Protocol
Hayvan deneyleri Gyeongsang Ulusal Üniversitesi Biyomedikal Deney için hayvan Merkezi tarafından onaylanmıştır.
Hayvan Prosedür 1. Hazırlıklar
- kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MKH non-invaziv toplama yetişkin dişi mini-domuzlarda hazırlayın. Anestezi ve örnek koleksiyonuna bir gün önce mini-domuzlarda klinik muayene gerçekleştirin.
- tam kan sayımı testleri kullanılarak vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı ve domuz davranışları ve hematolojik durumların gözlenmesi için dahil fizik muayene, klinik olarak normal bir hayvan sağlayın.
Not: klinik olarak sağlıklı mini-domuzlarda için parametre aralıkları 11 olan - solunum hızı 29 / dk, 68 - kalp hızı için 98 / dk ve 37 - vücut sıcaklığının 38 ° C.
- tam kan sayımı testleri kullanılarak vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı ve domuz davranışları ve hematolojik durumların gözlenmesi için dahil fizik muayene, klinik olarak normal bir hayvan sağlayın.
- 12 saat prio - 6 ameliyat öncesi açlık süresi boyunca kafesinden tüm yenilebilir yatak kaldırGenç ve yetişkin mini-domuzlarda anestezi idaresine r açlık 3 saat yenidoğanlar için dikkat edilmelidir. Anestezi zamanına kadar içme suyu sağlamak.
Anestezi için Animals 2. Hazırlık
- asepromazin (0.1 mg / kg), medetomidin (0.03 mg / kg) ve atropin (0,04 mg / kg) ile anestezi uygulanmadan önce mini-domuzlarda ilaçla tedavi.
- Yetişkin mini-domuzlarda için en az 30 mm bir uzunluğa sahip olan bir 21 G iğne kullanılarak tüm ilaçlar kas içinden (İM) enjekte edilir. Lateral servikal kas içine ya da uyluk kası içine IM enjeksiyonu kulak arkasında 1-3 cm gerçekleştirin.
Not: Hayvanlarda korku ya da stres eliciting veya güvenli premedikasyon enjekte kaba işleme gerek kalmadan tüm işlemleri gerçekleştirin.
- Yetişkin mini-domuzlarda için en az 30 mm bir uzunluğa sahip olan bir 21 G iğne kullanılarak tüm ilaçlar kas içinden (İM) enjekte edilir. Lateral servikal kas içine ya da uyluk kası içine IM enjeksiyonu kulak arkasında 1-3 cm gerçekleştirin.
- dorsal yatar pozisyonda mini-domuzlarda yerleştirin.
- Onbeş dakika premedikasyon verilmesinden sonra,% 1.5 izofluran yönetici kullanarak anestezi başlatmakTeneffüs yoluyla listesinde de¤ildir.
- Taşıyıcı gaz olarak oksijen ile% 2.5 konsantrasyonunda bir artışa ve ardından bir endotrakeal tüp aracılığıyla izofluran (% 1.5) ve inhalasyon, (1.5 L / dakika) devam edin.
- Sürekli anestezi sırasında mini-domuzlarda kalp hızı, vücut ısısı ve perkütan kan oksijen doygunluğu (SpO2) izler. vücut ısısını korumak için 39 ° C - 38 arasında bir sıcaklıkta bir dolaşım suyu battaniye kullanın. anestezi sırasında kurumasını gözleri korumak için bir göz merhemi sürün.
- Anestezi 13 derinliğini değerlendirmek için guedel tasnifini izleyin.
Hücre İzolasyonu ve Yetiştirme 3. Hazırlıklar
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş, gelişmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (ADMEM),% 1 Glutamax 500 ml temel fibroblast büyüme fiili 10 ng / ml hazırlanması, kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan alınan MKH'lerin yetiştirmeyeR (bFGF) ve% 1.0 penisilin-streptomisin (sırasıyla 10,000 IU 10,000 ug / ml, Pen-Strep).
- CO2 inkübatör içerisindeki% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C 'de ADMEM inkübe edin.
- Hücre İzolasyonu ve yıkama için imalatçının talimatlarına uygun olarak Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) 500 ml hazırlayın.
4. mini-domuzlarda Kemik İliği Toplama
- Bir alanı iliak (Şekil 1) boyutu yaklaşık 15 x 15 cm seçin ve sterilize güvenlik jilet veya elektrikli kesme makineleri kullanarak bu alandan saç kaldırmak. povidon iyot ve% 70 etanol: MiniPig yerleştirildikten sonra, alternatif olarak prosedürü site aşağıdaki sterilizasyon maddeleri ile üç kez bodur. Alan tamamen kuru sonra, steril örtüler uygulayın.
- Ön kaplama 3 ile durulama ile, heparin, 100 U / ml, 10 ml şırınga - ejec önce heparin 4 mlting, anti-pıhtılaştırıcı ajan.
Not: Kemik iliği aspirasyon sırasında şırınga pıhtılaşmayı önlemek için bu adımı gerçekleştirin. - sıkı heparin önceden kaplanmış 10 mi şırınga bağlı kemik iliği çıkarıcı (3.0 x 100 mm) kullanılarak, anestezi altında Minipig iliak kemikten kemik iliği, 5 ml, en az ekstrakte edin.
Kemik İliği gelen ve In Vitro Tarımında olarak Çıkarılan Hücreler 5. İzolasyon
- çıkarılan kemik iliği hücreleri izole.
- Oda sıcaklığında 15 ml konik bir tüp içinde DPBS eşit hacimde ekstre kemik iliği seyreltilir.
- 15 ml konik tüp yoğunluk santrifüj medya (Ficoll Paque) 3 ml ekleyin.
- oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 400 x g'de 4 mi karıştırılmadan yoğunluk santrifüj ortama yerleştirilir DPBS ile kemik iliği, bir tabaka ve santrifüj seyreltik.
- tek-çekirdekli hücre tabakasının HasatPlazma (üst katman) ve yoğunluk santrifüjleme ortamı (alt katman) içeren iki tabaka arasında ince beyaz kaplamadan (MNC) ve 15 ml konik bir tüp içine ÇUŞ'larına aktarın.
- 7 ile aktarılan ÇUŞ'larına seyreltilir - DPBS 8 ml ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve DPBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
- ADMEM 2 ml hücre pelletini askıya alma ve 35 mm doku kültürü çanağı aktarın. % 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C 'de kültür çanağı inkübe edin.
- Kemik iliğinden izole edilmiş hücrelere in vitro kültivasyonu olarak.
- 48 saat sonra, çanak bağlı olan hücreler ile orta havalandırın, ve ADMEM 2 ml yerine ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C 'de inkübe edilir. her üç günde orta değiştirin.
- 70 'de -% 80 birleşme,% 0.25 ile 1 ml çözünmelerini, DPBS ile yıkama hücreleriHücreler ayrılana kadar 5 dakika - tripsin / EDTA ve 3 37 ° C de inkübe.
- ADMEM 10 ml kullanarak hücreleri hasat 15 ml konik bir tüp içine transfer edildi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. süpernatant atın.
- Taze ADMEM 1 ml hasat hücreleri askıya alma ve bir hemasitometre kullanarak onları saymak.
- 5 hücreleri yerleştirin - ADMEM 4 ml içeren 7.5 x 10 5 / 25T şişeye ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C'de inkübe. Her üç günde bir orta değiştirin.
Mini-domuzlarda gelen Akışkan SİNOVYAL 6. Koleksiyonu
- Kemik iliği aspirasyonu için prosedüre benzer, femoral eklem üzerinde yaklaşık 15 x 10 cm (uzunluk / genişlik) uygun bir alan seçin ve sterilize güvenlik jilet veya elektrikli kesme makineleri kullanarak tüylerden, sanitization prosedürleri (adım 4.1) ile izleyin.
- 23 G ile 3 ml şırınga takınpalpasyon yerlerinden (patella ve tibia kret) sonra eklem içine iğne.
- eklemde sinoviyal sıvının aspirasyonu şırınga nazik vakum uygulayın. 1 mi, ancak bu Minipig veya eklem büyüklüğüne göre değişir - eklem toplanan sinoviyal sıvı, yaklaşık hacmi 0,5. sinoviyal sıvı toplanan hacmi çok küçük ise sinovyal boşluğunda DPBS ile yıkayın.
- Hemen kanla kirlenmesini önlemek için şırınga geri çekin.
Toplanan Sinovyal Sıvı gelen ve In Vitro Tarımında 7. Hücre İzolasyonu
- Aspire sinoviyal sıvıdan hücreleri izole.
- Oda sıcaklığında 15 ml konik bir tüp içinde DPBS eşit hacimde aspire sinoviyal sıvı seyreltilir.
- enkaz kaldırmak için, 40 mikron naylon hücre süzgeci kullanılarak seyreltilmiş sinoviyal sıvıyı filtre.
- süzüldü sinovyal içeren tüp DPBS 10 mlSıvı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj o. Süpernatantı atın ve DPBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
- Bir 2 hücreleri yer, ADMEM 2 ml hücre pelletini Askıya - ADMEM 2 ml 3 x 10 5 hücre / 35 mm doku kültürü çanağı ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C'de inkübe .
- İzole eklem sıvısı kaynaklı MKH in vitro ekimi için yineleyin 5.2.
Mini-domuzlarda 8. Sonrası prosedür Bakımı
- Gerekirse, kemik iliği toplandıktan sonra, bir deri zımba kullanarak tek bir sütür ile kemik iliği çıkarıcı enjeksiyon yerinde cilt kapatın.
- Prosedür tamamlandıktan sonra, 3 gün boyunca, günde bir kez mini-domuzlarda için enrofloxacin (5 mg / kg) ve meloksikam (0.2 mg / kg) damar içi idare ederler.
- Prosedür tamamlandıktan sonra, kemik iliği ve sinovyal sıvı toplama site dezenfekte% 0.1 povidon iyot kez 3 gün boyunca bir gün. Dikkatle komplikasyonların belirtileri (örneğin, şişme, iltihap veya kızarıklık) izlemek için her gün görmekteyiz.
Akım Sitometri Kullanımı 9. Hücre Fenotiplendirme
- geçitler 3% 80 konfluent - 5 - DPBS hücreleri yıkayın ve% 0.25 (h / h) tripsin / EDTA, 1 ml ile tedavi MSC'ler 70 olduğunda. Hücreler müstakil kadar 5 dakika - sonra, 3, 37 ° C'de inkübe.
- DPBS 10 ml kullanarak hücrelerin hasat, 15 ml konik tüp içine aktarmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj. süpernatant çözüm atın.
- hücreleri düzeltmek için, bir% 3.7 formaldehid çözeltisi, 10 ml hücre pelletini askıya ve analiz bir gün önce, 4 ° C 'de muhafaza edin.
- Bir gün sabitleme sonra, DPBS kez 5 dakika her zaman için 300 × g santrifüj kullanılarak hücreleri yıkayın. süpernatant çözüm atın.
- 4 ml hücre pelletini Askıya% 1 sığır serum albümini (ağ / hac) (BSA) ile desteklenmiş ve spesifik olmayan Fc ile aracılık edilen etkileşimi engellemek için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca pelet inkübe edilir DPBS, bir.
- 1.5 ml tüpler içine hücre süspansiyonu 500 ul alikotları dağıtın.
- Birleştirilmiş-olmayan antikorları (CD29 ve Vimentin) için, 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkayın. süpernatant çözüm atın.
- 1 500 ul hücre pelletini askıya alınması: birincil antikor, 100 seyreltme ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat için kuluçkalayın.
- 5 dakika, her seferinde 300 x g'da santrifüjleme ile% 1 sığır serum albümini ile hücreler iki kez yıkanır. süpernatant çözüm atın.
- İkincil antikor ile konjüge edilmiş flöresin izotiyosiyanat (FITC), 100 seyreltme ve 4 ° C de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe bir 1: 500 ul hücre pelletini süspanse edin.
- FITC-konjuge antikor (İzotip, CD34, CD44 ve CD45) için, Santrifüj hücreleri yıkayın3 dakika boyunca 300 x g'de gasyon. süpernatant çözüm atın.
- 1 500 ul hücre pelletini askıya alınması: 100 FITC ile konjüge edilmiş antikor ile 4 ° C de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin.
- Her iki boyama koşulları için, 5 dakika, her seferinde 300 x g'da santrifüjleme ile DPBS hücreler iki kez yıkayın. süpernatant çözüm atın.
- , DPBS 500 ul hücreleri Askıya 5 ml yuvarlak tabanlı tüp aktarabilirsiniz ve 8 debi sitometresinde analiz sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik İliği ve mini-domuzlarda ve sinoviyal sıvıdan alınan MSC kurulması
MSC'ler olan (Şekil 2), kemik iliği ve mini-domuzlarda eklem sinoviyal eklem izole edilmiş ve in vitro olarak genişletilmiştir. Sinoviyal sıvı şırınga aspirasyon basit ve primer hücrelerinin in vitro kültivasyonu sırasında yeterli yapışmayan hücreler elde etmek mümkündür. sinoviyal sıvı türetilmiş MSC morfolojisi kemik iliğinden türetilmiş MSC ile verilene benzer, ve her ikisi de erişkin fibroblastik mili bir şekle sahiptir ve homojen yapışık. Üçüncü alt-kültür işlemi tamamlandıktan sonra onlar, alkalin fosfataz (AP) boyama için pozitif bir ifadeye sahip olduğu gözlenmiştir.
Kemik İliği ve sinoviyal sıvıdan alınan MSC Hücre Fenotip değerlendirilmesimini-domuzlarda ve
hücre yüzeyi markerlerinin Deneyler mini-domuzlarda kemik iliği ve sinovyal sıvı türetilmiş MSC bir fenotip oluşturmak için yapıldı. CD34 ve CD45 ifadesi arasında ≤2% (negatif ve düşük iken, - (pozitif hücrelerin% 99 ≥96) MSC Her iki türdeki CD29, CD44, vimentin pozitif hücresi yüzey markerlerine önemli miktarda ifade pozitif hücreler) (Şekil 3). Bu sonuçlar sinoviyal sıvıdan izole hücreler de dahil olmak üzere ayırt edici MSC, elde edilenlerle aynıydı ve bu MSC arasındaki hücre yüzey belirteçleri açısından anlamlı farklılıklar bulunmuştur. Kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan izole hücreler önceki çalışmamızda 8 MKH olarak teyit edilmiştir. Hem kemik iliği ve eklem sıvısı kökenli MKH kök hücre transkripsiyon faktörleri (Oct3 / 4, Nanog ve Sox2) olarak ifade edilmiştir; Ayrıca, bir in vitro farklılaşma kabiliyeti Hteyit olarak değil sadece mezenkimal soy içine (osteositlerde, adiposit ve kondrosit) değil, aynı zamanda sitokimyasal boyama ve hücre-spesifik gen ifadesinin 8 algılamaları ile sinir hücreleri.
Minipig ve iliak Şekil 1. Location. Kırmızı ok kemik iliği toplanması için kullanılan iliak siteyi temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kemik iliği ve mini-domuzlarda sinoviyal sıvıdan alınan Şekil 2. MSC'ler (A). MSC primer kültürlerinde homojen morfoloji fibroblastik şekli ortaya koymuştur. karışımı ile boyama (B)5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat ve nitro mavi tetrazolyum (BCIP / NBT) geçit 3. Ölçek barda MKH AP aktivitesini ortaya koymuştur: 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. MSC nin hücre yüzeyi işaretçileri sitometri analizi bir akış kullanılarak belirlendi geçit 3. kemik iliği ve mini-domuzlarda sinoviyal sıvıdan alınan MSC hücre yüzey markerlerinin analizi ve MSC'ler CD29, CD44 pozitif olarak tanımlandı , Vimentin ve CD34 ve CD45 negatif ve. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mini-domuzlarda, kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MSC'ler izolasyonu oluşturmak için kullanıldı. yaş, cinsiyet ve hastalık gibi çeşitli fizyolojik koşullar, ortadan kaldırmak için, izogenik arka plan vericilerden mini-domuzlarda doğru hücre kaynağı bağımlı karakterizasyonu değerlendirmek için seçildi. Domuzlar olduğu bilinmektedir anatomik, fizyolojik ve genetik olarak insanlara benzer şekilde, ve özellikle de, boyut eşlemeli organları üretebilir mini-domuzlarda; Bu nedenle, ksenonaklinden 14,15 yerini verici bir tür olarak da kullanılabilir. Domuz ve insanlardan MKH'ler aynı İDO olmasına rağmen MKH, indoleamin 2, 3-dioxygenase (İDO) ve nitrik oksit sentaz (NOS) son zamanlarda önerilen immünomodülatör özelliği ile ilgili olarak, türe özgü immünosupresyon, arabuluculuk MSC ile kullanılan 9 . Böylece, bir MKH donör olarak bir domuz modeli insan tedaviler için MKH bağışıklık tepkilerinin önemli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, domuz sapının araştırmaHücreler in vitro işlemlerle ve insanlarda 16,17 bunların çeşitli klinik öncesi uygulama biyolojik anlaşılmasında önemli bir rol oynar. Kemik iliği ve sinovyal sıvı invasiv olmayan bir mini-domuzlarda hasat edilebilir. Tüm prosedür, toplama örnek Anestezi, sistemik veya lokal organların stres düzeyini azaltmıştır; Bu nedenle, mini-domuzlarda otolog transplantasyonu için alıcılar olarak kullanılabilir. Bu deneyde, erişkin önceki çalışmada RA fare modelinden türetilen immünosupresyon kapasiteleri ile sinoviyal sıvı kaynaklı MKH onay dayalı, kemik iliği ve mini-domuzlarda eklem sıvısı izole edilmiştir 8
Mini-domuzlarda Kemik İliği Toplama
domuzlarda, kemik iliğinden elde edilen yetişkin progenitör hücrelerin multipotent ve neovaskülarizasyon kardiyomyosit rejenerasyonu uyarmaktadır. Bir vericinin yaşı artan yağ içeriği ile ilişkilidir veçoğalmasını ve kemik iliği farklılaşmasını azalması; Bu nedenle, kemik iliği yaşlı hayvanlarda MKH en iyi kaynak değildir. o geniş ve siyatik sinir hasarı için düşük riskli bir işlem sitesi olduğu için mini-domuzlarda içinde iliak kemik iliği kaynaklı MSC izolasyonu için tercih edilen bir sitedir. yaşlı veya kilolu mini-domuzlarda durumunda, yağ zenginleştirilmiş kalın kaslar iliak mevcut olabilir. Bu şartlar altında, cilt üzerinde bir bıçaklama kesi iliak de uygulamak zor olabilir ki, gerekli ve kemik iliği biyopsi iğnesi düzgün takılı olmalıdır. İğne kemiğe tarafından engellenmiş olur veya iliak içinde kemik iliği ulaşmak mümkün olmayabilir, çünkü başarısız kemik iliği özlemleri yol açabilir doğru biyopsi site bulmak için başarısızlık. Bu nedenle, biyopsi iğnesi düzgün kontrol edilmelidir ve yumuşak doku kalınlığı ve iliak kemik korteks bilgi örneği koleksiyonları başlamadan önce gereklidir.
mini-domuzlarda ve Mafsallar gelen sıvı SİNOVYAL ve "jove_content"> Aspirasyon
Eklem sıvısı sinoviyal eklem boşluğu bulunmaktadır ve sinoviyal sıvı hacmi genellikle, iltihaplı eklemlerde artar. Sinoviyal sıvı türetilmiş MSC'ler in vivo ve in vitro olarak hem de kıkırdak yeniden üretimi için tercih edilen bir aday konumlar alınmaktadır. Ek olarak, RA 8 bağışıklık özelliklerini ortaya çıkarmak için gösterilmiştir. Eklem sıvısı sadece kolay ulaşılabilir bir kaynak değil, aynı zamanda değerli mezenkimal özellikleri vardır. MSC için bir kaynak olarak sinoviyal akışkan kullanılarak sınırlamaları farklı boyutlarda ve eklemlerin patolojik durumların ve eklemlerden sinoviyal sıvı aspirasyon için 3 ml hava ile zorluk göre eklemlerde bulunan farklı hacimleri. Yüksek basınçlı 10 mi - Bu nedenle, şırınga boyutu 5 olmalıdır. bir şırıngadan DPBS 2 ml - Buna ek olarak, 1 sinoviyal sıvının yıkamatercih edilir. Bu yöntemi kullanarak, hücrelerin geniş bir sayısı eklemlerde küçük alanlardan elde edilebilir.
Mini-domuzlarda Kemik iliği-ve Eklem-sıvı-türevli MKH Karakterizasyonu
İnsanlarda, osteoartrit hastalarının sinoviyal-sıvı-ve sinovyal membran kaynaklı MKH morfolojileri benzer fakat kemik iliği kaynaklı MKH'lerin 12 morfolojisi daha dardır. Bununla birlikte, in vitro kültürler, eklem-sıvısı-türevi MSC ve kemik iliği türevli MSC hem morfolojileri, bu deneyde benzer olduğu gözlenmiştir. Araştırmacıların önceki çalışmada, sinoviyal sıvı kaynaklı MKH çoğalması yeteneği kemik iliği kaynaklı MKH'lerin 8 ile karşılaştırıldığında, yüksek oldu.
MKH yetişkin vericilerinde çeşitli doku kaynaklarından kurulan; Bu nedenle, non-invaziv elde edilen doku kaynak kökenli MKH inci otolog kök hücre için değerlidirerapy. hücre kaynağı kök hücre tedavisi hastalık ya da amacı karakterizasyonları ve kapasiteleri bağlıdır. Domuzlarda, kemik iliğinden elde edilen yetişkin progenitör hücrelerin multipotent ve neovaskülarizasyon kardiyomyosit rejenerasyonu 18,19 uyarmaktadır. Bu dokulardan hücreler elde etmek kolay değildir ve hastalar için ilave cerrahi işlem gerektirir, ancak MSC'ler, aynı zamanda, periost, iskelet kasları, sinovyum, göbek kordonları, diş dokulardan, kemik iliği çoğunlukla izole edilmiştir. Ancak, sinoviyal sıvının hacmi genellikle osteoartrit veya RA hastalarının eklem artar ve bu artış sinoviyal sıvıların biyopsiler teşhis ve hastaları tedavi etmek için kullanılır. MSC sayısı da dejenere kıkırdak ve osteoartrit 20 olan hastaların sinovyal sıvısında artar.
Bu çalışmada, kemik iliği ve sinovyal sıvı türetilmiş MSC hücre fenotipleri değerlendirildi bird MKH her iki hücre yüzey belirteçleri için ifade benzer seviyelerde sundu. Bu nedenle, eklem sıvısı izole ve MKH olarak teyit hücreler mini-domuzlarda kemik iliği kaynaklı MKH benzer fenotipleri vardır. Araştırmacıların Önceki araştırmalar, CD90 ve majör histo-uyumlu ve karmaşık sınıf II (MHC II) gibi diğer hücre yüzeyi işaretçileri, değerlendirildi ve sinoviyal sıvısı içinde osteositler, adipositler, kondrosit ve nöronlara çok soyundan farklılaşması için bir kapasite teyit mini-domuzlarda 8'den türevi MSC'ler. İnsanlarda, sinoviyal sıvı türetilmiş MSC hücre yüzey antijeni profili sinovyal-zar-2,21 ve kemik iliği türevli MSC ile verilene benzer. Ancak, CD34 ve CD45 ifadeleri temporomandibuler eklem bozukluğu olan hastalarda sinoviyal sıvıdan alınan MSC tespit edilmemiştir. Bu nedenle, ortak olarak mikro-sinoviyal sıvıdan alınan MSC nin hücre fenotipi etkileyebilir. Bu deneyde, hücreler kemik MA'dan temin edilmiştirrrow ve non-invazif yöntemlerle mini-domuzlarda sinovyal sıvı. In vitro kültür hücrelerinin her iki tip MKH olarak teyit edildi ve benzer hücre fenotipleri ve paylaşılan uyumlu mezenkimal özellikleri vardı. Ancak, sinoviyal sıvı türetilmiş MKH sadece kıkırdak ve kemik rejenerasyonu için otolog kök hücre tedavisi için değil, aynı zamanda osteoartrit ve RA immünosüpresyon için daha büyük bir potansiyel gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
