Summary
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют внутреннюю способность к дифференцировке и самоорганизации в различных узоров ткани; хотя это требует представления пространственных градиентов окружающей среды. Мы представляем трафарета micropatterning как простой и надежный метод для генерации биохимических и механических градиентов для управления HPSC моделей дифференциации.
Introduction
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs), в том числе эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), широко эксплуатируются в регенеративной медицине, а также экспериментального моделирования нормальной и пораженной органогенеза из-за их дифференцировке в клеточные клоны всех трех зародышевых листков 1,2. Дифференцирования судьбы hPSCs очень чувствительны к местным факторам окружающей среды , которые могут модулировать аутокринные или паракринной сигнализации 1, а также процессы механотрансдукция , опосредованных физическими киев 3-5. Cell micropatterning включает в себя набор методов , которые были разработаны , чтобы пространственно организовать геометрию и расположение популяции клеток в качестве средства для управления местной сотовой связи микросреду, такие как межклеточных взаимодействий 6 и клетка-матрикс взаимодействий 3. В контексте hPSCs, ячейка micropatterning была использована, чтобы получить значительное понимание того, как ниши зависитлор аутокринная сигнализации модулирует чЭСК плюрипотентности-дифференциацию решений 7 и организации в ранних эмбриональных моделей дифференциации 6. 2D и 3D micropatterned hPSCs использовались для управления размером колоний многоклеточных узоров, которые , в свою очередь , повлияло дифференциации решений в трех зародышевых листков 8,9. Мы использовали многоклеточные micropatterns HPSC модулировать степень межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий внутри колонии HPSC зондировать , как интегрин-Е-кадгерин перекрестные помехи могут привести к клеточной судьбы неоднородностью 10. Демонстрации из вышеупомянутых докладов открытых новых путей в направлении применения многоклеточных micropatterns в hPSCs качестве экспериментальных моделей для скрининга токсичности препаратов для лечения заболеваний в области развития 11, для изучения влияния факторов роста и гормонов во время ткани или развития органов, а также распутать образование образцы тканей.
Мириады клеток micropatterметоды Ning были разработаны как рассмотрено Фальконе и др. и др. 12 , но лишь немногие, такие как микро-контакт печать 7,8,13, стрипы культура 14,15, photopatterning 6 и microstencils 16 были успешно реализованы с помощью hPSCs. Проблема с micropatterning hPSCs заключается в их уязвимости и строгих требований конкретных внеклеточного матрикса (ECM) и условий роста для прикрепления клеток и выживания. Для моделей 2D HPSC, микро бесконтактной печати является одним из наиболее распространенных методов для создания HPSC micropatterns по культуре ткани и стеклянные подложки 13. Метод может быть использован для формирования рисунка общего ЕСМ, используемой в HPSC культуре, в том числе ламинин и базальной мембраны матриц, таких как Матригель. Тем не менее, как правило , требует процесс покрытия двухэтапного автоматизированного поли-D-лизином, и нуждается в конкретных инертные атмосферы и влажности , чтобы сделать стабильные ECM micropatterns для hPSCs прикрепить на 6,13, Передовой рассмотрение каждого метода micropatterning, могут ли поверхность режим модификации генерируют HPSC-клеевые модели ECM на желаемой геометрической разрешением при одновременной минимизации неспецифической прикрепление клеток в прилегающих районах.
Здесь мы сообщаем использование трафарета micropatterning как простой метод для генерации HPSC micropatterns без дополнительных стадий модификации поверхности до генерации липких моделей ECM для hPSCs прикрепить на. Ячейка трафарет состоит из тонкой мембраны, например, полидиметилсилоксан (PDMS) листа с микрона до миллиметра размер сквозных отверстий запечатанных на подложку для культивирования клеток , чтобы физически содержать ECM покрытий и затем высевают hPSCs. В качестве трафарета структурирование работает физически сдерживая место, где HPSC может получить доступ и присоединить непосредственно к подложке, лежащий в основе ЕСМ с покрытием, этот метод совместим с различными субстратами, которые могут поддерживать HPSC культур. Только ТРЕБОВАНИЯт в том, что выбор трафарета материала может образовывать обратимый уплотнение с подложкой. Эти субстраты включают обычные тканевой культуры полистирола (ТКТ) 17, лиганд конъюгированные подложках 18, а также эластомерные субстраты с перестраиваемой жесткостью (например., PDMS) 19. Этот метод позволяет также покрытие различного ECM, такие как витронектина (или белка ВТН), ламинин и мембранные матрицы фундамента (например, Матригель и Geltrax) для обеспечения надлежащего крепления и дифференциации hPSCs. Таким образом, мы можем перевести оптимизированные конфигурации ECM-подложки для конкретной линии HPSC к трафарету micropatterning для оптимальной клеточной матрицы адгезии, выживание и дифференциации. В последнее время , подобный метод также сообщалось направить печени дифференцировки micropatterning ЭСК с использованием поли (метилметакрилат) (ПММА) микро-трафаретных массивов 16.
Клеточные трафареты могут быть изготовлены из различных материалов, в том числе метALS 20,21, поли (п-ксилилен) полимеры 22,23, PMMA 16 и наиболее часто, ПДМС 24-28. Кремний и поли (п-ксилилена) полимеры трафареты требуют прямого травления сквозных отверстий со специализированным оборудованием 20-23, что ограничивает их доступ к биологическим пользователям. PDMS трафареты могут быть изготовлены различными способами , в зависимости от размера элемента , необходимого, который находится в диапазоне от обычно от 3 мкм до 2000 мкм 11,26-29. Если небольшие особенности желательны, тонкие листы трафарета можно получить путем прессования PDMS форполимера на шаблоне микроизготовленном кремния , содержащего рельефы micropatterns 28. Для функций> 1000 мкм, лазерный резак CO 2 обеспечивает легкий и низкозатратным методом непосредственно вырезать узоры на предварительно отливают PDMS листа в процессе изготовления трафарета. Рециркулируемости PDMS трафареты также делает их экономически эффективным, чтобы провести серию экспериментов с достаточной последовательностью.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол описывает изготовление PDMS трафарет с 1000 мкм моделей с помощью лазерной резки и micropatterning из чЭСК линии, H9, используя трафарет PDMS.
1. Проектирование и изготовление PDMS трафарет для Micropatterning
- Дизайн трафаретной печати листа со сквозными отверстиями желаемой геометрии и размера (например, 1000 мкм кружки) и трафарета прокладки с использованием разработки программного обеспечения 10 автоматизированного.
- Лазер-разрезал лист трафаретной печати и прокладку на 120-150 мкм и толщиной 2 мм полидиметилсилоксана (PDMS) листов соответственно с использованием CO 2 лазера резак 10.
- Бонду прокладку PDMS с трафарета PDMS с использованием жидкого неотвержденных PDMS и выпекать при температуре 60 ° С в течение 3-4 ч для получения PDMS трафарет для micropatterning.
- Стерилизация трафарет PDMS автоклавированием при 120 ° С в течение 30 мин и сушки в печи перед использованием.
2. ЭСК Mainживанию
- Культура чЭСК линии в поддерживающей среде фидера свободной на 1 × чЭСК квалифицированных базальной мембраны матрицы с покрытием клеточных культур пластин при 37 ° С и 5% CO 2.
- Прохождение ЭСК, когда они примерно 70% сплошности на 3 мин инкубации при 37 ° C с диспаза обработки и механически диссоциацию чЭСК колонии в 100-200 мкм комков. Пластина сгустки ЭСК при плотности 30-50 комков на 9,6 см 2 площади роста на базальной мембраны матричным покрытием тканевой культуры полистирола в соотношении 1: 6 расщепления.
3. Трафарет Micropatterning из эмбриональных стволовых клеток человека
- Подготовка перед клеточными кучность
- Запечатать PDMS трафарет на 60 мм чашки Петри, освобождаясь 700 мкл 70% этанола ЧДА в сверхчистой воды в чашку Петри и помещая трафарет на вершине.
- Поместите чашку Петри внутри шкафа биологической безопасности в течение ночи, чтобы тон этанол сухой.
- Проверить ни один пузырь не существует под трафарет, чтобы гарантировать, что трафарет образует хорошее уплотнение с чашки Петри. Это предотвращает утечку раствора для покрытия ECM. Печать чашки Петри и хранят в стерильных условиях, пока он не будет готов к посева клеток.
- Подготовка аликвоты чЭСК квалифицированных матрицы базальной мембраны в соответствии с сертификатом анализа. Убедитесь, что каждой аликвоты выходы 1 × чЭСК квалифицированных матричное решение базальной мембраны при разбавлении в 25 мл Дульбекко в модификации Дульбекко: питательную смесь F-12 (DMEM / F12) в соответствии с листом продукта изготовителя.
- Приготовьте раствор ECM покрытия путем добавления одного аликвоты чЭСК квалифицированных матрицы базальной мембраны в 16.7 мл DMEM / F12, чтобы сделать 1.5 × чЭСК-квалифицированное решение матричного базальной мембраны. Хранить весь раствор ЕСМ покрытие на лед, чтобы предотвратить гелеобразование.
- Дополнение среды обслуживания чЭСК с 10 ингибитором ROCK мкМ (Y27632).
- Лечить чашку Петри с 100 WO 2 плазмы в течение 90 сек. Для обеспечения стерильности, только открыть блюдо накрывать чашку внутри плазменной камеры перед обработкой плазмой, и быстро закрывают обратно чашку Петри после завершения лечения. Это облегчает смачивание поверхности и предотвращает образование пузырьков воздуха в micropattern сквозные отверстия во время добавления раствора для покрытия ECM.
- Добавить 450 мкл 1,5 × чЭСК квалифицированных раствора базальной мембраны матрицы, чтобы покрыть весь трафарет. Печать чашку Петри с самозарубкой закрывающийся пленки, такой как Parafilm, чтобы предотвратить решение от высыхания, и инкубировать в течение 5 ч при 37 ° С перед использованием.
- Посев ЭСК на подложку трафаретного
- Изучение чЭСК колонии в 6-луночного планшета для определения дифференцированных клеток зоны , показывающие потерю типичных чЭСК морфологии (например, потеря округлым, плотно Packed эпителиальной морфологии, высокое соотношение ядро / цитоплазма с выраженными ядрышками). Удалить дифференцированные регионы с помощью вакуумного аспиратора.
- Промыть дважды 2 мл DMEM / F12 на лунку.
- Добавить 1 мл пищеварительных ферментов, таких как Accutase, на лунку 6-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение 8 мин. Нажмите пластину осторожно, чтобы отделить все колонии от подложки.
- Промыть каждую лунку по меньшей мере 4 мл DMEM / F12 на 1 мл пищеварительных ферментов и собирают суспензию клеток в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга клеточной суспензии при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Отберите удалить супернатант и добавить 400 мкл поддерживающей чЭСК среды с добавлением ингибитора ROCK (Rocki), чтобы вновь приостановить клетки. Пипетировать клеточной суспензии вверх и вниз 3 раза осторожно, чтобы разбить комки на отдельные клетки.
- Смешайте одноклеточной суспензии хорошо и разбавляют 10 мкл образцов клеток в 190 мкл DMEM / F12 (1:20 разведение). Используйте hemocytomeтер для определения плотности клеток в суспензии клеток складе.
- Расчет требуемой плотности посева клеток для данного трафарета.
Примечание: Например, мы экспериментально определили плотность посева клеток для получения сливающийся монослой отдельных клеток составляет приблизительно 4,444 клеток / мм 2. Таким образом, трафарет с площадью 450 мм 2 , а объем высева 400 мкл потребует клеточной суспензии , чтобы быть при плотности 2 миллионов клеток / 400 мкл. - Развести суспензии клеток запас до требуемой плотности высева (этап 3.3.8 ПРИМЕЧАНИЕ) с чЭСК культуральной среде с добавлением Rocki.
- Добавить обозначенный объем клеточной суспензии, содержащей необходимое количество клеток в каждую трафарета и оставить чашку Петри в невозмущенном колпаком в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы позволить клеткам оседать.
- Передача чашку Петри в инкубаторе и инкубировать в течение 1 часа, чтобы для прикрепления клеток. Позаботьтесь, чтобы сохранить уровень чашку Петри во времяПроцесс передачи таким образом, что клетки остаются в виде монослоя в трафарете.
- Трафарет удаление и пассивация подложки без рисунка
- Осмотрите чашку Петри под микроскопом, чтобы проверить, если клетки должным образом закреплена на основной подложке.
- Аспирируйте прочь суспензии клеток с трафарета.
- Добавляют 2 мл / блюдо 0,5% клеточной культуры, совместимой неионогенного поверхностно-активного вещества в DMEM / F12, чтобы область вокруг трафарета.
- Используйте пару автоклавного щипцов, чтобы аккуратно отделите трафарет. Вихревой раствора неионогенного поверхностно-активного вещества, как вокруг трафарет снимают, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Визуально наблюдать micropatterned-клетки в чашке Петри.
- Инкубируйте micropatterned-клеток в 0,5% растворе неионогенного поверхностно-активного вещества-DMEM / F12 в течение 10 мин при 37 ° С.
- Отберите прочь неионный поверхностно-DMEM раствор / F12. Промыть 3 раза с 2 мл / блюдо из DMEM / F12.
- Добавляют 2 мл / блюдо из ЭСКподдерживающую среду, дополненную Rocki и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
- После инкубации в течение ночи, аспирация чЭСК поддерживающую среду, дополненную Rocki, Промывают один раз DMEM / F12 и индуцируют mesoendoderm дифференциацию путем добавления 2 мл / чашку дифференциации среды с добавлением 100 нг / мл Activin, 25 нг / мл BMP4 и 10 нг / мл FGF2 ,
- Оценить micropatterns с использованием контраста изображений фазы и вычислить средние Brachyury (T) профили интенсивности для каждого шаблона , как описано выше 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье мы описываем изготовление клеточного трафарет с помощью лазерного резака для создания 1000 мкм функции. Трафарет состоит из 2-х частей: тонкий лист трафаретной печати (приблизительно 100-200 мкм), содержащий micropattern сквозных отверстий, и PDMS прокладку, чтобы содержать решение ECM покрытия или суспензии клеток. Здесь, 127 мкм и толщиной 2 мм, коммерчески доступные PDMS листы были использованы в качестве трафарета листа и прокладки соответственно. Другие способы получения PDMS листов контролируемой толщины, такие как спин-покрытия, также могут быть использованы для изготовления деталей. Эти два компонента были соединены друг с другом с использованием жидкого неотвержденного PDMS форполимер-сшивающего смеси в качестве клея или плазменного склеивания, и выпекали при температуре 60 ° С в течение 3-4 ч (рис. 1).
был выбран материал для трафаретной печати листа на основе выбора для культивирования клеток сubstrate. При использовании обычной тканевой культуры полистирола (ТКТ) в качестве субстрата культуры, PDMS трафареты могут быть использованы , так как соответствия трафарету листа PDMS будет формировать хорошее уплотнение с жесткой ПСТК (E ~ 3 ГПа) (рис. 2А). В экспериментальных конструкциях , где один хочет исследовать пространственную гетерогенность судьбы стволовых клеток на более мягких субстратов для культивирования клеток, таких как эластомерных PDMS подложки с перестраиваемой диапазоне жесткости от 5 кПа до 2 МПа 30, более жесткие трафарету материалы могут быть использованы. В качестве примера, мы продемонстрировали использование полиэтилентерефталатной (ПЭТ) трафарет (Е ~ 2 ГПа) для создания 1 мм micropatterned HPSC колонии на более мягкой PDMS подложке , имеющей жесткость ~ 5 кПа (рис. 2В). Трафарет ПЭТ была изготовлена наклеиванием PDMS прокладку на трафарету с листом из коммерчески доступных пленок ПЭТ (рис. 2В, вставка). Заметим, что требуемое время прикрепления клеток во время micropatterningПроцесс был больше (~ 3 ч) на более мягкой PDMS подложке жесткости ~ 5 кПа по сравнению с обычными подложками ТКТ.
Мы использовали трафарет micropatterned чЭСК колонии, чтобы продемонстрировать, что пространственная неоднородность в клеточной адгезии, опосредованных механических сил может паттерн дифференцировки ранних mesoendoderm. Ранее мы показали , что H9 ЭСК на периферии колонии наблюдается повышение спаек интегрина , чем клетки в интерьере колонии, что привело к их преимущественной дифференцировке в Brachyury (T) -позитивных mesoendoderm клеток при индуцированных активин, BMP4 и FGF2 31 (рис. 3А ). Когда клетки были узорной в различной геометрии (круг, квадрат, прямоугольник и полукруглые дуги) при постоянной площади колонии, геометрическая анизотропия в углах квадратов, прямоугольников и выпуклых искривлений привело к локальной концентрации интегрин-опосредованной тяговых сил и привело к увеличению mesoendoderm дифференциация 32,33. Действительно, отображение интенсивности экспрессии Т в разных местах в пределах одной колонии, мы обнаружили , что степень индукции mesoendoderm была выше в острых углах квадратных и прямоугольных колоний (рис. 3б) и на выпуклых искривлений полукруглой дуги (рис . 3C), что соответствовало сообщенных высоких областей стресс - интегрин-опосредованную в анизотропной геометрии 32,33. Поэтому micropatterning могут быть использованы для модуляции пространственного распределения клеточной адгезии, опосредованных механических сил внутри интактной HPSC колонии в качестве средства для контроля процесса дифференцировки последующего.
Рисунок 1. Генерация PDMS трафарет для micropatterning. (А) Схема , представляющая критические шаги в изготовлении трафарета. A 127 мкм толщиной PDMS лист был лаSer-вырезать, чтобы произвести разработанные модели, а еще 2 мм толщиной PDMS лист лазерной резки, чтобы произвести прокладку. Эти два компонента были связаны вместе с неотвержденного PDMS , чтобы собрать трафарет. (B) изображения , показывающие сборку компонентов с образованием PDMS трафарет с 1 мм круговой сквозные отверстия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Micropatterned чЭСК колонии (1000 мкм кружки) на различных подложках культуры. Микроскопические изображения чЭСК micropattern колонии сразу после удаления (А) PDMS трафаретов (вставка) , используемых для генерации чЭСК micropatterns на жестких подложек, например, ТКТ жесткости ~ 2 ГПа, и (В) ПЭТ трафареты (вставка) Используется для генерации micropatterns на мягких подложках, например, PDMS жесткости ~ 5 кПа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Влияние чЭСК micropatterns различных геометрических фигур на их mesoendoderm дифференциации 8. (А) чЭСК micropatterns различных геометрических форм , но одинаковую площадь колонии были получены с использованием PDMS трафареты. Фазовые изображения (верхняя панель) и карты интенсивности Т выражения (нижняя панель) после 24 ч от mesoendoderm дифференцировки. (B) профили средней интенсивности T (вдоль белых пунктирных линий в (А)) в изометрической кольцевых колоний или анизометрических квадратных и прямоугольных колоний , Все колонии имели одинаковую площадь ех СЕРТ 50% круга, который имел половину площади колонии. (C) Средняя интенсивность T профилей из вогнутой или выпуклой края в глубь колонии в полукруглой дуги, как показано белыми пунктирными линиями (А). Каждый профиль интенсивности в (BC) составляет в среднем 16 профилей интенсивности получается из 4-х колоний. Изображения перепечатана с разрешения Toh и др. и др., 8. Шкала бар = 200 мкм и РФС представляет собой единицу относительной флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схематическое изображение рабочего процесса micropattern чЭСК колонии и индуцируют дифференцировку. Основные шаги для успешного поколения чЭСК micropatterns выделены серым цветом коробки..com / файлы / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изготовление micropatterning трафаретов
Трафарет micropatterning обеспечивает идеальный метод для создания HPSC micropatterns для исследования ниши-опосредованной дифференциации кучность. Ключевым преимуществом трафарета кучность по сравнению с другими методами micropatterning, таких как микроконтактной печати и photopatterning, является то, что она не требует модификации поверхности и могут быть реализованы на обычных подложках ТКТ. Поэтому, оптимизированная питательные среды и ECM покрытия для различных линий HPSC могут быть легко переданы трафарет micropatterning.
Есть целый ряд ключевых этапов в процессе изготовления ячейки трафарета, которые способствуют образованию хороших micropatterns. Верность воспроизведения разработанных геометрий в micropatterns HPSC зависит от качества и консистенции сквозных отверстий в изготовлении трафарета листа. Для исследований с участием многоклеточный micropatкрачек> 1000 мкм, что сквозные отверстия могут быть непосредственно изготовлены методом лазерной резки на предварительно отлиты PDMS листа. Разрешение лазерной резки зависит от размера пятна лазерного луча и точности механической ступени, контролирующей пути лазерного луча. Для обычных CO 2 лазерные резаки, мы обнаружили , что он может производить круговые или изогнутые черты с хорошей точностью , но не геометрий с острыми углами (например., Квадрат). В тех случаях , когда требуется иное маленькие или острые особенности, сквозные отверстия в трафарету листе могут быть изготовлены путем формования PDMS на шаблоне микроизготовленном кремния , содержащего рельефы micropatterns 28. Задача метода формования является получение микро-размера сквозных отверстий в тонких листах PDMS при отсутствии остаточной PDMS над рельефами шаблонных кремния. Существует несколько стратегий были разработаны для решения этой проблемы , как описано Ли и др. и др. 28
Во время, какsembly из трафарету листа и прокладки для производства трафарет клеток, следует убедиться, что трафарету лист является плоской и свободной от пыли во время процесса соединения с целью предотвращения утечки из трафарета. Коробление трафарету листа во время процесса соединения может привести к нарушению герметизации трафарета к подложке культуры, в результате чего ECM и клеточные решения просачиваться из micropattern сквозных отверстий. Трафарет следует стерилизовать автоклавированием (120 ° C, 30 мин) и тщательно высушивают в печи, чтобы гарантировать, что он может образовать хорошую герметизацию с культурального субстрата.
Другим важным фактором является выбор трафарету листового материала. Трафарет PDMS идеально подходит для micropatterning hPSCs на жестких носителях культуры, такие как ПСТК с жесткостью ~ 2 ГПа. Однако, если кто -то хочет micropattern hPSCs на более мягких субстратов, таких как на PDMS подложках , обычно используемых для ячейки подложки настроиться жесткости 34, соответствие с PDMSтрафарету лист будет трудно слезть трафарет после процесса посева клеток, поэтому уничтожая micropatterns HPSC. В этом случае выбор материала для трафаретной печати листа трафарета должны быть выбраны таким образом, что он может образовывать уплотнение с подложкой культуры, но может быть снята с легкостью.
Создание HPSC micropatterns
Протокол micropatterning H9 ЭСК на ПСТК подложек с использованием PDMS трафарет, представленный здесь, был оптимизирован для достижения сливающийся колонии с хорошей жизнеспособности клеток и структуризации верности. Крайне важно, что hPSCs образуют соответствующие межклеточные и клетка-матрица взаимодействия внутри пространственного удержания определенной геометрии, определяемой micropatterns, чтобы можно было исследовать, как геометрия-зависимые факторы влияют на дифференциацию судьбы. Мы определили несколько важных шагов , чтобы успешно генерировать HPSC micropatterns (рис. 4)и они рассматриваются следующим образом.
Во-первых, качество культуры HPSC имеет значение. Важно, чтобы собрать колонии HPSC на 70-80% слияния, с большинством колоний, показывающих морфологию недифференцированный HPSC при удалении дифференцированных областей. Чрезмерная сливающийся HPSC культур, как правило, вызывают спонтанной дифференцировке, и, если дифференцированные участки не будут удалены перед посевом клеток, дифференцированные клетки будут нарушать нормальную схему дифференциации шаблона.
Во-вторых, при уборке HPSC колоний к суспензии отдельных клеток, избегая избыточной обработки с помощью пищеварительных ферментов имеет решающее значение, так как это часто приводит к гибели клеток после инкубации в течение ночи, даже если клетки может состыковать первоначально. Мы обнаружили, что 8 минут ферментативной обработки является оптимальным для линии Н9 чЭСК, культивированных в нашей лаборатории; хотя мы рекомендуем, чтобы время обработки открепления клеток должны быть оптимизированы отдельно для различных клеточных линий.
И, наконец, существует необходимость в пассивации субстрат, окружающий micropatterns HPSC с молекулами клей не должен клеток для того, чтобы ограничить пролиферирующих или дифференциации клеток в пределах micropattern. Это имеет важное значение для поддержания верности в micropattern HPSC, и, в свою очередь, биохимические и механические экологического градиента для моделей дифференциации развиваться. Клеточные культуры, совместимые неионные поверхностно-активные вещества, такие как Pluronic F-127 может быть использован в качестве пассивирующего агента. Когда пассивирования с поверхностно-активными веществами, время обработки и концентрация должна быть оптимизирована за счет цитотоксичности поверхностно-активного вещества в при длительном воздействии. Как мы уже говорили выше, представленный протокол предоставляет подробную директиву для micropattern hPSCs с использованием PDMS трафарет, но оптимизация этого протокола, особенно для указанных выше критических шагов, рекомендуется суccessfully генерировать HPSC micropatterns.
Одно ограничение трафарета micropatterning является то, что он больше подходит для создания больших micropatterns в диапазоне от 100-1,500 мкм. Для создания очень маленьких функций, предназначенных для одной ячейки паттерна, изготовление трафарета листов с <50 мкм сквозные отверстия является весьма сложной задачей, как уже упоминалось ранее. Таким образом, мы ожидаем , что использование трафаретных micropatterned hPSCs хорошо подходит для исследования образования многоклеточного картины ткани при различных процессах развития (например, нейроэпителия складными или энтодермы кучность).
При использовании micropatterning геометрически ограничить популяцию HPSC, мы можем установить клеточной адгезии опосредованной Механический 10 и ПАРАКРИННОЙ сигнализации градиенты 6 для управления и понять пространственную организацию результирующих дифференциации судьбах. Эти модели micropatterned HPSC с пространственно организованной differentiatioп в свою очередь может быть переведена на модели человека конкретных заболеваний или тератогенным скрининга 11 для врожденных врожденных дефектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается НУК Пустите грант (R-397-000-192-133) и ETPL Gap фонд (R-397-000-198-592). GS является ученым НУК исследований. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Jiangwa Xing за техническую поддержку на мобильный micropatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
