Summary
Kryosfären ger dig tillgång till bevarade organismer som pågått under tidigare miljöförhållanden. Ett protokoll presenteras för att samla in och sanera permafrost kärnor av jordar och is. Frånvaron av exogena kolonier och DNA tyder på att mikroorganismer detekteras representerar materialet, snarare än förorening från borrning eller bearbetning.
Introduction
Kryosfären (t.ex. permafrost jordar, is funktioner, glacial snö, Firn och is) ger en inblick i vilka typer av organismer kvarstod under tidigare miljöförhållanden. Eftersom dessa substrat kan vara tiotals till hundratals tusentals år gamla, deras mikrobiella samhällen, när bevarade frysta sedan deponering, speglar gamla miljöförhållanden. Att på lämpligt sätt analysera dessa ekosystem och extrahera meningsfull biologisk information från frysta jordar och is, korrekt insamling och bearbetning av de frysta proverna är nödvändigt. Detta är av yttersta vikt eftersom klimatprognoser för det 21: a århundradet indikerar potential för en uttalad uppvärmning i arktiska och subarktiska områden 1. Specifikt, Inre Alaska och Grönland förväntas värma cirka 5 ° C och 7 ° C, respektive år 2100 2,3. Detta förväntas avsevärt påverka mark och vatten mikrobiella samhällen, och därför tillhörandebiogeokemiska processer. De varmare temperaturer och förändrad nederbörd regimen förväntas initiera permafrost nedbrytning i många områden 2-5 vilket kan leda till en tjockare, säsongs tinas (aktiv) skikt 6,7, upptining av frysta jordar, och smältning av massiva is organ såsom marken is, is kilar, och segregation is 8. Detta skulle dramatiskt förändra de biogeokemiska attribut utöver den biologiska mångfalden av växter och djur i dessa ekosystem.
Glaciäris och syngenetic permafrost sediment och is funktioner har fastnat kemiska och biologiska bevis för en miljö som representerar vad bodde där vid tidpunkten funktioner bildas. Till exempel i Inre Alaska, både Illinoisan och Wisconsin åldern permafrost är närvarande och detta permafrost i synnerhet ger unika platser anor från modern till 150.000 år före nutid (YBP) som innehåller biologiska och geokemiska bevis på ImpaCT av tidigare klimatförändringar på biologisk mångfald. Som ett resultat av dessa sediment ge en dokumentation av biogeokemi och biologisk mångfald under många tusen år. Eftersom området har låga sedimenteringshastigheter och har aldrig varit istäckt, ostörda prover är tillgängliga för insamling och analys, antingen borrning vertikalt i jordprofilen eller borrning horisontellt i tunnlar. Ännu viktigare, finns omfattande register som särskilt lyfta fram de unika biogeokemiska funktioner i permafrost i denna region 9-14. Specifikt tillämpningen av DNA-analys uppskatta förekomsten och omfattningen av den biologiska mångfalden i både existerande och gamla isen och permafrostprover möjliggör utforskning av kopplingen av gamla miljöförhållanden och livsmiljö för ockupation av specifika organismer.
Tidigare studier har identifierat klimatpåverkan på däggdjur, växter och mikroorganismer från prover som går till 50k YBP 11, 15-19, men varje studie använde en different metod för att samla in och sanera de permafrost eller iskärnor. I vissa fall har borrkärnorna steriliseras 16, 20-21, även om särskild metod inte klargöra om utländska nukleinsyror också eliminerades från proverna. I andra studier, isolerar bakterier 15 (t.ex. Serratia marcescens) samt fluorescerande mikrosfärer 22 har använts för att mäta effekten av saneringsförfaranden.
Detta experiment var en del av en större studie som undersökte mikrobiella samhällen från permafrost prover som går tillbaka till ca 40k YBP. Det särskilda syftet med denna del av studien var att framgångsrikt sanera is och permafrost kärnor. Såvitt vi vet har ingen metod integrerat användningen av lösningar som är utformade för att eliminera främmande nukleinsyror och associerade nukleaser från den yttre delen av de frysta kärnor. Detta trots det faktum att dessa lösningar är commonly används för att sanera laboratorieutrustning för molekylär experiment.
När kärnorna dekontamineras, extraherades genomiskt DNA med användning av de protokoll som utvecklats av Griffiths et al. 23 och et al. Towe 24, kvantifieras med hjälp av en spektrofotometer, och utspäddes med sterilt, DNA-fritt vatten för att uppnå 20 ng per reaktion. Bakteriella 16S rRNA gener förstärktes med primer 331F och 797R och sond BacTaq 25 och archaeal 16S rRNA gener förstärktes med primers Arch 349F och Arch 806R och prob TM Arch 516F 26 på följande villkor: 95 ° C under 600 sekunder följt av 45 cykler av 95 ° C under 30 sekunder, 57 ° C under 60 sek, och 72 ° C under 25 sek med slutlig förlängning vid 40 ° C under 30 sek. Alla qPCR Reaktionerna utfördes i duplikat. De 20 | il reaktionsvolymer ingår 20 ng DNA, 10 | iM av primers, 5 uM av sonden, och 10 | il av den qPCR-reaktionsblandningen. standarder for bakterier och archaeal qPCR framställdes med användning iskt DNA från Pseudomonas fluorescens och Halobacterium salinarum, respektive. Båda odlades till logfas. Platträkningar utfördes och DNA isolerades från kulturerna. Genomiskt DNA kvantifierades med en spektrofotometer med antagandet av en och sex kopior av 16S rRNA-genen per genomet för H. salinarum och P. fluorescens, respektive 27-28. Antalet kopior av den bakteriella och archaeal gener beräknades baserat på standardkurvan, log-transformerade att redogöra för ojämlika skillnader mellan behandlingarna, och bedömas av ANOVA.
Gemenskap sammansättning bestämdes genom sekvensering av 16S rRNA-genen med hjälp av flödesceller och bro teknik för förstärkning och analys av de samhällen med "kvantitativa insikter mikrobiell ekologi" (QIIME) 29. Framåt och bakåt läser förenades tillsammans och sedan sekvenser filtrerades, indexeras,och företrädare på hög kvalitet valdes för de novo operativa taxonomiska enheter (OTU) uppdrag genom sekvensinpassning med en referensdatabas. Inpassade sekvenser jämfördes med en separat referensdatabas för taxonomisk uppdrag. En fylum nivå OTU tabellen skapades för att bestämma allmän gemenskap sammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av utrustning och permafrost Kärna Collection
- förberedelse utrustning och fältprov insamling och bevarande redskap
- Montera skruv för provsamling genom att sätta drivadaptern i toppen av cylindern och vrida spaken för att låsa den på plats. Nåla fast adapterröret på drivadaptern och nåla motorn på adapterröret. Sätt knivarna på trumman.
- Bär lätta kostymer, nitril och masker för att minska kontaminering till proverna. Använd öronskydd och hjälm för säkerhet vid inträdet i Permafrost tunneln (Figur 1).
- In i tunneln och välja en plats för att samla in prover (Figur 1B).
Obs: För vertikal eller horisontell borrning plats, välj ett område där det är känt bevis på att materialet är fryst (t.ex. is eller permafrost), finns det inga kända stort rotsystem, och det finns ingen känd grus. Ta bort alltlevande växtmaterial från området innan uppsamling av ett prov. Om borrning vertikalt eller horisontellt, välj ett område som är relativt platt och tillgängliga med skruven. - Förbereda en arbetsstation genom att skikta marken med ett plastmaterial som har steriliserats med 70% isopropanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning.
- Placera en 10 cm polyvinylklorid diameter klorid (PVC) rör snitt på längden på arbetsstationen för att ge ett tråg för att hålla kärnorna när de tas bort från skruven. Dekontaminera PVC-rör med 70% isopropanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning.
- Nära arbetsstationen, sanera skruven genom att spraya den med 70% isopropanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning. Ta lösningar från skruven med en torka.
- Is och permafrost kärn insamling och lagring
- Välja ett område av väggen till provet (se 1.2.1Notera).
- Sanera cirka 10 cm i diameter av fryst väggyta genom att torka den med 70% isopropanol, DNA sanering lösning, och RNas sanering lösning.
- Höj dekontaminerade skruven till det intressanta området så att den är vinkelrät mot provytan och börja borra i den rengjorda ytan på väggen (Figur 1C, D).
- Försiktigt bort skruven från provuppsamlingsområdet. Koppla bort skruven från motorn och placera skruven ovanför den sterila PVC-röret i den rena arbetsstation. Försiktigt luta skruvens så att de frysta kärnor glida ut på den sterila PVC-rör (Figur 1E).
- Sanera handskar med 70% isopropanol, DNA sanering lösning, och RNas sanering lösning.
- Plocka upp isen och permafrost kärnor med sterila handskar och placera dem i sterila påsar.
- Placera kärnorna i en kylare eller kylrum tills de transporteras eller bearbetas.
- ShIP frysta kärnor använder torris för att hålla dem vid en temperatur under 0 ° C.
- Omedelbart lagra kärnorna vid -80 ° C.
2. Permafrost och Ice core processorer
- materialet Framställning
- Förbereda steril, nukleinsyra fri tunga aluminiumfolie, metall ställningar, glas, metall pincett, och glasull genom bakning i en ugn vid 450 ° C under 4 h. Avsätt dessa material tills de användes.
- Sterilisera 95% etanol och ultrarent vatten genom att leda lösningarna genom ett 0,22 pm filter.
- Store etanollösning vid -20 ° C och vatten vid 4 ° C.
- Sterilisera en plastlinjal genom besprutning med 70% etanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning och omedelbart torka efter varje lösning.
- Bacterial Culture Framställning
- Förbered buljong och tallrikar att växa Serratia marcescens.
- För buljong, kombinera 5 g tryptone, 1 g glukos, 5 g jästextrakt, och 1 g kaliumfosfat dibasisk, och sedan Tillsätt destillerat vatten för att nå en L. För att göra plattor, 15 g agar till ovanstående blandning. För buljong och plåtar, justera pH till 7 och autoklavera vid 121 ° C under 15 min.
- Förbereda 1x fosfat buffed koksaltlösning (PBS) genom att kombinera 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g natriumfosfat dibasisk, och 0,24 g kaliumfosfat monobasisk och tillsätt destillerat vatten för att nå 800 ml. Justera pH till 7,4 och tillsätt destillerat vatten för att nå en L. autoklav vid 121 ° C under 15 min.
- Inokulera buljong med en steril ögla genom doppning i S. marcescens kultur som tidigare lagrades frysta vid -80 ° C. Under aseptiska förhållanden, seriell utspädd odlingen genom att tillsätta 1 ml av kulturen till 9 ml PBS och vänd lösningen. Tillsätt 1 ml av denna spädning till 9 ml PBS och vänd lösningen. Upprepa åtta gånger tills en 10 -9 dilution nås.
- Sprida de 10 -6, 10 -7, 10 -8, och 10 -9 lösningar på agarplattor genom att distribuera 1 ml buljong på plattan och sprids med en cell spridare. Gör detta i tre exemplar per utspädning. Lagra den ursprungliga kulturen vid 4 ° C.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 24 h. Räkna antalet kolonier för att beräkna antalet celler i den ursprungliga kulturen. Notera: Antalet kolonier i den ursprungliga kulturen kommer att bero på tillväxthastigheten för bakterien.
- Pipettera 250 | il av den ursprungliga kulturen in i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Späd ursprungliga kulturen genom tillsats av tillräckligt med volym av 1 x PBS för att erhålla cirka 10 9 celler / ml såsom bestämts genom räkning av kolonier i föregående steg. Pellets cellerna i ett mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 2500 xg under 10 min.
Obs: Den volym av 1 x PBS kommer att variera beroende på tillväxthastigheten för bakterien. - I en steril biohood, Pipettera av buljongen och suspendera cellerna i 1 ml 1x PBS-buffert. Lagra vid 4 ° C fram till användning eller cirka två månader.
- På dagen för bearbetning, späd S. marcescens kultur från steg 2.2.7 genom att tillsätta 1 ml av den ursprungliga S. marcescens kultur till 39 ml 1x PBS-buffert i en 50 ml centrifugrör.
- Förbered buljong och tallrikar att växa Serratia marcescens.
- Förbered kylrum utrymme för core processorer och bevarande redskap
- Innan kylning kylrummet, rena väggar, golv och metall bord med en 1% blekmedel lösning.
- Inställd temperatur av kylrummet till cirka -11 ° C.
- När det kalla rummet har nått den önskade temperaturen, slitage lätta kostymer, nitril och masker för att minska eventuell kontaminering till kylrummet och proverna.
Obs: Två ordentligt klädda personer krävs för denna procedur. - Föra de sterila material (t.ex., aluminiumfolie, metall ställningar, glas, bricka, S. marcescens kultur, och microtome blad) och prover i kylrummet och plats på den sterila bordet.
- Permafrost och is core processorer i ett kylrum anläggning
- Placera en permafrost kärna på en steril, nukleinsyra fri ark av aluminiumfolie.
- Lätt ympa utsidan av kärnan med den utspädda kultur av S. marcescens med en steril skumplugg (Figur 2B).
- Placera kärnan på den sterila metall rack som sitter ovanför en bricka.
- Sterilisera stål mikrotom blad med 70% etanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning.
- Har individen ren nitril med 70% etanol, DNA sanering lösning, och RNas sanering lösning och hålla kärnan i en 45 ° vinkel ovanför facket.
- Har individer B skrapa försiktigt ungefär 5 mm på utsidan av hela kärnan, inklusive ändarna, med hjälp av den sterila bladet medan individ En vänder kärnan efter varje skrapa (
- Har individer B pour filtersteriliserad 95% etanol över kärnan noggrant och snabbt, medan individ En vänder kärnan som lösningen hälls (fig 2D, 3C).
- Har Individuell B spola genast kärnan med filtersteriliserad vatten.
- Byt begagnade metall rack på brickan med en ny steril metall rack.
- Har individ En rengöra sina nitril med 70% etanol, DNA sanering lösning, och RNas sanering lösning och hålla kärnan i en 45 ° vinkel ovanför facket.
- Har Individuell B spraya hela kärnan med DNA sanering lösning.
- Har Individuell B spola genast kärnan med filtersteriliserad vatten.
- Har Individuell B spraya hela kärnan med RNas sanering lösning.
- har Individual B spola genast kärnan med filtersteriliserad vatten.
- Placera kärnan på en steril ark aluminiumfolie och lätt linda.
- Tö yttre kärna
- Placera en steril metall rack över en steril glasskål i en steril biohood med laminärt flöde.
- Placera två agarplattor som är specifika för S. marcescens i glasskål under sterila rack för att samla vätska från kärnan (Figur 2E).
- Placera kärnan på den sterila metall rack.
- Tillåt ca 2-5 mm av den yttre ytan av kärnan för att tina vid 23 ° C (i genomsnitt, kommer detta att inträffa inom cirka 10 min). Vrid kärnan ungefär 90 ° var 2 min.
- Tvätta hela ytan av kärnan med hjälp av steril pincett och steril glasull och ympa två agarplattor specifika för S. marcescens vid bomullstopp dessa material på ytan av plattorna. Inokulera två nya plattor med den ursprungliga kulturen som används för att dopa utsidan avkärna, som var utsatt för de låga temperaturer av kylrummet.
- Mäta yttermått tinades cylindrisk kärna genom att placera ett sterilt linjal nära, men inte vidrör kärnan.
- Placera kärnan i stora steril påse och förvara den vid -80 ° C.
- Kontrollera för tillväxt
- Inkubera agarplattor vid 23 ° C under en vecka.
- Undersök agarplattor för tillväxt av S. marcescens kolonier.
- Om det inte finns några synliga kolonier på plattan, gå vidare till steg 2.5.3.
- Om kolonier visas på plattan, upprepa från steg 2.1.1 i avsnitt 2 "Permafrost och iskärnan behandling".
- Erhålla kärnan från frysen och aseptiskt överföra den till en steril påse.
- Lagra kärnan i en steril påse vid 4 ° C i ungefär 24 till 48 timmar för att tina hela kärnan.
3. Skaffa delprov för Nucleic Acid Extraction från iskärnor och permafrost
- Nukleinsyra extraktion från iskärnor
- Blanda den tinade materialet från iskärnan genom försiktig omskakning av påsen (fig 2G).
- Häll den tinade materialet i en steril behållare med en 0,22 pm filter under vakuum för att samla in mikroorganismer.
- Aseptiskt bort filtret med steril pincett och placera den i en steril 2 ml keramiska pärla röret (1,4 mm).
- Lagra filtret vid -80 ° C.
- Nukleinsyra extraktion från permafrostkärnor
- Blanda den tinade materialet från permafrosten kärnan genom att försiktigt knådning av påsen.
- Efter permafrosten har väl blandat, erhålla ett delprov av cirka 0,5 g bulk jord med en steril Spatel och placera den i en tarerad sterila 2 ml keramiska pärla skruvkapsylröret (1,4 mm) som sitter upprätt på en balans.
- Butiks delprover vid -80 ° C.
- Erhålla gravimetrisk vatteninnehåll av prover.
- Mät 10 g permafrosten med en sterile Spatel och plats i en tarerad tenn på en balans. Mät våt massa av permafrost och tenn.
- Inkubera permafrost i en ugn inställd på 105 ° C under 24 h. Mät torrvikt permafrost och tenn.
- Beräkna gravimetrisk vattenhalten genom att subtrahera den våta massan av permafrost av torrvikt permafrost och dividera med torrvikt permafrost.
- Store permafrost vid -80 ° C.
4. Utdrag nukleinsyror från permafrost och iskärnor
- materialberedning
- Förbereda bärnstens ampuller för att hålla lösningar genom behandling med 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC), inkubering O / N vid 37 ° C, och autoklavering.
- Förbereda 240 mM kaliumfosfatbuffertlösning. Lägg 2. 5 g monobasiskt kaliumfosfat och 38,7 g kaliumfosfat dibasiskt. Anpassa den slutliga volymen till 500 ml genom tillsats av sterilt vatten.
- Förbered hexadecyltrimetylammoniumbromid (CTAB) utvinning buffer genom upplösning av 4,1 g natriumklorid i 80 ml vatten och långsamt tillsätta 10 g CTAB under uppvärmning och omrörning. Anpassa den slutliga volymen till 100 ml genom tillsats av sterilt vatten.
- Lägga lika stora volymer av fosfatbuffertlösning och CTAB-buffert och filtersterilisera med en 0,22 pm filter. Täck flaska med aluminiumfolie och förvara vid rumstemperatur.
- Förbereda 1,6 M natriumkloridlösning (NaCl) genom att kombinera 9,35 g NaCl och 100 ml sterilt vatten. Tillsätt 10 g polyetylenglykol 8000 till 1,6 M NaCl-lösning och filtrera sterilisera. Lagra vid 4 ° C.
- Nukleinsyra extraktion enligt en modifierad version av Griffiths et al. 22 och Towe et al. 23
- Bär lätta kostymer, nitril och masker. Ren laboratorieutrymme och pipetter med 70% etanol, DNA dekontamineringslösning, och RNas dekontamineringslösning.
- Ta delprov (filter från iskärnan eller permafrost jordprov) i 2 ml keramiska pärla skruv cap röret från -80 ° C frys och tining vid RT.
- Tillsätt 0,5 ml av hexadecyltrimetylammoniumbromid (CTAB) extraktionsbuffert och vortexa kort stund.
- Tillsätt 0,5 ml fenol-kloroform-isoamylalkohol (25: 24: 1) (pH 8) och skaka rören horisontellt under 10 minuter med användning av en platt-adapter på en virvelblandare.
- Följande vulst-stryk, centrifugrör vid 16.100 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Avlägsna vattenskiktet i ett annat sterilt 1,5 ml rör och blanda med en lika stor volym av kloroform-isoamylalkohol (24: 1). Centrifugera vid 16.100 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Ta bort vattenskiktet till en ny steril 1,5 ml rör och tillsätt två volymer 30% polyetylenglykol 8000 och 1,6 M NaCl. Inkubera under 2 h vid 4 ° C.
- Centrifugera vid 16.100 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta nukleinsyra pelleten med cirka 500 | il iskall 70% etanol och centrifugera vid 16.100 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Lufttorka pellet i en steril biohood under 2 timmar. Resuspendera i 50 ul DNas / RNas-fritt TE-buffert (pH 8,0). DNA är redo för tillämpningar efter såsom PCR och qPCR.
- Bestämma koncentrationen av DNA med en spektrofotometer.
- Späd DNA med steril, DNA-fritt vatten för att uppnå 20 ng per reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod kan användas för att sanera frysta prover som tagits från olika kryosfären miljöer, från glaciärisen att permafrost. Här presenterar vi uppgifter som specifikt samlats in från is och permafrost prov som tagits från Engineering Research and Development Center - kalla områden Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel ligger i Fox, AK (Figur 1A och 1B). Permafrosten tunnel sträcker sig ungefär 110 meter in i sidan av Gold dalen och ger tillgång till is rik silt och avlagringar 30-31. Prover från en iskil och frusen mark var omsorgsfullt samlas i tre exemplar från väggarna i tunneln den 24 oktober 2014. Vid tidpunkten för provtagning, temperaturen i permafrosten väggen var -2,9 ° C. Prover togs från en iskil funktion ca 27 m från portalen av tunneln, och frusen mark på 35 m och 60 m frånportalen av tunneln (Figur 1C och 1D). Särskild omsorg togs under provtagning för att begränsa förorening av is och permafrost kärnor (figur 1E). De frysta kärnorna hanteras i enlighet med vår sanering protokoll (Figur 2) och transporteras på torris till CRREL mark mikrobiologiska laboratoriet i Hanover, NH för bearbetning.
Alla kärnor bearbetades med hjälp av det protokoll som beskrivs i avsnitt 2 med sterila Eggen blad och lösningar (Figur 3A, B och C). Målet med denna studie var att framgångsrikt utvinna endogena nukleinsyror från frusna prover för att bestämma mikrobiella samhällen vid denna tidpunkt att materialet avsattes. Saneringsprotokoll bedömdes genom dopning kärnorna med en utspädd kultur av Serratia marcescens och sedan undersöka petriskålar för tillväxt akterutER kärnorna behandlades 31. Frånvaro av S. marcescens kolonier indikerade att de exogena mikroorganismerna korrekt bort från den yttre delen av kärnan. Skulle dock avsaknaden av kolonier inte indikera om exogent DNA avlägsnades från den yttre delen av kärnan. Därför sekvens vi prover från iskärnan för att kontrollera DNA från Serratia sp. Eftersom mikrobiell överflöd i iskil var sannolikt betydligt lägre än i permafrosten, använde vi iskärnor för att avgöra om DNA från S. marcescens skulle närvara efter sanering protokoll. Om kärnorna inte var ordentligt saneras, då sekvenser besläktade med S. marcescens skulle förväntas vara närvarande i proverna. Figur 4 visar den låga bakteriella mångfald inom iskärnan från 16S rRNA-genen sekvense resultat. Sekvenser relaterade till Pseudomonas sp., Av phylum Gammaproteobacteria, dominerade isen samples. Medlemmar som tillhör Planctomycetia var också närvarande i isen, men i mindre utsträckning. Av särskilt intresse är frånvaron av Serratia sp. I sekvenseringsresultaten, vilket tyder på att saneringsprotokoll bort tillräckligt exogen DNA.
Dessutom finns det en ytterligare risk för förorening vid utvinning av nukleinsyror. Negativa utvinning ämnen användes för att avslöja förorening från exogena nukleinsyror. DNA från proverna och negativa kontroller förstärktes med hjälp av qPCR. qPCR data visade att permafrosten hyste bakterier, men arkéer inte registreras i permafrosten (tabell 1). Framgångsrik sanering bevisades ytterligare av bristen på bakteriella eller archaeal amplikoner i utvinningsämnen, i kombination med en positiv förstärkning av kontrollerna, fluorescens Pseudomonas och Halobacterium salinarum (tabell 1). den abundringsmätningar visade att det inte fanns några signifikanta skillnader i bakterie överflöd mellan kärnorna samlats vid 35 m från portalen jämfört med 60 m kärnor (tabell 1). Pågående forskning pågår för att avgöra om mikrobiella kompositionen var annorlunda mellan kärnorna.
Figur 1. Exempel på platser nära Fairbanks, AK. (A) Karta över Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (C) insamling av permafrost kärnor använder SIPRE skruv (D) syn på skruv in permafrost vägg, och (E) förbereder kärnan för arkivering. klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.
Figur 2. Schematisk för dekontaminering av fruset material. (A) Den frysta material (t.ex., is kärna eller permafrost kärna) bearbetas i ett kallt rum. (B) Det är målmedvetet förorenat med en bakteriekultur. (C) Kärnan är rakat med en steril mikrotom blad för att ta bort mm delen yttre 5. (D) En serie av lösningar tillämpas för att ytterligare sanera den yttre delen av provet. DDS visar DNA sanering lösning och RDS visar RNas sanering lösning. (E) Genom att placera kärnan i en steril biohood hölls vid RT, tinar den yttre 2-5 mm av materialet. Vätskan som droppar från isen eller permafrost uppsamlas i petriskålar och kärnan svabbas och ströks för att kontrollera att kärnan var korrekt dekontamineras. (F och G) Om bakterietillväxt inte detekteras, då kärnan tinas vid 4 ° C i en steril behållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Sanering av permafrost kärnor i kylrum under sterila förhållanden. (A) Ta bort det yttre lagret av permafrosten kärna med en metall mikrotom blad genom skrapning. (B) En närmare titt på en skrapa. (C) Lösning sköljning att sanera det yttre skiktet av kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Microbial sekvenser från iskil prover. Stapeldiagram som visar den genomsnittliga relativa förekomsten av bakterie phyla närvarande i iskil prover av procentsats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Bakteriell överflöd i permafrost. QPCR resultat visar överflöd av bakterier i permafrosten prover och tillhörande utvinningsämnen. Värden i tabellen rapporteras som medelvärde ± standardfel. n är antalet sampel. ND indikerar inte upptäcks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryosfären ger dig tillgång till bevarade organismer som pågått under tidigare miljöförhållanden. Även den återvunna taxa inte kan representera hela historiska samhället, kan de återhämtat sig från analys av glaciäris och permafrost prover ge värdefull historisk information om utvalda tidsperioder 15-16. Till exempel har meningsfull biologisk information tagits från isen studier som undersöker anaerob aktivitet i Grönlands istäcke 20 och permafrost studier som undersöker kolets kretslopp processer som en följd av tö 33 och har gett insikt i svamp mångfald från permafrost i Beringia 16. Korrekt provtagning och sanering måste ske innan de utför nedströms analyser att undersöka biologiska samhällen inom dessa frusna material. Även om dessa steg har betydande konsekvenser för tolkningen av data, många undersökningar inte erbjuder specifika detaljer om hur proverna were samlas in och bearbetas eller bilder som visar hur man ska hantera de frusna material. Till exempel har tidigare studier dopade den yttre delen av kärnor med fluorescerande mikrosfärer eller kända bakterier 15, även om de exakta koncentrationerna av dessa material inte beskrevs. Andra studier har beskrivit saneringsprotokoll i detalj, men har inte tillämpats hög genomströmning analyser för att testa effektiviteten av metoden 15, 32. Därför är en detaljerad genomgång av intakta bakterier och exogena DNA genom tillväxt på petriskålar och qPCR användes för att bestämma huruvida den provtagning, konservering och analysförfaranden var steril nog att identifiera mikrobiella samhällen som förekommer i de frusna material.
Detta protokoll har ändrats för att framgångsrikt isolera genetiskt material av intresse från gamla kärnor. Skötsel såsom bära särskilda redskap och sanering leveranser måste tas under insamling, bearbetning, och extraktjon från kärnorna sedan kontaminering kan inträffa när som helst steg. Vidare, sjöfart kärnorna med torris eller en jämförbar kylmedel är absolut nödvändigt eftersom om kärnorna tina under transporten, då finns det en högre benägenhet att föroreningar från det yttre området av kärnan kan migrera till den inre delen av kärnan. För att ytterligare minimera risken för förorening, överväga att samla in större kärnor med en motoriserad skruv snarare än en push kärna. Vi fann att tryckkärnorna var för små för att ordentligt sanera i skrap steg. Alternativt kan en större volym av provet extraheras från de större kärnor, vilket är särskilt viktigt för prov med en låg förekomst av biologiskt material. Dessutom ger den större volymen mer utrymme för fel så att om Serratia marcescens kolonier detekteras på plattor, då kärnan är tillräckligt stor för att behandlas på nytt.
Olika leveranser testades för att bestämma det mest effektivametod för att sanera kärnorna. Till exempel, sterilt aluminiumfolie, snarare än glas rätter eller plastmaterial, som tillåts för kärnan som skall placeras på en steril yta snabbt och enkelt. Också, icke-traditionella förnödenheter såsom en metall rack och ett fack visat sig vara fördelaktigt att låta de skrapade yttre material för att ackumulera bort från kärnan, vilket minskar risken för återkontaminerande kärnorna. I tidigare versioner av protokollet, inträffade skrapning på en plan yta, vilket ökade risken för kontamination. Slutligen, sterila påsar, snarare än glas rätter, befanns vara gynnsamt att blanda och lagra proverna.
Detta protokoll var riktad för att eliminera mikroorganismer och nukleinsyror på den yttre delen av de frysta kärnor. Medan isopropanol och etanol är effektiva desinfektionsmedel, de inte avlägsna nukleinsyror. Därför framställdes lösningar som tar bort nukleinsyror och associerade enzymer från den yttre delen av kärnorna som används. dessa solutioner används vanligen för att avlägsna nukleinsyror och tillhörande nukleaser från laboratorieutrustning och utrustning. När testa deras effektivitet på laboratorieytor, bort RNA sanering lösning flera exogena material än DNA sanering lösning 34. Använda nukleaser att sanera den yttre delen av kärnan kan inte alltid vara den föredragna metoden eftersom genetiskt material av intresse kan också avlägsnas från prover med en låg förekomst av en viss organism. Framför allt genetiskt material som lagrats i permafrost och is under längre tidsperioder genomgår nedbrytning. Eftersom mikroorganismer i en hög förekomst i dessa Alaskan prover var oro för att de lösningar som skulle ta bort en stor del av endogena genetiska material kraftigt reducerad. Dock bör försiktighet iakttas vid användning av lösningar som innehåller nukleaser för att säkerställa att de nukleinsyror som har varit allvarligt skadad eller kommer från organismer i låg förekomst inte avlägsnas genomde nukleaser.
Frånvaro av S. marcescens kolonier på petriskålar under förutsättning förtroende för att de intakta cellerna avlägsnades från den yttre delen av permafrost kärnor. Vidare analys av iskärnor som genomgick samma protokoll visade inga detekterbara sekvenser relaterade till S. marcescens. Sekvens Resultaten visade att endast Pseudo upptäcktes i dessa prover, även om båda Pseudomonas sp. och Serratia sp. är inom klassen Gammaproteobacteria. Tillsammans, frånvaro av S. marcescens kolonier på petriskålar och frånvaron av DNA-amplikoner från qPCR tyder på att de frysta kärnor framgångsrikt saneras. Därför mikroorganismerna som detekterades var sannolikt inbäddade i det frusna materialet, snarare än kontaminering från borrning eller bearbetning av kärnorna. Andra borrtekniker inkluderar hydraulisk borrning för att tränga igenom marken eller is på större djup. Även om denna metod would vara fördelaktigt att undersöka låg mikrobiell överflöd i dessa oligotrofa miljöer, inte avslöjar det om borrvätskor skulle tagits bort. Dessutom, om hög genomströmning sekvensering är inte en del av den nedströms analys, specifika PCR-reaktioner inriktning S. marcescens bör användas för att förstärka den extraherade DNA.
Resultaten från vårt exempel dataset visade att intakt genom-DNA framgångsrikt extraheras från de frusna material. Såväl de permafrost och inlands kil hyste bakterier, vilket framgår av qPCR och sekvensering, respektive. Alaskan diskontinuerliga permafrosten från denna studie innehöll liknande bakterieantal som permafrost i den kanadensiska Arktis 35, även om Alaskan proverna innehöll en storleksordning färre bakterier än permafrost från den tibetanska platån i Qinghai-provinsen, Kina 36 och aktiva skikt / permafrostjordar från Nunavut, Kanada 37. Liknar en i:ce kil samlas i Nunavut, Kanada 37 sekvenser relaterade till Gammaproteobacteria, särskilt Pseudomonas, som är gemensamma för mark och metaboliskt mångskiftande, dominerade Alaskan iskil i denna studie. I själva verket, Katayama et al. 11 isolerade bakterier inom phyla aktinobakterier, Bacilli och Gammaproteobacteria från en av isen kilar från ERDC-CRREL Permafrost Tunnel. Dessa studier bekräftar detekteringen av Gammaproteobacteria i denna studie. Planctomycetia, vilka är gemensamma för vatten provet, detekterades även i isen kilen. Dessa organismer har hittats i aktiva lagret jord över permafrost i nordöstra Sibirien 38, förutom att permafrost i den tibetanska platån i Qinghai, Kina 39.
Många studier har undersökt förekomsten av arkéer, särskilt metanogener i permafrosten, med tanken att som permafrost tinar kommer metanogener sannolikt att bli mer aktiva, Contrivande till utflödet av metan till atmosfären 21, 33-34. Överraskande var arkéer inte registreras i Alaska iskil eller permafrost prover trots både Euryarchaeota och Crenarchaeota hittades i permafrosten från den kanadensiska Arktis 17 och metanogener hittades i permafrost prover från den arktiska tundran i Ryssland 21.
Frysta material hamn gamla mikroorganismer, vilket ger ett register över biogeokemiska processer som inträffade många tusen år sedan. Denna mångfald är av stort intresse under den nuvarande klimatuppvärmningen regim eftersom mikroorganismer som en gång var begränsade i kryosfären miljön kan bli befriade när de frysta material tina. För att tryggt identifiera biologiska mångfalden hyste i dessa frusna material, måste den frusna marken och is prover hanteras korrekt och saneras. Här presenterar vi ett protokoll för att avlägsna främmande celler och DNA från frysta prover till ensure att mikroorganismerna som upptäcktes var från materialet, snarare än förorening från borrning eller bearbetning av kärnorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
