Summary
빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 프로토콜은 수집하고 토양과 얼음의 영구 동토층 코어 오염을 제거하기 위해 제공됩니다. 외인성 DNA와 콜로니의 부재가 검출 된 미생물 또는 드릴링 처리에서 재료보다는 오염을 나타낸다는 것을 시사한다.
Introduction
빙권은 (예를 들면, 영구 동토 토양, 얼음 기능, 빙하, 눈, 만년설과 얼음은) 과거의 환경 조건에서 지속 생물의 유형을 엿볼을 제공합니다. 이 기판을 증착 이후 동결 보존하고 이전 수천 년, 그들의 미생물 커뮤니티, 수백 수십 수 있기 때문에, 고대의 환경 조건을 반영한다. 적절하게 이러한 생태계를 분석하고 냉동 샘플의 냉동 토양과 얼음, 올바른 수거 및 처리에서 의미있는 생물학적 정보를 추출하는 것은 필요하다. 21 세기 기후 전망은 북극과 아 북극 지역 1에서 뚜렷한 온난화의 가능성을 나타내는 이것은 매우 중요하다. 특히, 실내 알래스카와 그린 랜드는 약 5 ° C 각각 2100, 3 7 ° C를 따뜻하게 할 것으로 예상된다. 이것은 상당히 토양 수생 미생물 커뮤니티, 따라서 관련 영향을 예상생지 화학 과정. 따뜻한 온도와 변경된 강수량 정권은 잠재적 두꺼운, 계절 해동 (활성)에 이르는 많은 지역 2-5에서 영구 동토 저하 6,7, 냉동 토양의 해동과 같은 거대한 얼음 기관의 용융 층을 시작할 것으로 예상된다 지상 얼음, 얼음 웨지와 분리 얼음 8. 이 극적으로 이러한 생태계에서 식물과 동물의 생물 다양성에 추가하여 생지 화학적 특성을 변경합니다.
빙하 얼음과 친연성의 영구 동토 침전물과 얼음 기능은 화학 및 기능이 형성되는 시간에 살았 무엇을 나타내는 환경의 생물학적 증거를 포획했다. 예를 들어, 인테리어 알래스카, Illinoisan 위스콘신 모두 영구 동토층이 존재하는 세 특히이 영구 동토층이 존재하는 IMPA의 생물학적, 화학적 증거를 포함 (YBP) 전에 150,000년에 현대 거슬러 올라가는 독특한 위치를 제공합니다생물 다양성에 대한 과거 기후 변화의 캐럿. 그 결과, 이러한 퇴적물은 수천 년에 걸쳐 생지 화학 및 생물 다양성의 기록을 제공합니다. 영역이 낮은 침강 속도를 가지며 빙하 적이 있기 때문에, 교란 샘플 수직 터널 토양 프로필 또는 수평 방향 시추에 수집 및 분석, 어느 드릴링 접근 가능하다. 더 중요한 것은, 광범위한 기록은 특히이 지역 9-14에서 영구 동토층의 고유 한 생물 지구 화학적 특징을 강조하는 것이 존재한다. 특히, DNA 분석의 응용 프로그램이 모두 현존하는 고대 얼음과 영구 동토층 샘플에서 생물 다양성의 존재와 정도를 추정하는 것은 특정 생물에 의해 점령 고대 환경 조건의 연계 및 서식지 탐사 할 수 있습니다.
각각의 연구가 differe를 사용하지만 이전 연구는 포유 동물, 식물, YBP 11, 15 ~ 19 50K 데이트 샘플에서 미생물에 기후에 미치는 영향을 확인했다NT 방법론 수집하고 영구 동토 또는 얼음 코어 오염을 제거합니다. 구체적인 방법은 외래 핵산은 또한 샘플들로부터 제거되었는지 명확하지 않지만 어떤 경우에는 시추 코어, 16, 20-21을 멸균 하였다. 다른 연구에서, 박테리아는 22 제염 방법의 효능을 측정하기 위하여 사용되어왔다 (15) (예를 들면, 세라 티아 균)과 형광 미립자를 분리.
이 실험은 다시 약 40K YBP 데이트 영구 동토 샘플에서 미생물 군집을 조사 더 큰 연구의 일부였다. 연구의이 부분의 구체적인 목적은 성공적으로 얼음과 영구 동토층 코어 오염을 제거하는 것이었다. 우리의 지식을 어떠한 방법은 고정 된 코어의 외측 부분으로부터 외래 핵산과 연관된 클레아 제를 제거하기위한 용액의 이용을 통합하지 않았다. 따라서 이러한 솔루션 commonl 있다는 사실에도 불구하고Y는 분자 실험 실험실 장비의 오염을 제거하는 데 사용됩니다.
코어는 정화 된 후에, 게놈 DNA는 그리피스 등. 23 Töwe 외. (24)에 의해 개발 된 프로토콜을 사용하여 추출하고, 분광 광도계를 사용하여 정량하고, 반응 당 20 ng를 달성하기 위해 멸균 DNA없는 물로 희석 하였다. 600 초 동안 95 ° C (45) 사이클 다음 : 세균 16S의 rRNA의 유전자 rRNA의 유전자가 프라이머 아치 349F와 아치 806R 다음과 같은 조건에서 TM 아치 516F (26)을 프로브로 증폭 된 프라이머 331F 및 797R 증폭 및 BacTaq 25 고세균 (16S)을 조사 하였다 30 초, 60 초 동안 57 ° C, 30 초 동안 40 ° C에서 최종 연장 25 초 동안 72 ° C 95 ° C의. 모든 qPCR의 반응은 중복으로 수행되었다. 20 ㎕의 반응 부피가 20 ng를 DNA, 프라이머 10 μM, 프로브의 5 μM 및 qPCR에 반응 혼합물 10 μl를 포함. 표준 FO슈도모나스 각각 fluorescens 및 Halobacterium의 salinarum에서 세균 및 고세균 qPCR의 게놈 DNA를 사용하여 제조 하였다 r에. 모두 상을 로그로 성장했다. 플레이트 카운트를 실시하고, DNA를 배양 물로부터 분리 하였다. 게놈 DNA는 하나의 가정 및 게놈 당 16S rRNA 유전자의 여섯 사본 H. 용으로 분광 광도계로 정량 하였다 salinarum 및 P. 각각 27 ~ 28, fluorescens. 세균 및 고세균 유전자의 카피 수를 표준 곡선에 기초하여 계산하고, 치료 사이의 불균등 한 분산을 고려하여 로그 변환하고, ANOVA에 의해 평가했다.
커뮤니티 조성물은 16S rRNA 유전자 염기 서열을 유동 세포 다리 증폭 기술을 이용하여 '미생물 생태로 정량적 통계'(QIIME) 29 커뮤니티를 분석하여 결정 하였다. 순방향 및 역방향 읽기가 함께 결합 된 다음 시퀀스를 필터링, 색인하고,고품질 대표는 참조 데이터베이스와 서열 정렬을 통해 드 노보 운영 분류 학적 단위 (OTU) 과제 선정되었다. 정렬 된 서열은 분류 학적 할당 별도 참조 데이터베이스에 비교 하였다. 문 수준 OTU 테이블은 일반 커뮤니티 구성을 결정하기 위해 만들어졌습니다.
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Protocol
1. 장비 준비 및 영구 동토 코어 컬렉션
- 장비 준비 및 현장 샘플 수집 및 보존 기어
- 배럴의 상단에 드라이브 어댑터를 삽입하고 제자리에 고정하는 레버를 돌려 샘플 수집을위한 오거를 조립합니다. 드라이브 어댑터에 어댑터 튜브 핀 어댑터 튜브 상 모터에 핀. 배럴에 커터를 넣습니다.
- 샘플에 어떤 오염을 줄이기 위해 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용 할 것. 귀 보호 및 영구 동토 터널 (그림 1) 입력시 안전 하드 모자를 착용한다.
- 터널을 입력하고 샘플 (그림 1B)를 수집하는 위치를 선택합니다.
주 : 수직 또는 수평 드릴링 위치는 물질 (예, ICE 또는 영구 동토층) 동결 증거가 공지되어있는 영역을 선택, 알려진 많은 뿌리 체계가없고 공지 자갈이 없다. 모두 제거시료를 수집하기 전에 영역에서 식물 물질 생활. 수직 또는 수평 시추 경우, 상대적으로 평평하고 오거에 액세스 할 수있는 영역을 선택합니다. - 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 소독 된 플라스틱 재료로 땅을 적층하여 워크 스테이션을 준비합니다.
- 그들은 오거에서 제거 할 때 코어를 개최 저점을 제공하기 위해 길이 워크 스테이션에 반에 10cm 직경의 폴리 염화 비닐 (PVC) 파이프 절단을 놓습니다. 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 PVC 파이프의 오염을 제거.
- 워크 스테이션 근처에, 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 분무하여 오거 오염을 제거. 와이프와 오거에서 솔루션을 제거합니다.
- 얼음과 영구 동토층 코어 수집 및 저장
- 샘플 벽의 영역을 선택합니다 (1.2.1 참조노트).
- 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 닦아 냉동 벽 면적의 약 10cm 직경의 오염을 제거.
- 이 샘플 영역에 수직이되도록 관심 영역으로 정화 오거 상승 벽 (도 1C, D)의 세척면에 구멍을 시작한다.
- 조심스럽게 샘플 수집 영역에서 오거를 제거합니다. 모터에서 오거를 분리하고 깨끗한 워크 스테이션에서 멸균 PVC 파이프 위의 오거를 놓습니다. 조심스럽게 냉동 코어 멸균 PVC 파이프 (그림 1E)에 슬라이드 아웃하도록 오거를 기울이십시오.
- 70 % 이소프로판올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액과 장갑 오염을 제거.
- 멸균 장갑과 얼음 및 영구 동토층 코어를 들고 무균 가방에 배치합니다.
- 그들이 제공 또는 처리 될 때까지 냉각기 또는 차가운 방에 코어를 배치합니다.
- 쉬0 ° C 이하의 온도에서 그들을 유지하기 위하여, 드라이 아이스를 사용하여 고정을 IP 코어.
- 즉시 -80 ° C에서 코어를 저장합니다.
2. 영구 동토 얼음 코어 프로세싱
- 재료 준비
- 4 시간 동안 450 ℃의 오븐에서 굽기에 의해 멸균, 핵산 무료 무거운 의무 알루미늄 호일, 금속 선반, 유리, 금속 집게, 유리 양모를 준비합니다. 사용할 때까지이 자료를 따로 설정합니다.
- 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 통과시켜 95 % 에탄올, 초순수 살균.
- 4 ° C에서 -20 ° C 물에서 보관 에탄올 용액.
- 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 분사 즉시 각 솔루션 후 닦아 플라스틱 통치자를 소독.
- 세균성 문화 준비
- 세라 티아 균 성장을 국물과 접시를 준비합니다.
- 국물를 들어, 5g의 시도를 결합ptone, 1g 포도당, 5g 효모 추출물 및 1g 칼륨 인산, 다음 증류 추가 할 물은 판을 상기 혼합 한천 15g을 추가하려면 1 L.에 도달합니다. 국물과 플레이트를 들어, 15 분 동안 121 ° C에서 7 오토 클레이브에 산도를 조정합니다.
- 8g 염화나트륨, 염화칼륨 0.2 g, 인산 나트륨 1.44 g 및 0.24 g의 인산 칼륨 염기를 조합하여 1X 인산 버핑 식염수 (PBS)를 준비하고 800 ml에 도달 증류수를 추가한다. 7.4으로 산도를 조정하고 15 분 동안 121 ° C에서 1 L. 오토 클레이브에 도달하는 증류수를 추가합니다.
- S.에 침지하여 살균 루프 국물을 접종 이전에 -80 ℃에서 냉동 보관 하였다 티아 균 배양. 무균 조건 하에서, 연속 희석 수동 PBS 9 ml의 배양액 1mL를 첨가하여 배양 용액을 반전. PBS의 9 ml의이 희석 1 ML을 추가하고 수동으로 솔루션을 반전. 10 -9 dilu까지 여덟 번 이상 반복기 도달.
- 접시에 국물 1 ㎖를 배포하고 셀 스프레더와 확산에 의해 아가 플레이트 상에 10-6, 10-7, 10-8, 10 -9 솔루션을 확산. 희석 당 세중에서이 작업을 수행합니다. 4 ° C에서 원래의 문화를 저장합니다.
- 24 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. 원래 배양 세포의 수를 계산하는 콜로니의 수를 계산. 주 : 원래 배양에서 콜로니의 수는 박테리아의 성장 속도에 의존한다.
- 피펫 멸균 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 원래 문화의 250 μL. 이전 단계에서 콜로니 수에 의해 결정되는 약 109 세포 / ml를 얻을 1X PBS의 충분한 부피를 첨가하여 원래의 배양을 희석. 10 분 동안 2500 × g으로 원심 분리에 의해 미세 원심 분리 튜브에 세포를 펠렛.
주 : 1X PBS의 부피는 박테리아의 성장 속도에 따라 달라질 것이다. - 멸균 biohood에서상기 발효액을 피펫 및 PBS 완충액 1X 1 ml의 세포를 재현 탁. 사용할 때까지 4 °의 C 또는 약 2 개월에 보관하십시오.
- 처리의 날, S. 희석 원래 S. 1 ㎖를 추가하여 단계 2.2.7에서 티아 균 배양 50㎖의 원심 분리 관에서 PBS 완충액 39 mL를 1X로 티아 균 배양.
- 세라 티아 균 성장을 국물과 접시를 준비합니다.
- 코어 프로세싱 및 보존 기어 차가운 실내 공간을 준비
- 1 % 표백제 용액으로 냉장실 깨끗한 벽, 바닥, 금속 테이블 놀 이전.
- 약에 냉장실의 설정 온도 -11 ° C ~.
- 추운 방에 원하는 온도에 도달하면, 냉장실과 샘플에 어떤 오염을 줄이기 위해 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용한다.
참고 : 두 제대로 옷을 입고 개인이 절차가 필요합니다. - 멸균 재료를 가지고 (예를 들면, 알루미늄 호일, 금속 선반, 유리, 트레이, S. 티아 균의 문화, 마일멸균 테이블에 냉장실과 장소에 crotome 블레이드) 및 샘플.
- 추운 방 시설에서 영구 동토와 얼음 코어 프로세싱
- 알루미늄 호일의 멸균, 핵산 무료 시트에 영구 동토 코어를 놓습니다.
- 가볍게 S.의 희석 배양에 코어의 외부 접종 티아 균은 살균 발포 플러그 (도 2b)를 사용.
- 트레이 위에 앉아 멸균 금속 선반에 코어를 배치합니다.
- 70 % 에탄올, DNA 제염 용액과의 RNase 염액과 스틸 마이크로톰 블레이드 소독.
- 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액과 개별 깨끗한 니트릴 장갑이 트레이 위 45 ° 각도로 코어를 개최합니다.
- 개별 B 부드럽게 개별 A는 각 크레이프 후의 코어 (회전 동안 멸균 블레이드를 사용하여, 말단을 포함한 전체 코어의 외측 대략 5mm를 긁어 가지고
- 개별 A는 용액이 주입 될 때 코어 (도 2D, 3C)를 회전하면서 개인 B는 신중하고 신속하게 핵심을 통해 필터 살균 95 % 에탄올을 부어 있습니다.
- 개인 B 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어 있습니다.
- 새로운 멸균 금속 랙 트레이에 사용되는 금속 랙을 장착합니다.
- 개인 A가 트레이 위 45 ° 각도로 코어를 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액으로 자신의 니트릴 장갑을 청소하고 유지하게한다.
- 개인 B가 DNA의 오염 제거 용액으로 전체 코어를 살포해야합니다.
- 개인 B 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어 있습니다.
- 개인 B가 된 RNase의 오염 제거 용액으로 전체 코어를 살포해야합니다.
- Individu이알 B는 즉시 필터 멸균 수와 코어를 씻어.
- 알루미늄 호일의 멸균 시트에 핵심을두고 가볍게 마무리.
- 해동 외부 코어
- 층류와 멸균 biohood에서 멸균 유리 접시 위에 멸균 금속 선반을 두십시오.
- S. 특정이 한천 플레이트를 배치 멸균 랙 아래 유리 접시에 티아 균은 코어 (그림 2E)로부터 액체를 수집합니다.
- 멸균 금속 선반에 코어를 배치합니다.
- (평균이 약 10 분 이내에 발생) 코어의 외부 표면의 약 2-5mm 23 ° C에서 해동하도록 허용합니다. 약 90 매 2 분을 핵심으로 돌립니다.
- 멸균 집게와 멸균 유리 섬유를 사용하여 코어의 전체 표면을 면봉과 S. 두 한천 플레이트 특정 접종 판의 표면에이 물질을 보라고하여 티아 균. 원래 문화에 두 개의 새로운 판을 접종하면 외부를 도핑하는 데 사용냉장실의 낮은 온도에 노출 코어.
- 근처 멸균 통치자를 배치하지만 핵심을 터치하지 않음으로써 해동 원통형 코어의 외부 치수를 측정한다.
- 큰 무균 가방에 핵심을두고 -80 ° C에서 보관합니다.
- 성장 확인
- 일주일 동안 23 ° C에서 한천 플레이트를 품어.
- S.의 성장을위한 한천 플레이트를 검사 티아 균 식민지.
- 접시에 보이는 식민지가없는 경우, 2.5.3 단계로 진행합니다.
- 식민지가 접시에 나타나는 경우, 섹션 2 "영구 동토와 얼음 코어 프로세싱 '의 단계 2.1.1에서 반복합니다.
- 냉장고에서 코어를 구하여 무균 멸균 가방에 전송할 수 있습니다.
- 전체 코어를 해동 약 24 ~ 48 시간 동안 4 ° C에서 멸균 가방의 핵심을 저장합니다.
3. 얼음 코어 및 영구 동토에서 핵산 추출에 대한 표본을 얻습니다
- 빙하 코어에서 핵산 추출
- 부드럽게 가방 (그림 2G)를 교반하여 빙하 코어에서 해동 재료를 섞는다.
- 미생물을 수집하고 진공하에 0.22 μm의 필터로 멸균 용기에 해빙 물질을 붓는다.
- 무균 살균 집게로 필터를 제거하고 멸균 2 ml의 세라믹 비드 튜브 (1.4 mm)에 넣습니다.
- -80 ° C에서 필터를 저장합니다.
- 영구 동토 코어에서 핵산 추출
- 부드럽게 가방을 반죽하여 영구 동토층 코어에서 해동 재료를 섞는다.
- 영구 동토층이 잘 혼합 한 후, 멸균 scoopula으로 약 0.5 g 벌크 토양의 표본을 얻고 균형에 똑바로 앉아 칭량 멸균 2 ml의 세라믹 비드 스크류 캡 튜브 (1.4 mm)에 넣습니다.
- -80 ° C에서 보관 부 표본.
- 샘플의 중량 수분 함량을 얻습니다.
- steril와 영구 동토층의 10g을 측정균형에 칭량 주석의 전자 scoopula과 장소. 영구 동토층 및 주석의 젖은 질량을 측정한다.
- 24 시간 동안 105 ° C로 설정 오븐에서 영구 동토층을 품어. 영구 동토층 및 주석의 건조 질량을 측정한다.
- 영구 동토층의 건조 질량 영구 동토의 젖은 질량을 뺀 영구 동토층의 건조 질량 나누어 중량 수분 함량을 계산합니다.
- -80 ° C에서 보관 영구 동토.
4. 영구 동토 얼음 코어에서 핵산을 추출
- 재료 준비
- 37 ° C 및 고압 증기 멸균에서 O / N을 배양, 0.1 % 디 에틸 피로 카보 (DEPC)로 처리하여 솔루션을 보유 황색 유리 병을 준비합니다.
- 240 mM의 인산 칼륨 완충액을 준비한다. 인산 칼륨 일 염기의 2.5 g 및 인산 칼륨 이염의 38.7 g을 추가합니다. 멸균 물을 첨가하여, 500㎖에 최종 볼륨을 조정합니다.
- 헥사 데실 브로마이드 (CTAB) 추출 버피 준비FER 80 ml의 물에 4.1 g의 염화나트륨을 용해시키고, 가열 및 교반하면서 천천히 10g의 CTAB를 추가하여. 멸균 물을 첨가하여 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다.
- 인산염 완충 용액의 동일한 볼륨을 추가 CTAB는 버퍼 및 필터는 0.22 μm의 필터로 살균. RT에서 알루미늄 호일 및 저장 병을 커버.
- 9.35 g의 NaCl, 100 ml의 멸균을 조합하여 1.6 M 염화나트륨 수용액 (염화나트륨)을 준비한다. 1.6 M NaCl 용액 및 필터 소독에 10g의 폴리에틸렌 글리콜 8000을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 핵산 그리피스 등의 등의 수정 된 버전에 따라 추출. 22 Töwe 등. (23)
- 경량 정장, 니트릴 장갑 및 마스크를 착용 할 것. 청정 실험실 공간 및 70 % 에탄올, DNA 오염 제거 솔루션과의 RNase의 오염 제거 용액을 피펫.
- 세라믹 비드 나사-CA 2 ㎖에 (얼음 코어 또는 영구 동토 토양 샘플에서 필터) 표본을 제거실온에서 -80 ° C의 냉동고와 해동에서 페이지 관.
- 간단히 헥사 데실 브로마이드 (CTAB) 추출 버퍼와 소용돌이의 0.5 ML을 추가합니다.
- (: 24 : 25 1) 페놀 - 클로로포름 - 이소 아밀 알코올의 0.5 ml의 추가 (산도 8)과 vortexer를에 평판 어댑터를 사용하여 10 분 동안 수평 튜브를 흔들.
- 4 ° C에서 5 분 동안 16,100 XG에 비드 박동, 원심 분리기 튜브에 따라.
- 새로운 멸균 1.5 ㎖의 튜브에 수성 층을 제거하고 클로로포름 - 이소 아밀 알콜의 동량 혼합 (24 : 1). 4 ℃에서 5 분 동안 16,100 XG에 원심 분리기.
- 새로운 멸균 1.5 ML 튜브에 수성 층을 제거하고 30 % 폴리에틸렌 글리콜 8000 및 1.6 M의 NaCl이 볼륨을 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 품어.
- 4 ℃에서 10 분 동안 16,100 XG에 원심 분리기.
- 4 ° C에서 10 분 동안 16,100 XG에 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 및 원심 분리기의 약 500 μL와 핵산 펠렛을 씻으십시오.
- 2 시간 동안 멸균 biohood 공기 건조 펠렛. 50 μL의 DNase의 /의 RNase가없는 TE 버퍼에 재현 탁 (PH 8.0). DNA는 PCR 및 qPCR에 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다.
- 분광 광도계로 DNA의 농도를 결정합니다.
- 반응 당 20 NG를 달성하기 위해 멸균, DNA가없는 물과 DNA를 희석.
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Representative Results
제시된 방법은 영구 동토층에 빙하 얼음에서 다양한 빙권 환경에서 수집 된 냉동 샘플의 오염을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 특히 공학 연구 개발 센터에서 수집 얼음과 영구 동토층 샘플로부터 수집 된 데이터 제시 - 폭스, AK에있는 냉전 지역 연구 및 공학 연구소 (ERDC - CRREL) 영구 동토 터널 (그림 1A 및 1B). 영구 동토층 터널 골드 스트림 계곡의 측면으로 약 110m를 확장하고 얼음이 풍부한 미사와 충적층 30 ~ 31에 대한 액세스를 제공합니다. 얼음 쐐기 및 냉동 토양 샘플은 신중하게 샘플링 당시 2014 년 10 월 24 일 터널의 벽에서 세중의 수집, 영구 동토층 벽의 온도는 -2.9 ° C이었다. 샘플에서 35m와 60m의 터널 포털, 냉동 토양에서 얼음 쐐기 기능이 약 27m에서 수집터널의 포털 (도 1C 및 1D). 특별한주의는 얼음과 영구 동토층 코어 (그림 1E)의 오염을 제한하기 위해 시료를 수집하는 동안 촬영했다. 냉동 된 코어는 우리의 오염 제거 프로토콜 (그림 2) 처리를 위해 하노버, NH의 CRREL 토양 미생물학 실험실에 드라이 아이스에 운반에 따라 처리 하였다.
모든 코어가 무균 마이크로톰 블레이드 및 솔루션 (도 3A, B, 및 C)를 이용하여 제 2 장에 설명 된 프로토콜을 이용하여 처리 하였다. 본 연구의 목표는 성공적 재료가 증착시에 존재하는 미생물 군집을 결정하는 냉동 샘플에서 내인성 핵산을 추출 하였다. 제염 프로토콜 성장 후방 대한 페트리 접시 세라 티아 균의 희석 배양에 코어를 도핑하고 조사하여 평가 하였다어 코어 (31)를 처리 하였다. S.의 부재 티아 균 콜로니 외래 미생물 적절히 코어의 외주부로부터 제거 된 것으로 나타났다. 그러나 콜로니의 부재는 외인성 DNA가 상기 코어의 외주부로부터 제거되었는지 여부를 표시하지 않을 것이다. 따라서, 우리는 세라 특검팀에서 DNA를 확인하기 위해 얼음 코어에서 샘플을 염기 서열. 얼음 쐐기에서 미생물 풍요 로움이 영구 동토층에 비해 가능성이 유의하게 낮았다 때문에, 우리는 S.에서 DNA를 결정하기 위해 얼음 코어를 사용 티아 균은 오염 제거 프로토콜 다음있을 것입니다. 코어가 제대로 소독되지 않은 경우, S. 관련 시퀀스 티아 균은 샘플에 존재하는 것으로 예상된다. (4)는 16S rRNA의 유전자 서열 분석 결과에서 얼음 코어 내의 저 세균 다양성을 나타낸다. 시퀀스는 슈도모나스 특검팀 관련.의 문 Gammaproteobacteria의, 얼음 SAMPL을 지배에스. Planctomycetia 관련 회원은 얼음에 존재하지만 작은 범위에도 있었다. 특히 주목할 세라 특검팀의 부재이다. 시퀀싱 결과, 오염 제거 프로토콜은 충분히 외래 DNA를 제거 할 것을 제안.
또한, 핵산의 추출시의 오염의 추가 위험이있다. 부정적인 추출 공백은 외인성 핵산에서 오염을 나타 내기 위해 사용되었다. 샘플 및 음성 대조군의 DNA는 qPCR에를 사용하여 증폭 하였다. qPCR에 데이터가 영구 동토가 박테리아를 숨겨 것으로 나타났다하지만, 고세균은 영구 동토 (표 1)에서 검출되지 않았다. 성공적인 오염 제거가 더 컨트롤의 긍정적 증폭과 함께, 추출 공백에 세균이나 고세균 증폭의 부족에 의해 입증되었다, 슈도모나스 (Pseudomonas)는 fluorescens 및 Halobacterium의 salinarum (표 1). abundANCE 측정은 60m 코어 (표 1)과 비교하여 포털에서 35m 수집 코어 사이 박테리아 개체수 유의 한 차이가 없었다 것으로 나타났다. 진행중인 연구가 미생물 커뮤니티 조성물 코어 사이 달랐다 여부를 결정하기위한 활발한 연구가 진행되고있다.
페어 뱅크스 근처 그림 1. 샘플 사이트, AK. 페어 뱅크스, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html)의, (B) ERDC - CRREL 영구 동토 터널, (C) 컬렉션 (A)지도 SIPRE 오거, (D) 오거의보기 입력 영구 동토 벽, 및 (E) 보관의 핵심을 준비를 사용하여 영구 동토층 코어. 버전 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 시온.
냉동 재료를 오염 제거 그림 2. 도식. (A) 냉동 재료 (예를 들면, 얼음 코어 또는 영구 동토 코어)가 추운 방에 처리됩니다. (B는) 그것은 의도적으로 박테리아 문화에 오염된다. (C)는 코어 외주 5mm 부분을 제거하는 무균 마이크로톰 블레이드 면도. 용액 (D)을 시리즈는, 상기 샘플의 외부 부분의 오염을 제거하기 위해 적용된다. DDS는 DNA의 오염 제거 용액을 나타내며 RDS가 된 RNase의 오염 제거 용액을 나타냅니다. RT 유지 살균 biohood에 코어를 배치함으로써, (E) 상기 물질의 외부 2-5mm가 해동. 얼음 또는 영구 동토층에서 똑똑 떨어지는 액체는 페트리 접시에서 수집되고, 코어 채취되고 있는지 확인하기 위해 도금 코어 적절히 정화 하였다. (F 및 G) 박테리아의 성장이 검출되지 않은 경우, 코어는 멸균 용기에 4 ℃에서 해동된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무균 상태에서 차가운 방에서 영구 동토 코어의 그림 3. 오염 제거. (A)는 긁어에 의해 금속 마이크로톰 블레이드와 영구 동토층 코어의 외부 층을 제거합니다. (B)는 부스러기의 자세히보기. (C) 솔루션 린스는 코어의 외부 층의 오염을 제거 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
얼음 쐐기 샘플 4. 미생물 순서를 그림. 비율로 얼음 쐐기 샘플에 존재하는 세균 문 (phyla)의 평균 상대 풍요 로움을 보여주는 막대 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영구 동토층 표 1. 세균성 풍부. 영구 동토층 샘플에서 박테리아와 관련된 추출 공백의 풍요 로움을 보여주는 qPCR에 결과. 테이블의 값은 평균 ± 표준 오차로보고됩니다. N은 샘플의 수이다. ND는 검출되지 나타냅니다.
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Discussion
빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 복구 된 분류군이 전체 역사적인 지역 사회를 대표하지 않을 수 있지만, 빙하와 영구 동토층 샘플의 분석에서 발견 한 사람들은 선택 기간 15 ~ 16에 대한 중요한 역사적인 정보를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 의미있는 생물학적 정보는 해동 (33)의 결과로 탄소 순환 과정을 조사 얼음 그린란드 빙상 (20)의 혐기성 활동을 조사 연구와 영구 동토 연구에서 도출되었으며 Beringia를 16 영구 동토층에서 진균 다양성에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 다운 스트림 실시하는 것은 이러한 냉동 재료 내에서 생물학적 사회 조사를 분석하기 전에 적절한 샘플 수집 및 오염 제거가 발생합니다. 다음 단계는 데이터를 해석에 중요한 의미를 가지고 있지만, 많은 연구가 w 방법 샘플에 대한 구체적인 정보를 제공하지 않습니다조립식 수집 및 처리 또는 이미지는 냉동 재료를 처리하는 방법을 보여주는. 이들 물질의 정확한 농도는 설명되지 않았다하더라도, 예를 들어, 이전의 연구는, 형광 마이크로 스피어 또는 공지 된 세균 15 코어의 외부 부분을 첨가 하였다. 다른 연구 상세히 제염 프로토콜을 설명했지만, 높은 스루풋이 방법 (15), (32)의 효능을 테스트하기 위해 분석을 적용하지 않았다. 따라서, 그대로 세균 배양 접시와 qPCR에의 성장을 통해 외인성 DNA의 상세한 선별 여부를 결정하는 데 사용 된 샘플 수집, 보존, 분석 절차는 냉동 재료에 존재하는 미생물 커뮤니티를 식별하기에 충분 멸균했다.
이 프로토콜은 성공적으로 고대 코어의 관심의 유전 물질을 분리하도록 수정되었습니다. 이러한 수집, 처리 및 추출시주의해야 특정 장비를 착용하고 공급을 오염 제거로 케어오염 이후 코어에서 이온 모든 단계에서 발생할 수 있습니다. 코어가 운송 중에 녹여 경우, 코어의 외부 영역에서 오염 물질이 상기 코어의 내측으로 이주 할 수있는 더 높은 경향이 있기 때문에 또한, 드라이 아이스 또는 유사한 냉각제와 코어를 배송하는 것은 필수적이다. 또 오염의 가능성을 최소화하기 위해, 전동 오거 아닌 푸시 코어 큰 코어를 수집 고려한다. 우리는 푸시 코어 제대로 긁어 단계에서 오염을 제거하기에 너무 작은 것으로 나타났다. 대안 적으로, 샘플의 더 큰 부피는 생체 물질의 낮은 풍부한 샘플 특히 중요 큰 코어로부터 추출 될 수있다. 또한, 더 큰 볼륨 세라 티아 균의 식민지가 판에서 감지 된 경우, 다음 코어가 충분히 큰 다시 처리 할되도록 오류에 대한 더 많은 공간을 제공한다.
다양한 용품이 가장 효율적으로 결정하기 위해 시험 하였다방법은 코어 오염을 제거합니다. 예를 들어, 멸균 된 알루미늄 박 코어 허용 유리 접시 또는 플라스틱 재료를 쉽고 빠르게 멸균 화면에 배치하기보다는. 또한, 이러한 비 전통적인 금속 랙과 같은 용품 및 트레이 재 오염 코어의 위험을 감소 긁어 외부 물질이 떨어져 코어로부터 쌓이는 것이 유리한 것으로 입증되었다. 프로토콜의 이전 반복에서, 스크래핑 오염의 위험을 증가 평평한 표면에 발생했습니다. 마지막으로, 오히려 유리 접시보다 무균 가방은, 혼합 및 샘플을 저장에 도움이되는 것으로 밝혀졌다.
이 프로토콜은 고정 된 코어의 외주부에 미생물 핵산을 제거하기 위해 표적되었다. 이소프로판올 및 에탄올 효과적인 소독제를하지만, 그들은 핵산을 제거하지 마십시오. 따라서, 핵산을 상기 코어의 외부 부분으로부터 관련된 효소를 제거 용액을 사용 하였다. 이 SOLUTIONS는 일반적으로 실험실 소모품 및 장비에서 핵산 및 관련 클레아 제를 제거하는 데 사용됩니다. 실험실 표면에 자신의 효과를 테스트 할 때, RNA 오염 제거 솔루션은 DNA의 오염 제거 용액 (34)보다 더 외인성 물질을 제거. 관심의 유전 물질은 또한 특정 유기체의 낮은 풍부한 샘플에서 제거 할 수 있기 때문에 코어의 외측 부분의 오염을 제거하기 위해 뉴 클레아 제를 사용하면 항상 바람직한 방법하지 않을 수 있습니다. 특히, 시간의 연장 기간 동안 영구 동토층과 얼음에 저장 유전 물질은 분해를 받아야. 미생물이 알래스카 샘플에서 높은 풍부하기 때문에, 용액이 내인성 유전자 물질의 높은 비율을 제거 할 우려가 크게 감소 하였다. 낮은 풍부 생물에서 심각하게 저하 된 또는이다 한 핵산이 제거되지 않도록 클레아가 포함 된 용액을 사용하는 경우에는주의를 기울여야합니다뉴 클레아.
S.의 부재 페트리 접시에 티아 균 식민지는 그대로 세포가 영구 동토 코어의 바깥 부분에서 제거 된 확신을 제공했다. 또한, 동일한 프로토콜을 시행 빙핵 분석 S. 관련된 검출 가능한 서열 없었다 티아 균. 시퀀스 결과는 슈도모나스도 모두 슈도모나스 특검팀하지만, 이러한 샘플에서 검출 된 것으로 나타났습니다. 와 세라 티아 SP. 클래스 Gammaproteobacteria에 있습니다. S.의 함께, 부재 페트리 접시와 qPCR에에서 DNA의 증폭의 부재에 티아 균 식민지는 냉동 코어가 성공적으로 정화 된 것이 좋습니다. 따라서, 검출 된 미생물 가능성이 오히려 오염보다 시추 또는 코어를 처리에서, 동결 물에 포함되었다. 기타 드릴링 기술은 더 깊이에서 토양 또는 얼음을 관통하는 유압 시추를 포함한다. 이 방법 woul 비록이 빈 영양 환경에서 낮은 미생물 풍부 조사 도움이 될 거라고, 그것은 시추 유체가 성공적으로 제거 될 수 있는지 여부를 공개하지 않습니다. 높은 처리량 시퀀싱 하류 분석의 일부가 아닌 경우 또한, 특정 PCR 반응은 S. 타겟팅 티아 균 추출한 DNA를 증폭하기 위해 사용되어야한다.
예 데이터 세트의 결과는 그대로 게놈 DNA가 성공적으로 동결 된 재료에서 추출 된 것으로 나타났다. 또한, 모두 영구 동토층과 얼음 쐐기 숨겨 박테리아, 각각 qPCR에 시퀀싱에 의해 입증. 알래스카 샘플 티베트 칭하이 성 고원, 중국 (36)의 활성 층 / 영구 동토 토양에서 영구 동토층보다 크기 적은 수의 박테리아의 순서를 포함하지만이 연구에서 알래스카 불연속 영구 동토는 캐나다의 높은 북극 (35)에 영구 동토층과 유사한 세균 수를 포함 누나 부트 준주, 캐나다 37. 는 I와 유사누나 부트 준주, 캐나다 (37)에 수집 된 가전 웨지는 토양에 공통 및 대사 다양 구체적으로 슈도모나스 (Pseudomonas), Gammaproteobacteria 관련 시퀀스는이 연구에서 알래스카 얼음 쐐기를 지배했다. 사실, 카타야마 등. ERDC - CRREL 영구 동토 터널에서 얼음 웨지 중 하나의 문 (phyla) 방선균, 바실러스 및 Gammaproteobacteria 내에서 11 격리 된 박테리아. 이러한 연구이 연구에서 Gammaproteobacteria 검출 확증. 수생 샘플에 공통 Planctomycetia은 또한 얼음 웨지에서 검출되었다. 이 생물은 칭하이, 중국 39 티벳 고원에서 영구 동토층에 추가하여, 북동부 시베리아 (38)의 영구 동토층 위에 활성층의 토양에서 발견되었다.
많은 연구 영구 동토층의 해빙으로, 메탄 가능성이 더욱 활성화 될 것으로 개념, contri으로, 영구 동토에, 고세균, 특히 메탄의 존재를 조사 하였다대기 21, 33 ~ 34로 메탄의 유출에 buting. 놀랍게도, 고세균은 유리 고세균과 크렌 고세균 모두 캐나다 높은 북극 (17)로부터 영구 동토층에서 발견 된와 메탄 러시아 (21)에 북극 툰드라의 영구 동토층 샘플에서 발견되었다하더라도 알래스카 얼음 쐐기 또는 영구 동토 샘플에서 검출되지 않았다.
냉동 재료는 년 전에 수천 발생 생지 화학 과정의 기록을 제공, 고대 미생물을 항구. 냉동 재료를 해동 할 때 한 번 빙권 환경에서 제한 된 미생물이 해방 될 수 있기 때문에 생물 다양성은 현재의 기후 온난화 정권에서 큰 관심이다. 자신이 동결 재료 숨겨 생물학적 다양성을 식별하기 위해, 고정 된 통 얼음 샘플을 제대로 처리 및 정화되어야한다. 여기, 우리는 ensu에 냉동 샘플 외국 세포와 DNA를 제거하는 프로토콜을 제시검출 미생물 오염보다 오히려 드릴링 코어 처리에서, 물질로부터라고 재.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
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