwassen vrouwelijke minivarkens voor de niet-invasieve verzameling MSCs uit beenmerg en synoviaal vocht. Voer het klinisch onderzoek van de minivarkens een dag voorafgaand aan de anesthesie en monstername.
- Zorg voor klinisch normale dieren voor lichamelijke onderzoeken, die de lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag, en voor de observatie van de varkens 'gedrag en hematologische status omvatten, met behulp van volledig bloedonderzoek testen.
Opmerking: Parameter intervallen voor klinisch gezond minivarkens zijn 11-29 / min voor de ademhalingsfrequentie, 68-98 / min voor de hartslag en 37-38 ° C voor de lichaamstemperatuur.
- Zorg voor klinisch normale dieren voor lichamelijke onderzoeken, die de lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag, en voor de observatie van de varkens 'gedrag en hematologische status omvatten, met behulp van volledig bloedonderzoek testen.
- Verwijder al eetbaar strooisel uit de kooi tijdens de pre-operatieve periode van vasten van 6-12 uur prior aan de administratie van de anesthesie voor jonge en volwassen minivarkens, moeten 3 uur van vasten in acht worden genomen voor de pasgeborenen. Leveren drinkwater tot de tijd van de anesthesie.
2. Voorbereiding van de dieren voor Anesthesie
- Medicijnen de minivarkens voor toediening van anesthesie met acepromazine (0,1 mg / kg), medetomidine (0,03 mg / kg), en atropine (0,04 mg / kg).
- Injecteer medicatie intramusculair (IM) met een 21 G naald met een lengte van minimaal 30 mm voor volwassen varkens. Voer de IM injectie 1-3 cm achter het oor in de laterale cervicale spier of in de dijspier.
Opmerking: Voer alle procedures zonder het opwekken van angst of stress bij de dieren of die ruwe behandeling om veilig te injecteren de premedicatie.
- Injecteer medicatie intramusculair (IM) met een 21 G naald met een lengte van minimaal 30 mm voor volwassen varkens. Voer de IM injectie 1-3 cm achter het oor in de laterale cervicale spier of in de dijspier.
- Plaats de mini varkens in een dorsale-liggende positie.
- Vijftien minuten na de toediening van de premedicatie, initiëren anesthesie met behulp van 1,5% isofluraan adminmeldden zich bij inademing.
- Verdere inademing van isofluraan (1,5%) door een endotracheale buis, gevolgd door een toename van de concentratie tot 2,5%, met zuurstof (1,5 l / min) als draaggas.
- Permanent toezicht op de hartslag, lichaamstemperatuur, en percutane bloed zuurstofverzadiging (SpO 2) van de minivarkens tijdens anesthesie. Gebruik een circulerende water deken bij een temperatuur van 38-39 ° C tot lichaamstemperatuur te handhaven. Breng een oogheelkundig zalf om de ogen te beschermen tegen uitdroging tijdens de anesthesie.
- Volg Guedel's indeling om de diepte van de anesthesie 13 te beoordelen.
3. Voorbereidingen voor Cell Isolatie en Teelt
- De MSCs afgeleid van beenmerg en synoviaal vocht cultiveren, bereiden 500 ml advanced Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (ADMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basische fibroblast growth factor (bFGF), en 1,0% penicilline-streptomycine (10.000 IE en 10.000 pg / ml, Pen-Strep).
- Incubeer de ADMEM bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 in een CO2 incubator.
- Bereid 500 ml Dulbecco's fosfaat- gebufferde zoutoplossing (DPBS) volgens de instructies van de fabrikant voor celisolatie en wassen.
4. Het verzamelen van beenmerg van de minivarkens
- Selecteer een gebied van ongeveer 15 x 15 cm groot op het bekken (figuur 1) en verwijder het haar van dit gebied met behulp van gesteriliseerde veiligheid scheerapparaten of elektrische tondeuse. Zodra de minipig gepositioneerd, afwisselend scrub de procedure ter driemaal met de volgende sterilisatiemiddelen: povidon jodium en 70% ethanol. Nadat het gebied is goed droog, gelden steriele doeken.
- Voorbekleding de 10 ml spuit met 100 U / ml heparine door spoelen met 3-4 ml heparine voor ejecting anti-coagulatiemiddel.
Let op: Voer deze stap om stolling in de spuit tijdens beenmergpunctie te voorkomen. - Extract minstens 5 ml van beenmerg uit het bekken bot van de minipig onder anesthesie, met een beenmerg extractor (3,0 x 100 mm) stevig aan heparine voorbekleed 10 ml spuit.
5. Isolatie van cellen uit het beenmerg en in vitro Teelt
- Isoleer de cellen van de geëxtraheerde beenmerg.
- Verdun het beenmerg geëxtraheerd met een gelijk volume van DPBS in een 15 ml conische buis bij kamertemperatuur.
- Voeg 3 ml dichtheidscentrifugatie media (Ficoll-Paque) aan de 15 ml conische buis.
- Verdun een 4 ml laag van het beenmerg met DPBS, dat op de dichtheid centrifugatie medium zonder menging wordt geplaatst en Centrifugeer bij 400 xg gedurende 40 min bij kamertemperatuur.
- Oogst de laag van mononucleaire cellen(MNC) van de bufferlaag tussen de twee lagen die de plasma (bovenlaag) en de dichtheid centrifugatie media (onderste laag) en breng de MNCs in een 15 ml conische buis.
- Verdun het overgedragen MDL met 7-8 ml DPBS en centrifugeer ze bij 500 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was de cellen tweemaal met DPBS.
- Suspendeer de celpellet in 2 ml ADMEM en overbrengen naar een 35 mm weefselkweekplaat. Incubeer de kweekschaal bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
- In vitro kweken van cellen die zijn geïsoleerd uit beenmerg.
- Na 48 uur, zuig het medium met de cellen die niet aan de schaal en plaats 2 ml van de ADMEM en incubeer deze bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Verander het medium om de drie dagen.
- Bij 70-80% confluentie was de cellen met DPBS, dissociëren ze met 1 ml 0,25%trypsine / EDTA en incubeer ze op 37 ° C gedurende 3-5 minuten totdat de cellen los.
- Oogst de cellen met behulp van 10 ml ADMEM, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
- Suspendeer de cellen geoogst in 1 ml verse ADMEM en tellen met een hemocytometer.
- Plaats de cellen in een 5-7,5 x 10 5 / 25T kolf met 4 ml ADMEM en incubeer ze op 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Verander het medium elke derde dag.
6. Het verzamelen van de gewrichtsvloeistof uit de minivarkens
- Net als bij de procedure voor het beenmerg aspiratie, selecteert u de juiste oppervlakte van ongeveer 15 x 10 cm (lengte / breedte) over de femorale gewricht, en verwijder het haar met behulp van gesteriliseerde veiligheid scheerapparaten of elektrische tondeuse, te volgen door sanering procedures (stap 4.1).
- Plaats een 3 ml spuit met een 23 Gnaald in het gewricht na de palpatie monumenten (knieschijf en scheenbeen kuif).
- Solliciteer zachte zuigkracht naar de spuiten voor het streven van de gewrichtsvloeistof in het gewricht. Het geschatte hoeveelheid gewrichtsvloeistof vanuit een gewricht 0,5-1 ml, maar afhankelijk van de grootte van de minipig of gewricht. Doorspoelen DPBS in de synoviale holte wanneer het verzamelde volume van de gewrichtsvloeistof te klein.
- Onmiddellijk terug te trekken van de spuit om besmetting met bloed voorkomen.
7. Cel Isolatie van de Verzamelde gewrichtsvloeistof en in vitro Teelt
- Isoleer de cellen van de synoviale vloeistof afgezogen.
- Verdun de afgezogen synoviale vloeistof met een gelijk volume van DPBS in een 15 ml conische buis bij kamertemperatuur.
- Om vuil te verwijderen, filteren de verdunde gewrichtsvloeistof met behulp van een 40 pm nylon cel zeef.
- Voeg 10 ml van DPBS om de buis met het gefilterde synovialevloeistof en Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was de cellen tweemaal met DPBS.
- Suspendeer de celpellet in 2 ml ADMEM, plaatst de cellen op een 2-3 x 10 5 cellen / 35 mm weefselkweekplaat met 2 ml ADMEM en incubeer ze op 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
- Herhaal stap 5.2 voor de in vitro kweek van geïsoleerde synoviale vloeistof afgeleide MSCs.
8. Post-procedure Onderhoud van de minivarkens
- Indien nodig, sluit de huid op het beenmerg extractor injectieplaats met een hechtdraad met een huid nietmachine, na beenmergafname.
- Nadat de procedure is voltooid, bestuurt een intramusculaire injectie enrofloxacine (5 mg / kg) en meloxicam (0,2 mg / kg) aan de minivarkens keer per dag gedurende 3 dagen.
- Nadat de procedure is voltooid, desinfecteren beenmerg en synoviaal vocht verzamelplaatsmet 0,1% povidonjodium eenmaal daags gedurende 3 dagen. Zorgvuldig te observeren dagelijks te controleren op tekenen van complicaties (zoals zwelling, pus of roodheid).
9. Cel Fenotypering Met behulp van flowcytometrie
- Wanneer de MSC's zijn 70-80% confluent bij passages 3-5, was de cellen met DPBS en te behandelen met 1 ml 0,25% (v / v) trypsine / EDTA. Dan, incubeer ze op 37 ° C gedurende 3-5 minuten totdat de cellen worden losgemaakt.
- Oogst de cellen met behulp van 10 ml van DPBS, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Om de cellen te bevestigen, schorsen de celpellet in 10 ml van een 3,7% formaldehyde-oplossing en bewaar ze bij 4 ° C gedurende één dag vóór de analyse.
- Een dag na de vaststelling, was de cellen met DPBS tweemaal met behulp van centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten per keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Suspendeer de celpellet in 4 mlDPBS, dat wordt aangevuld met 1% (w / v) runderserumalbumine (BSA), en incubeer de pellet gedurende 1 uur bij 4 ° C om niet-specifieke Fc-gemedieerde interacties te blokkeren.
- Verdeel 500 ul aliquots van de celsuspensie in 1,5 ml buizen.
- Voor niet-geconjugeerde antilichamen (CD29 en vimentine), was de cellen door centrifugatie bij 300 x g gedurende 3 minuten. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Suspendeer de celpellet in 500 ui van een 1: 100 verdunning van het primaire antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Was de cellen tweemaal met 1% runderserumalbumine door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten elke keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Suspendeer de celpellet in 500 ui van een 1: 100 verdunning van het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd secundair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
- Voor de FITC-geconjugeerde antilichamen (isotype, CD34, CD44 en CD45), was de cellen door centrifugaleking bij 300 x g gedurende 3 minuten. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Suspendeer de celpellet in 500 ui van de 1: 100 FITC-geconjugeerd antilichaam en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
- Voor beide kleuring omstandigheden was de cellen tweemaal met DPBS door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten elke keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
- Suspendeer de cellen in 500 gl DPBS, overbrengen naar een 5 ml rondbodem buis en analyseren van de resultaten met een flow cytometer 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprichting van MSC's Afgeleid van het beenmerg en gewrichtsvloeistof van minivarkens
MSCs werden succesvol geïsoleerd uit het beenmerg en articulaire synoviale gewrichten van de minivarkens en uitgebreid in vitro (figuur 2). Injectiespuit aspiratie van gewrichtsvloeistof is eenvoudig en is het mogelijk om voldoende hechtende cellen in in vitro kweek van de primaire cellen te verkrijgen. De morfologie van synoviale vloeistof-afgeleide MSCs is vergelijkbaar met die van uit beenmerg afgeleide MSCs en beide MSCs een fibroblastische spil vorm en zijn homogeen hechtend. Zij werden behandeld, een positieve uitdrukking voor alkalische fosfatase (AP) kleuring hebben, na de derde subcultuur voltooid was.
Evaluatie van de Cell fenotype van MSC's Afgeleid van het beenmerg en gewrichtsvloeistofvan minivarkens
Assays van het celoppervlak markers zijn uitgevoerd volgens een fenotype van het beenmerg en synoviaal vocht-afgeleide MSCs van minivarkens creëren. Beide soorten MSCs uitgedrukt aanzienlijke hoeveelheden positieve celoppervlak markers, zoals CD29, CD44, vimentine en (≥96 - 99% van de positieve cellen), terwijl de uitdrukking van CD34 en CD45 waren negatief en lage (≤2% van de positieve cellen) (Figuur 3). Deze resultaten waren identiek aan die verkregen uit onderscheidend MSCs, inclusief cellen geïsoleerd uit gewrichtsvloeistof, en er waren geen significante verschillen in celoppervlak markers onder deze MSCs. De cellen geïsoleerd uit het beenmerg en gewrichtsvloeistof zijn bevestigd als MSC's in onze vorige studie 8. Zowel beenmerg en synoviaal vloeistof verkregen MSCs expressie stamcellen transcriptiefactoren (Oct3 / 4, Nanog en Sox2); bovendien een in vitro differentiatie vermogen hzoals bevestigd niet alleen in de mesenchymale stam (osteocyten, adipocyten en chondrocyten), maar ook neurale cellen door cytochemische kleuring en detectie van celspecifieke genexpressie 8.
Figuur 1. Locatie van het bekken van de minipig. De rode pijl geeft de site op het bekken gebruikt voor het beenmerg collectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. MSCs afgeleid van het beenmerg en synoviaal vocht van varkens. (A) De homogene morfologie van primaire kweken van MSC's onthulde een fibroblast vorm. (B) kleuring met mengsel van5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat en nitroblauwtetrazolium (BCIP / NBT) is gebleken AP activiteit in de MSC's bij passage 3. Schaal bar: 100 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van het celoppervlak markers van MSCs afgeleid van het beenmerg en synoviaal vocht van minivarkens bij passage 3. celoppervlak markers van MSCs werden geïdentificeerd onder toepassing van een flowcytometrie-analyse, en MSCs werden geïdentificeerd als positief voor CD29, CD44 en Vimentin en negatief voor CD34 en CD45. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minivarkens werden gebruikt om MSC isolatie stellen uit beenmerg en synoviaal vocht. Om verschillende fysiologische omstandigheden, zoals leeftijd, geslacht en ziekte uit te roeien, minivarkens van isogene achtergrond donoren werden gekozen om de celbron afhankelijke karakterisering accuraat evalueren. Varkens is bekend dat anatomisch, fysiologisch en genetisch vergelijkbaar met de mens, in het bijzonder, kan minivarkens grootte aangepast organen te produceren; Daarom kunnen ze worden gebruikt als vervanging donor soort voor xenotransplantatie 14,15. Wat de recent voorgestelde immunomodulerende eigendom van MSCs, indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) en stikstofoxide synthase (NOS) werden gebruikt MSCs voor immunosuppressie, die soortspecifiek mediëren, hoewel MSC's van varkens en mensen dezelfde IDO 9 . Zo zou een varkensmodel als MSCs donor belangrijke inzichten van de immune reacties van menselijke MSCs therapieën. Bovendien is het onderzoek van de varkens steelcellen speelt een belangrijke rol bij de biologische begrip van in vitro werkwijzen en hun verschillende preklinische toepassingen bij de mens 16,17. Beenmerg en gewrichtsvloeistof kan non-invasief geoogst van minivarkens zijn. De gehele procedure, van anesthesie collectie proeven, verminderde het stressniveau van systemische of lokale organen; Daarom kan minivarkens worden gebruikt als ontvangers voor autologe transplantatie. In dit experiment werden MSCs geïsoleerd uit het beenmerg en synoviaal vocht van minivarkens, gebaseerd op de bevestiging van synoviale vloeistof afgeleide MSCs met immunosuppressie capaciteiten afgeleid van een RA muismodel in een eerdere studie 8
Het verzamelen van beenmerg van de minivarkens
Bij varkens, volwassen stamcellen afkomstig uit beenmerg zijn multipotente en hebben geïnduceerde neovascularisatie en cardiomyocyt regeneratie. De leeftijd van de donor wordt geassocieerd met een verhoogd vetgehalte enverminderde proliferatie en differentiatie van het beenmerg; Daarom beenmerg niet de beste bron van MSCs bij oude dieren. Het bekken in minivarkens is de beste plaats voor het beenmerg-afgeleide MSC isolatie, want het is breed en is een laag risico procedure site voor heupzenuw schade. Bij oude of overgewicht minivarkens, kan vet verrijkte dikke spieren aanwezig op het bekken zijn. Onder dergelijke omstandigheden stekende insnijding op de huid is nodig en het beenmerg biopsienaald moet goed geplaatst, die moeilijk kan worden toegepast op het bekken. Niet de juiste biopsieplaats kan leiden tot mislukte beenmerg wensen omdat de naald wordt geblokkeerd door het bot of niet in staat zijn om het beenmerg in het bekken te helpen realiseren. Daarom moet de biopsienaald goed worden gecontroleerd, en kennis van de dikte van het zachte weefsel en de cortex van het bot van het bekken is vereist voor het begin stalenverzamelingen.
aspiratie van de gewrichtsvloeistof uit de gewrichten van minivarkens
Gewrichtsvocht bestaat in de holte van synoviale gewrichten, en het volume van synoviale vloeistof wordt gewoonlijk verhoogd in ontstoken gewrichten. -Synoviale vloeistof afgeleide MSCs zijn ontleend voorkeur kandidaatsites voor herstel van kraakbeen, zowel in vivo als in vitro. Bovendien bleken ze immunomodulerende eigenschappen lokken RA 8. Gewrichtsvocht is niet alleen een gemakkelijk toegankelijke bron maar ook waardevolle mesenchymale eigenschappen. Beperkingen van het gebruik gewrichtsvloeistof als bron voor MSC's zijn de verschillende volumes in de gewrichten basis van de verschillende afmetingen en pathologische aandoeningen van de gewrichten en de moeilijkheid bij het gebruik van een 3 ml spuit voor gewrichtsvocht aspiratie van de gewrichten. Derhalve moet de omvang van de spuit worden 5-10 ml met hoge druk. Bovendien, het spoelen van de synoviale vloeistof met 1-2 ml van DPBS uit een injectiespuitde voorkeur. Door deze werkwijze kan een groot aantal cellen worden verkregen, zelfs van kleine ruimten in de gewrichten.
Karakteriseringen van de Bone-marrow- en-Synoviaal vloeistof afgeleide MSC's van minivarkens
Bij mensen is het morfologieën van synoviale-vloeistof- en synoviale membraan-afgeleide MSCs van artrose patiënten vergelijkbaar maar smaller dan de morfologie van beenmerg afgeleide MSCs 12. In in vitro kweken, de morfologie van zowel synoviale vloeistof-afgeleide MSCs en beenmerg-afgeleide MSCs werden waargenomen vergelijkbaar in dit experiment zijn. In eerdere studie van de onderzoekers, de proliferatie vermogen van synoviale vloeistof-afgeleide MSCs hoog was, vergeleken met die van been merg afgeleide MSCs 8.
MSC's zijn vastgesteld op basis van verschillende bronnen weefsel bij volwassen donoren; Daarom, niet-invasief verkregen weefsel-source-afgeleide MSC's zijn waardevol voor autologe stamceltransplantatie therapy. De bron van cellen is afhankelijk van de karakteristieken en de capaciteiten van de ziekte of het doel van de stamcel therapie. Bij varkens, volwassen stamcellen afkomstig uit beenmerg zijn multipotente en hebben geïnduceerde neovascularisatie en cardiomyocyt regeneratie 18,19. MSCs zijn voornamelijk geïsoleerd uit beenmerg, maar ook uit het periosteum, skeletspieren, synovium, navelstrengen en tandweefsel, hoewel cellen verkregen uit deze weefsels is niet eenvoudig en kan extra chirurgische procedures voor de patiënten vereisen. De omvang van de gewrichtsvloeistof verhogen in het algemeen in de gewrichten van artrose of RA patiënten en biopten van deze verhoogde synoviale vloeistoffen worden gebruikt voor de diagnose en behandeling van patiënten. Het aantal MSC's verhoogt ook in de synoviale vloeistof van patiënten met osteoartritis kraakbeen en gedegenereerde 20.
In dit onderzoek werden de cel fenotypes van bot-marrow- en synoviale vloeistof-afgeleide MSC's geëvalueerd, eend beide MSCs gepresenteerd gelijke expressieniveaus van celoppervlak markers. Daarom cellen geïsoleerd uit gewrichtsvloeistof en bevestigd MSCs vergelijkbare fenotypen naar beenmerg afgeleide MSCs varkens. eerder onderzoek van de onderzoekers geëvalueerd andere celoppervlak markers zoals CD90 en grote histologisch en complexe klasse II (MHC II), en bevestigde een capaciteit voor multi-lijn differentiatie in de osteocyten, adipocyten, chondrocyten en neuronen van synoviale vloeistof afgeleide MSC's uit minivarkens 8. Bij mensen is het celoppervlak antigen profiel van synoviale vloeistof-afgeleide MSCs is vergelijkbaar met die van synoviale-membraan- 2,21 en beenmerg-afgeleide MSCs. Echter, CD34 en CD45 uitdrukkingen werden niet gedetecteerd in MSC's afkomstig van gewrichtsvloeistof in kaakgewricht stoornis patiënten. Aldus kunnen de micro in de verbinding de cel fenotype van MSC's afkomstig van gewrichtsvloeistof beïnvloeden. In dit experiment werden de cellen verkregen van het bot marrow en gewrichtsvocht van minivarkens met behulp van niet-invasieve methoden. Beide typen in vitro gekweekte cellen werd bevestigd als MSCs, en zij hadden dezelfde celfenotypen en gedeelde compatibel mesenchymale eigenschappen. Echter, synoviale vloeistof-afgeleide MSCs vertoonden een groter potentieel voor autologe stamcel therapie voor niet alleen kraakbeen en botregeneratie maar ook voor immunosuppressie van artrose en RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
