Protocol
동물 실험은 경상 대학교에서 생물 의학 실험을위한 동물 센터에 의해 승인되었다.
동물 절차 1. 준비
- 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 비 침습적 수집 성인에게 여성 minipigs를 준비합니다. 마취 및 샘플 컬렉션에 일일 전에 minipigs의 임상 검사를 수행합니다.
- 완전한 혈액 카운트 테스트를 사용하여 체온, 호흡 및 심장 박동, 그리고 돼지의 행동 및 혈액 학적 상태의 관찰을 포함 신체 검사, 임상 적 정상적인 동물을 제공합니다.
참고 : 임상 적으로 건강한 minipigs에 대한 매개 변수 간격은 11입니다 - 호흡 속도 29 / 분, 68 - 심박수 98 / 분, 37 - 체온 38 ° C.
- 완전한 혈액 카운트 테스트를 사용하여 체온, 호흡 및 심장 박동, 그리고 돼지의 행동 및 혈액 학적 상태의 관찰을 포함 신체 검사, 임상 적 정상적인 동물을 제공합니다.
- 12 시간 프리 오 - (6)의 수술 전 금식 기간 동안 케이지에서 모든 식용 침구를 제거젊은 성인 minipigs을위한 마취 관리에 r은 금식의 3 시간은 신생아 관찰해야한다. 마취 시간까지 식수 제공합니다.
마취에 대한 동물의 2. 준비
- 아세 프로 마진 (0.1 ㎎ / ㎏), 메데 토미 (0.03 ㎎ / ㎏) 및 아트로핀 (0.04 ㎎ / ㎏)으로 마취의 투여 전에 minipigs을 의료를 베풀다.
- 성인 minipigs 적어도 30mm 길이의 21 G 바늘을 사용하는 약물의 모든 근육 내 (IM)를 주입한다. 측면 자궁 근육이나 허벅지 근육에 IM 주입을 귀 뒤에 1-3cm를 수행합니다.
참고 : 동물의 두려움이나 스트레스를 유도하거나 안전하게 전 처치를 주입 거친 취급을 필요로하지 않고 모든 절차를 수행합니다.
- 성인 minipigs 적어도 30mm 길이의 21 G 바늘을 사용하는 약물의 모든 근육 내 (IM)를 주입한다. 측면 자궁 근육이나 허벅지 근육에 IM 주입을 귀 뒤에 1-3cm를 수행합니다.
- 지느러미 - 누운 위치에 minipigs를 놓습니다.
- 다섯 분 전 처치의 투여 후, 1.5 % 이소 플루 란 관리자를 사용하여 마취를 시작흡입을 통해 istered.
- 산소를 캐리어 가스로 2.5 %의 농도가 증가 하였다 기관 내 튜브를 통해 이소 플루 란 (1.5 %)의 흡입, (1.5 L / 분)을 계속한다.
- 계속 마취 동안 minipigs의 심박수, 체온, 경피 혈중 산소 포화도 (SPO 2)를 모니터링한다. 체온을 유지하기 위해 39 °의 C - (38)의 온도에서 순환 블랭킷을 사용한다. 마취 동안 건조로부터 눈을 보호하기 위해 안과 연고를 적용합니다.
- 마취 (13)의 깊이를 평가하는 Guedel의 분류를 따르십시오.
세포 분리 및 배양 3. 준비
- 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 고급 둘 베코 변성 이글 배지 (ADMEM), 1 % 루타 500 ㎖, 염기성 섬유 아세포 성장 사실상에게 10ng의 / ㎖을 제조 골수 및 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포를 배양하는 방법R (bFGF를), 1.0 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (각각 10,000 IU 10,000 μg의의 / ㎖, 펜 연쇄상 구균).
- 공동 인큐베이터 내에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 3,850 ℃에서 ADMEM 부화.
- 세포의 분리 및 세척은 제조업체의 지시에 따라 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 500ml의 준비.
4. Minipigs에서 골수를 수집
- 지역 장골의 문장 (그림 1)의 크기는 약 15 X 15cm를 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여이 영역에서 머리를 제거합니다. 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올 다음 미니 피그가 위치되면, 교대 순서 사이트를 다음 멸균 제 3 회 문질러. 영역이 완전히 건조 후, 멸균 커튼을 적용합니다.
- 프리 코트 (3)으로 세정하여 헤파린 100 U / ㎖로 10 ML의 주사기 - ejec 전에 헤파린의 4 ml의팅 항 응집제.
참고 : 골수 흡인 동안 주사기에 응고를 방지하기 위해이 단계를 수행합니다. - 단단히 헤파린 미리 코팅 된 10 ML의 주사기에 부착 된 골수 추출기 (3.0 × 100mm)를 사용하여, 마취에서 미니 피그의 장골 뼈에서 골수 5 ㎖의 최소한의 압축을 풉니 다.
뼈 골수로부터 체외 배양에서 추출 된 세포의 5. 분리
- 추출 된 골수로부터 세포를 분리.
- 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 추출한 골수 희석.
- 15 ML 원뿔 튜브 밀도 원심 분리 미디어 (피콜 - 페이크)의 3 ML을 추가합니다.
- 실온에서 40 분 동안 400 × g에서 4 mL를 혼합하지 않고 밀도 원심 매체에 배치 DPBS 함께 골수의 층, 및 원심 분리기를 희석.
- 단핵 세포 층 수확플라즈마 (상층)과 밀도 원심 분리 매체 (바닥 층)을 포함하는 두 층 사이에 버피 코트로부터 (다국적)과, 15ml의 원뿔형 튜브에 다국적 옮긴다.
- 7 전사 다국적 희석 - DPBS 8 ml를 실온에서 10 분 동안 500 × g에서 원심 분리하여 그들을. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 중단하고, 35mm 조직 배양 접시에 옮긴다. 5 % CO 2의 가습 분위기에서 38.5 ° C에서 배양 접시를 품어.
- 골수에서 분리 한 세포의 체외 배양합니다.
- 48 시간 후, 접시에 부착되지 않은 세포와 배지를 흡인하고 ADMEM 2 ㎖를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C로하여 배양한다. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다.
- 70 - 80 % 컨 플루 0.25 % 1 ㎖ 그들을 해리, DPBS로 세포를 씻어세포가 분리 될 때까지 5 분 - 트립신 / EDTA, 그리고 (3) 37 ℃에서이를 부화.
- ADMEM 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상층 액을 버린다.
- 신선한 ADMEM 1 ㎖에 수확 된 세포를 일시 중단하고 혈구를 사용하여 계산합니다.
- 5의 셀 배치 - ADMEM 4 mL를 함유 7.5 × 105 / 25T 플라스크 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화. 세 번째마다 일 매체를 변경합니다.
Minipigs에서 유체 활액의 6. 컬렉션
- 골수 흡인하는 절차와 유사하게, 대퇴 관절을 통해 약 15 X 10cm (길이 / 폭)의 적절한 영역을 선택하고 살균 면도기 나 전기 면도기를 사용하여 머리를 제거, 살균 절차 (단계 4.1)에 의해 수행합니다.
- 23 G와 3 ML의 주사기를 삽입촉진 랜드 마크 (슬개골 및 경골 크레스트) 후 관절에 바늘.
- 관절의 활액의 흡입 용 주사기에 부드러운 흡입을 적용합니다. 1 ㎖, 그러나 이것은 미니 피그 또는 관절의 크기에 따라 변화 - 관절 활액에서 수집의 대략 부피는 0.5이다. 활액의 회수 용적이 너무 작 으면 활막 캐비티 DPBS 통해 세척.
- 즉시 혈액 오염을 방지하기 위해 주사기를 철회.
수집 된 활액에서와 체외 재배 7. 세포 분리
- 흡입 된 활액에서 세포를 분리.
- 실온에서 15ml의 원뿔형 튜브 DPBS 같은 부피로 흡입 활액 희석.
- 파편을 제거하기 위해, 40 ㎛의 나일론 세포 여과기를 사용하여 희석 활액 필터.
- 필터링 된 활액을 포함하는 튜브에 DPBS 10 mL를 추가액을 실온에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리하여. 뜨는을 취소하고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 2의 셀을 배치 ADMEM 2 ㎖의 세포 펠렛을 일시 - ADMEM 2 ㎖로 3 × 105 세포 / 35mm 조직 배양 접시에, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 38.5 ° C에서 그들을 부화 .
- 격리 된 활액 - 유래 중간 엽 줄기 세포의 체외 배양 단계를 반복 5.2.
Minipigs 8. 이후 절차 케어
- 필요한 경우, 골수 컬렉션 후, 피부 스테이플러를 사용하여 하나의 봉합사와 골수 추출기 주사 부위 피부를 닫는다.
- 절차가 완료된 후 3 일 동안 하루에 한번 minipigs enrofloxacin (5 ㎎ / ㎏) 및 멜 록시 캄 (0.2 밀리그램 / kg)을 근육 주사를 투여.
- 절차가 완료된 후, 골수 및 활액 수집 사이트 소독0.1 % 포비돈 요오드 번 3 일간 하루에. 조심스럽게 합병증의 징후 (예를 들어, 부종, 고름, 또는 적색)를 모니터링 매일 관찰한다.
유동 세포 계측법을 사용하여 9 셀 표현형
- 유로 (3) 80 % 합류 - - 5, DPBS로 세포를 씻어 0.25 % (v / v)의 트립신 / EDTA 1 ml의 그들을 대하는 중간 엽 줄기 세포는 70 때. 세포가 분리 될 때까지 5 분 - 그럼, 3, 37 ° C에서 그들을 품어.
- DPBS 10 ㎖를 사용하여 세포를 수확 15 ml의 원추형 튜브로 전송하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 그들을. 상등액을 버리고.
- 세포를 해결하려면, 3.7 %의 포름 알데히드 용액 10 ㎖의 세포 펠렛을 중단하고 분석하기 전에 하루 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 어느 날 고정 후, DPBS 두 번 5 분마다 300 × g에서 원심 분리를 이용하여 세포를 씻는다. 상등액을 버리고.
- 4 ㎖ 중의 세포 펠렛을 정지1 % 소 혈청 알부민 (/ V w) (BSA)을 첨가하고, 비특이적 된 Fc 매개의 상호 작용을 차단하는 4 ° C에서 1 시간 동안 펠렛을 부화되어 DPBS의.
- 1.5 ml의 튜브에 세포 현탁액 500 ㎕를 분취를 배포합니다.
- 비공 항체 (CD29 및 멘틴)의 경우, 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고.
- 1의 500 μL의 세포 펠렛 일시 : 차 항체의 100 희석 4 ° C에서 1 시간 동안 그것을 품어.
- 각 5 분 동안 300 × g에서 원심 분리하여 1 % 소 혈청 알부민 회 세포를 세척 하였다. 상등액을 버리고.
- 차 항체를 π 공역 계 플루 오레 신 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 희석 4 ° C에서 어둠 속에서 1 시간을 품어 : 1의 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단합니다.
- FITC - 복합 항체 (이소, CD34, CD44 및 CD45)의 경우, centrifu로 세포를 씻어3 분 동안 300 × g에서 gation. 상등액을 버리고.
- 1 500 μL의 세포 펠렛을 일시 중단 : 100 FITC - 복합 항체를 4 ℃에서 어둠 속에서 1 시간을 품어.
- 모두 염색 조건 5 분마다 300 × g에서 원심 분리에 의해 DPBS 두 번 세포를 씻어. 상등액을 버리고.
- , DPBS 500 μL의 세포를 일시에 5 mL의 둥근 바닥 튜브로 전송하고, 8 플로우 사이토 미터를 사용하여 결과를 분석한다.
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Representative Results
뼈 골수 및 Minipigs의 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 수립
중간 엽 줄기 세포가 성공적으로 (도 2) 골수 및 minipigs의 관절 활액 관절로부터 단리 및 시험 관내에서 확장시켰다. 활액 주사기 흡입은 간단하고, 일차 세포의 체외 배양시에 충분한 부착 성 세포를 얻을 수있다. 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 형태는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 - 유사하고, 모두 중간 엽 줄기 세포가 섬유 아세포 스핀들 형상을 균일하게 부착된다. 세번째 계대 배양 종료 후 그들은, 알칼리 포스파타제 (AP) 염색 양성 발현이 관찰되었다.
뼈 골수 및 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 세포 표현형의 평가Minipigs의
세포 표면 마커의 분석은 minipigs의 골수 및 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 표현형을 생성하기 위해 수행 하였다. CD34 및 CD45의 발현이 중 ≤2 % (부정적 낮았다 반면, - (포지티브 세포의 99 % ≥96) 중간 엽 줄기 세포의 두 가지 유형은 CD29, CD44, 및 멘틴 포지티브 세포 표면 마커, 상당량의 발현 양성 세포) (그림 3). 이러한 결과는 활액에서 분리 된 세포를 포함한 독특한 엽 줄기에서 얻은 것과 동일 하였다, 이들 중에서 중간 엽 줄기 세포 표면 마커에 유의 한 차이는 없었다. 골수에서 분리 된 활액 세포는 이전 연구 8 중간 엽 줄기 세포로 확인되었다. 두 골 marrow- 및 활액 - 유래 중간 엽 줄기 세포는 줄기 세포 전사 인자 (Oct3 / 4, Nanog를하고, Sox2이)를 표현; 또한, 생체 외 분화 능력 H확인되지로서뿐만 아니라 중간 엽 계보에 (골 세포, 지방 세포와 연골 세포)뿐만 아니라, 세포 화학적 염색과 세포 특이 유전자 발현 (8)의 탐지에 의한 신경 세포.
미니 피그의 장골 그림 1. 위치. 빨간색 화살표는 골수 컬렉션에 사용되는 장골의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
골수와 minipigs의 활액에서 파생 된 그림 2. 중간 엽 줄기 세포. (A) 중간 엽 줄기 세포의 차 문화의 균일 한 형태는 섬유 모세포 모양을 밝혔다. 의 혼합물로 염색 (B)5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트 및 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT)를 통과 3. 스케일 바의 중간 엽 줄기 세포에 AP 활동을 밝혀 : 100 μm의는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 엽 줄기 세포의 세포 표면 마커 분석 유세포을 사용하여 확인 된 통로 (3)에서 골수 minipigs의 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 세포 표면 마커 분석 및 중간 엽 줄기 세포는 CD29, CD44 양성 것으로 확인되었다 , 멘틴 및 CD34과 CD45에 대한 부정과는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Minipigs 골수 및 활액에서 중간 엽 줄기 세포의 분리를 확립하는데 사용 하였다. 연령, 성별, 질환 등 다양한 생리 학적 조건을 제거하기 위해, 동종 배경 기증자 minipigs 정확하게 셀 소스 의존 특성을 평가하기 위해 선택되었다. 피그 것으로 알려진 해부학 적, 생리 학적 및 유전자 인간과 유사한 것으로, 특히 크기가 일치 장기를 생산할 수 minipigs; 따라서 이들은 이종 14,15 대용 도너 종으로서 사용할 수있다. 돼지와 사람에서 중간 엽 줄기 세포는 동일한 IDO이 있지만 MSC들, indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 및 산화 질소 합성 효소 (NOS)의 최근 제안 면역 속성에 관해서는, 종 - 특이 면역 억제를 중재하는 중간 엽 줄기 세포로 사용했다 (9) . 따라서, 중간 엽 줄기 세포 기증자로 돼지 모델은 인간의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 면역 반응의 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 돼지 줄기 연구세포는 시험관 내 인간 프로세스 (16, 17)에서의 다양한 임상 응용의 생물학적 이해에 중요한 역할을한다. 골수 활액 비 침습적 minipigs에서 수확 될 수있다. 전체 절차, 수집을 맛볼 수 마취에서, 전신 또는 지역 기관의 스트레스 수준을 감소; 따라서, minipigs은자가 이식받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는, 중간 엽 줄기 세포는 이전 연구에서 RA 마우스 모델로부터 유도 된 면역 억제 용량 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 확인에 기초하여, 골수 minipigs의 윤활액으로부터 분리 된 8
Minipigs에서 골수의 컬렉션
돼지에서, 골수에서 유래 성인 전구 세포는 다 능성이며, 신생 혈관과 심근 재생을 유도했다. 공여자의 연령이 증가 지방 함량과 연관되고증식 및 골수의 분화를 감소; 따라서, 골수에서 중간 엽 줄기 세포 노화 동물의 가장 소스 아니다. 이 광범위하고 좌골 신경 손상에 대한 위험이 낮은 절차의 사이트이기 때문에 minipigs의 장골는 골수 유래 MSC의 분리를위한 선호하는 사이트입니다. 세 또는 과체중 minipigs의 경우, 지방이 풍부한 두꺼운 근육은 장골에 존재할 수있다. 이러한 환경에서, 피부에 찔러 절개 장골에 적용하기 어려울 수있는, 필요한 골수 생검 바늘 적절히 삽입한다. 바늘이 뼈에 의해 차단된다 또는 장골 내부의 골수에 도달하지 못할 수 있기 때문에 실패 골수 포부가 발생할 수 있습니다 올바른 생검 사이트를 찾는 않으면. 따라서, 생검 바늘이 제대로 확인해야하며, 연조직의 두께와 장골의 골 피질의 지식은 샘플 수집을 시작하기 전에 필요합니다.
Minipigs의 관절에서 유체 활액의 "jove_content"> 포부
활액 관절 활막의 캐비티 내에 존재하고, 활액의 부피는 일반적으로 관절 염증이 증가된다. 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포는 생체 내 및 생체 외 모두에서 연골 재생을위한 바람직한 후보 사이트에서 가져옵니다. 또한, 그들은 RA 8 면역 조절 특성을 유도하는 것으로 나타났다. 활액뿐만 아니라 쉽게 접근 할 수있는 소스뿐만 아니라 가치있는 중간 엽 속성이 있습니다. 중간 엽 줄기 세포에 대한 공급원으로서 활액의 사용 제한은 다양한 크기와 관절의 병리 적 상태와 조인트 활액 포부 3 mL를 주사기를 사용하는 어려움에 기초하여 관절에서 발견되는 다른 볼륨이다. 고압 10 ㎖ - 따라서, 주사기의 크기는 5 일 것이다. 주사기로부터 DPBS 2 ㎖ - 또한, (1)과 활액 홍조바람직하다. 이 방법을 사용함으로써, 다수의 셀 심지어 관절에 작은 공간에서 얻어 질 수있다.
Minipigs의 뼈 marrow-과 활액은 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 특성 분석
인간에서 골관절염 환자의 활막 - 유체 - 및 활액 - 막 - 유래 중간 엽 줄기 세포의 형태학은 유사하지만 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (12)의 형태보다 좁은입니다. 그러나,의 체외 문화, 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포와 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 모두의 모폴로지이 실험에서 유사하게 관찰되었다. 연구자들의 이전 연구에서, 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 증식 능력은 골수 유래 중간 엽 줄기 세포-8에 비해 높았다.
중간 엽 줄기 세포는 성인 기증자의 다양한 조직 소스에서 설립; 따라서, 비는 침습적 얻은 조직 소스 유래 중간 엽 줄기 세포는 제자가 줄기 세포에 대한 가치가있다erapy. 셀 소스는 줄기 세포 치료 질환 또는 목적의 특성화 및 능력에 의존한다. 돼지, 골수로부터 유도 성인 전구 세포는 다 능성이고 신생 혈관과 심근 재생 18,19 유도했다. 이들 조직으로부터 세포를 획득하는 것은 쉽지 않고 환자에 대한 추가 수술이 필요할 수 있지만, 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라, 골막, 골격근, 활막, 탯줄 및 치아 조직의 골수에서 주로 절연왔다. 그러나, 활액의 부피는 일반적으로 골관절염 또는 류마티스 관절염 환자의 관절에 증가하고, 이러한 증가 된 활액의 생검은 진단 및 환자를 치료하기 위해 사용된다. 중간 엽 줄기 세포의 수는 연골 퇴화와 20 골관절염 환자의 활액에서 증가한다.
본 연구에서는 뼈 marrow- 및 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 세포 표현형을 평가하고,D 엽 줄기 세포는 모두 세포 표면 마커 발현 비슷한 수준을 제시 하였다. 따라서, 활액에서 분리하고 중간 엽 줄기 세포로 확인 세포는 minipigs에서 골수 유래 중간 엽 줄기 세포와 유사한 표현형을 가지고있다. 연구자들의 이전 연구는 CD90과 주요 조직 적합성 복잡 클래스 II (MHC II)와 같은 다른 세포 표면 마커를 평가하고, 활액 유체의 골 세포, 지방 세포, 연골 세포 및 신경 세포에 멀티 혈통 차별화 용량을 확인 minipigs (8)로부터 유래 중간 엽 줄기 세포. 인간에서, 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포의 세포 표면 항원 프로파일은 활액 멤브레인 - - 2,21 및 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 그것과 유사하다. 그러나, CD34 및 CD45 식은 악관절 장애 환자의 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포에서 검출되지 않았다. 따라서, 공동의 미세 활액에서 유래 중간 엽 줄기 세포의 표현형에 영향을 미칠 수있다. 이 실험에서, 세포는 뼈 (MA)로부터 수득 하였다rrow 비 침습적 방법을 사용 minipigs의 활액. 체외 배양 된 세포의 두 가지 유형의 중간 엽 줄기 세포로 확인되었다, 그들은 유사한 세포 표현형 및 공유 호환 간엽 특성을 가지고 있었다. 그러나, 활액 유체 유래 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 연골과 뼈 재생을위한자가 줄기 세포 치료를위한뿐만 아니라 관절염과 류마티스 관절염의 면역 억제를위한 더 큰 가능성을 보여 주었다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
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