Summary
células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.
Introduction
As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células embrionárias estaminais (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs), são amplamente explorados em medicina regenerativa, bem como modelagem experimental da organogénese normais e doentes devido ao seu potencial de diferenciação em linhagens celulares de todos três camadas germinativas 1,2. O destino de diferenciação de hPSCs são altamente sensíveis a factores ambientais locais que podem modular processos mecanotransdução autócrino ou parácrino de sinalização 1, bem como mediadas por sinais físicos 3-5. Micropatterning celular engloba um conjunto de técnicas que foram desenvolvidas para organizar espacialmente a geometria e a localização de uma população de células como um meio para controlar o micro-ambiente celular local, tais como as interacções célula-célula e 6 interacções célula-matriz 3. No contexto da hPSCs, micropatterning celular tem sido empregado para obter insights importantes sobre como nicho dependeráent sinalização autócrina modula hESC decisões pluripotência-diferenciação 7 e organização em primeiros padrões de diferenciação embrionárias 6. 2D e 3D hPSCs micropatterned têm sido utilizados para controlar o tamanho das colónias de padrões multicelulares, que por sua vez influenciam as decisões de diferenciação para as três camadas germinais 8,9. Temos empregue micropadrões HPSC multicelulares para modular o grau de célula-célula e as interacções célula-matriz dentro de uma colónia HPSC para sondar como integrina-E-caderina diafonia pode dar origem ao destino celular heterogeneidade 10. As manifestações dos relatórios acima abrir novos caminhos para a aplicação de micropadrões multicelulares de hPSCs como modelos experimentais para o rastreio toxicidade dos medicamentos para doenças do desenvolvimento 11, para estudar o efeito de fatores de crescimento e hormônios durante a tecido ou desenvolvimento de órgãos, e para desvendar a formação de padrões de tecido.
Uma miríade de micropatter celularning técnicas têm sido desenvolvidas como revisto por Falconnet et. . al 12, mas apenas um punhado, como micro-contacto imprimir 7,8,13, micropoços cultura 14,15, photopatterning 6 e microstencils 16 foram implementadas com sucesso com hPSCs. O desafio com hPSCs micropatterning reside na sua vulnerabilidade e uma exigência rigorosa de matrizes específicas extracelular (MEC) e as condições de crescimento para a fixação e sobrevivência celular. Para padrões 2D HPSC, impressão micro-contato é um dos métodos mais comuns de gerar micropadrões HPSC em cultura de tecido e vidro substratos 13. O método pode ser usado para padrão de ECM comum utilizado na cultura HPSC, incluindo matrizes de laminina e da membrana basal, tais como Matrigel. No entanto, isso requer tipicamente um processo de revestimento de duas etapas auxiliado por poli-D-lisina, e necessita de condições atmosféricas e humidade inertes específicos para fazer micropadrões ECM estáveis para hPSCs para anexar em 6,13. A principal consideração de cada método micropatterning é se o regime de modificação da superfície pode gerar padrões de ECM HPSC-adesivas na resolução geométrica desejada, minimizando a fixação das células inespecífica para as áreas circundantes.
Aqui, nós relatamos o uso de micropatterning estêncil como um método simples para gerar micropadrões HPSC sem etapas de modificação de superfície suplementar, antes da geração de padrões de ECM adesivas para hPSCs para anexar diante. O estêncil célula é composta por uma fina membrana, folha por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), com micron de milímetro de tamanho orifícios lacrados em um substrato de cultura de células para conter fisicamente revestimentos ECM e hPSCs posteriormente semeadas. Como estêncil padronização funciona, restringindo fisicamente do local onde HPSC pode acessar e ligam directamente ao substrato subjacente ECM revestido, este método é compatível com vários substratos que podem suportar culturas HPSC. As únicas requirement é que a escolha do material da matriz pode formar uma vedação reversível com o substrato. Estes substratos incluem poliestireno convencional de cultura de tecidos (TCPS) 17, substratos conjugados de ligando 18, bem como substratos elastoméricos com rigidez ajustável (por exemplo., PDMS) 19. Este método também permite que o revestimento de ECM diferente, tais como vitronectina (ou proteína VTN), laminina e matrizes de membrana basal (por exemplo, Matrigel e Geltrax) para permitir a fixação e diferenciação de hPSCs adequada. configurações de ECM-substrato Portanto, podemos transferir otimizadas para uma linha específica para HPSC estêncil micropatterning para óptima de células-matriz de adesão, sobrevivência e diferenciação. Recentemente, um método semelhante foi também relatada para dirigir a diferenciação hepática por hESCs micropatterning usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) de matrizes de micro-estêncil 16.
stencils celular pode ser fabricado a partir de materiais diferentes, incluindo metals 20,21, poli (p-xilileno) polímeros 22,23, PMMA 16 e mais comumente, PDMS 24-28. Silicone e poli (p-xilileno) polímeros stencils exigem gravura directa dos furos de passagem com equipamento especializado 20-23, o que limita a sua acessibilidade aos utilizadores biológicos. PDMS matrizes podem ser fabricados por diferentes métodos, dependendo do tamanho funcionalidade requerida, que tipicamente varia de 3 uM a 2.000 uM 11,26-29. Se pequenas características são desejadas, folhas de stencil finos pode ser produzida por moldagem por prensa de pré-polímero de PDMS em um modelo de silício microfabricado contendo relevos dos micropadrões 28. Para recursos> 1.000 mm, um cortador de laser de CO 2 proporciona um método de custo fácil e baixo para cortar diretamente os padrões sobre uma folha de PDMS pré-fundido durante a fabricação stencil. A reciclagem dos stencils PDMS também os torna rentável para realizar uma série de experimentos com consistência suficiente.
10.
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Protocol
NOTA: Este protocolo descreve a fabricação de PDMS stencil com 1.000 mm padrões de corte a laser e micropatterning da linha de células estaminais embrionárias humanas, H9 usando o stencil PDMS.
1. Projeto e Fabricação de PDMS do estêncil para micropatterning
- Projetar a folha de stencil com furos de passagem da geometria desejada e tamanho (por exemplo, 1.000 mm círculos) ea junta estêncil usando software de desenho auxiliado por computador 10.
- Laser-cortar a folha de stencil e junta em 120-150 mm e 2 mm de espessura polidimetilsiloxano (PDMS) folhas, respectivamente, usando um laser de CO 2-cortador 10.
- Unir a junta PDMS com a folha de stencil PDMS usando PDMS não curado líquidos e leve ao forno a 60 ° C durante 3-4 horas para obter o stencil PDMS para micropatterning.
- Esteriliza-se o estêncil PDMS em autoclave a 120 ° C durante 30 min e secagem num forno antes da sua utilização.
2. hESCs Principalmanutenção
- Cultura as linhas de células estaminais embrionárias humanas em um meio de manutenção isento de alimentador em 1 × placas de cultura celular de matriz revestida da membrana basal hESC qualificado a 37 ° C e 5% de CO 2.
- A passagem hESCs quando eles são aproximadamente 70% confluentes por 3 minutos de incubação a 37 ° C com dispase tratamento e mecanicamente dissociar as colónias em células estaminais embrionárias humanas 100-200 uM aglomerados. Placa os aglomerados hESCs a uma densidade de 30-50 aglomerados por 9,6 centímetros 2 de área de crescimento sobre-revestidos de matriz de membrana basal do tecido em polistireno para cultura de relação de 1: 6 a divisão.
3. Stencil micropatterning de células estaminais embrionárias humanas
- Preparação prévia para a célula padronização
- Selar um stencil PDMS em um 60 milímetros placa de Petri dispensando 700 mL de 70% de etanol grau analítico em água ultrapura para a placa de Petri e colocar o estêncil no topo.
- Coloque a placa de Petri dentro de gabinete de biossegurança durante a noite para deixar tele etanol seco.
- Verificar existe nenhuma bolha por baixo da matriz para assegurar que a matriz forma uma boa vedação com a placa de Petri. Isto impede as fugas de solução de revestimento de ECM. Selar a placa de Petri e armazenar em condições estéreis até que esteja pronto para a semeadura de células.
- Preparar alíquotas de matriz de membrana basal hESC-qualificados de acordo com o Certificado de Análise. Assegurar que cada alíquota rendimentos 1 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificada quando diluída em 25 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12) de acordo com a folha de produto do fabricante.
- Preparar a solução de revestimento ECM através da adição de uma alíquota de matriz de membrana basal hESC-qualificada em 16,7 ml de DMEM / F12 para fazer 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificado. Manter toda a solução de revestimento de ECM no gelo para evitar a gelificação.
- Suplemento meio de manutenção hESC com 10 mM inibidor ROCHA (Y27632).
- Trate a placa de Petri com 100 WO 2 plasma durante 90 segundos. Para garantir a esterilidade, a apenas abrir a tampa placa de Petri dentro da câmara de plasma antes do tratamento por plasma, e rapidamente a tampa traseira do prato de Petri, após a conclusão do tratamento. Isto facilita a molhagem da superfície e impede a formação de bolhas de ar no micropadrão orifícios de passagem durante a adição da solução de revestimento de ECM.
- Adicionar 450 mL de 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificados para cobrir todo o stencil. Selar a placa de Petri com uma película auto-selável, tais como Parafilm para evitar que a solução de secar e incubar durante 5 horas a 37 ° C antes da utilização.
- HESCs de semeadura sobre o substrato estampado
- Examinar colónias em células estaminais embrionárias humanas de 6 poços da placa para identificar as áreas de células diferenciadas mostrando a perda de morfologia típica de células estaminais embrionárias humanas (por exemplo, perda de arredondada, firmemente packed morfologia epitelial, razão / citoplasma alta núcleo com nucléolo proeminente). Remover regiões diferenciadas usando um aspirador a vácuo.
- Lavar duas vezes com 2 ml de DMEM / F12 por poço.
- Adicionar 1 ml de enzimas digestivas, tais como Accutase, por poço da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante 8 min. Toque a placa suavemente para retirar todas as colônias de substrato.
- Lavar cada poço com, pelo menos, 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de enzimas digestivas e recolher a suspensão de células no tubo de 15 ml.
- Centrifugar a suspensão de células a 200 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar para eliminar o sobrenadante e adicionar 400 ul de meio de manutenção de células estaminais embrionárias humanas suplementado com inibidor ROCHA (Rocki) para re-suspender as células. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo 3 vezes suavemente para quebrar aglomerados em células individuais.
- Misture bem a única suspensão de células e dilui-se 10 ul de amostras de células em 190 ul de DMEM / F12 (diluição de 1:20). Use um hemocytomeTer para determinar a densidade de células na suspensão de células de reserva.
- Calcula-se a densidade de sementeira de células necessário para uma determinada matriz.
NOTA: Por exemplo, temos experimentalmente determinada a densidade de sementeira de células para se obter uma monocamada confluente de células isoladas é de cerca de 4.444 células / mm 2. Assim, uma matriz com uma área de 450 mm2 e volume de sementeira de 400 uL irá necessitar de uma suspensão de células a ser a uma densidade de 2 milhões de células / 400 ul. - Dilui-se a suspensão de células de ações para a densidade de semeadura necessária (veja o passo 3.3.8 NOTA) com meio de cultura suplementado com hESC Rocki.
- Adicionar um volume designado de suspensão de células contendo o número necessário de células em cada matriz e deixar a placa de Petri na capa sem ser perturbado durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que as células assentar.
- Transferir a placa de Petri em incubadora e incubar durante 1 h para permitir a ligação de células. Tome cuidado para manter o nível de placa de Petri durante oprocesso de transferência de modo que as células permanecem como uma monocamada na matriz.
- Remoção de estêncil e passivação do substrato unpatterned
- Examinar a placa de Petri sob um microscópio para verificar se as células forem correctamente ligado ao substrato subjacente.
- Aspirar afastado suspensão de células a partir do stencil.
- Adicione 2 ml / prato de cultura de células de 0,5% compatível surfactante não-iônico em DMEM / F12 para a área em torno do estêncil.
- Use um par de fórceps autoclavados para descascar delicadamente fora do estêncil. Agitar a solução de agente tensioactivo não iónico como em torno do estêncil é retirado para evitar que as células de secar. Observar visualmente as células micropatterned na placa de Petri.
- Incubar as células em solução de tensioactivo micropatterned-DMEM / F12 não iónico 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar a solução de distância / F12 de DMEM-surfactante não-iónico. Lavar 3 vezes com 2 mL / prato de DMEM / F12.
- Adicione 2 ml / prato de hESCmeio de manutenção suplementado com Rocki e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Após incubação durante a noite, o meio de manutenção aspirado de células estaminais embrionárias humanas suplementado com Rocki, lavar uma vez com meio DMEM / F12 e induzir a diferenciação mesoendoderm por adição de 2 ml / placa de meio de diferenciação suplementado com 100 ng / ml de Activina, 25 ng / ml BMP4 e 10 ng / FGF2 ml .
- Avaliar os micropadrões utilizando imagiologia de contraste de fase e calcular os perfis de intensidade média Brachyury (t) para cada padrão, tal como descrito anteriormente 8.
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Representative Results
Neste artigo, descreve a fabricação de um estêncil célula usando um cortador a laser para gerar 1.000 mm características. A matriz foi composta por 2 partes: uma folha de stencil fina (cerca de 100-200 mm de espessura) que contém o micropadrão furos de passagem, e uma junta de PDMS para conter a solução de revestimento de ECM ou de suspensão de células. Aqui, 127 im e 2 mm de espessura folhas de PDMS comercialmente disponíveis foram usadas como a folha de stencil e junta respectivamente. Outros métodos para a preparação de folhas de PDMS de espessura controlável, como spin-coating, também pode ser usado para fabricar as partes. Os dois componentes foram ligados em conjunto, utilizando mistura de pré-polímero-agente de ligação cruzada líquido não curado PDMS como uma ligação por adesivo ou plasma, e cozidos a 60 ° C durante 3-4 horas (Fig. 1).
O material para a folha de stencil foi seleccionado com base na escolha da célula de culturaubstrate. Quando se utiliza poliestireno convencional de cultura de tecidos (TCPS) como o substrato de cultura, stencils PDMS pode ser usado desde que o cumprimento da folha de stencil PDMS formará uma boa vedação com o TCPS rígida (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). Em modelos experimentais em que se deseja investigar heterogeneidade espacial do destino de células estaminais em mais suaves substratos de cultura de células, tais como PDMS substratos elastoméricos com um intervalo de rigidez sintonizável de 5 kPa a 2 MPa, 30, materiais mais rígidos stenci pode ser empregue. Como um exemplo, foi demonstrada a utilização de um estêncil tereftalato de polietileno (PET) (E ~ 2 GPa) para gerar colónias de 1 mm HPSC micropadronadas mais suave sobre substrato de PDMS tendo uma rigidez de ~ 5 kPa (Fig. 2B). A matriz de PET foi fabricado por meio de colagem de uma junta de PDMS em uma folha de stencil feito de películas de PET disponíveis comercialmente (Fig. 2B, inserção). Notamos que o tempo de ligação de células exigida durante o micropatterningprocesso foi maior (~ 3 h) no PDMS mais suaves substrato de rigidez ~ 5 kPa, em comparação com substratos TCPS convencionais.
Utilizamos estêncil micropadronadas colônias CTEh para demonstrar que a heterogeneidade espacial em células-adesão forças mecânicas mediadas poderia padrão de diferenciação precoce mesoendoderm. Nós mostramos anteriormente que H9 hESCs na periferia de colónias experimentado aderências integrina mais elevadas do que as células no interior colónia, o que resultou na sua diferenciação preferencial em Brachyury (T) células mesoendoderm -positivas quando induzida com Activina, BMP4 e FGF2 31 (Fig. 3A ). Quando as células foram modelados em diferentes geometrias (círculo, quadrado, rectângulo e arco semi-circular) a uma área de colónia constante, anisotropia geométrico nos cantos quadrados, rectângulos, e curvaturas convexas levaram a uma concentração local de forças de tracção mediadas pela integrina e resultou em aumento mesoenddiferenciação oderm 32,33. Com efeito, por mapeamento de intensidade de expressão T em diferentes localidades de uma única colónia, verificou-se que a extensão da indução mesoendoderm foi maior nos cantos afiados de colónias quadrados e rectangulares (fig. 3B) e em curvaturas convexas de um arco semi-circular (Fig . 3C), o que correspondeu a regiões de stress mediadas pela integrina elevados relatados em uma geometria anisotrópica 32,33. Portanto, micropatterning podem ser utilizados para modular a distribuição espacial da adesão de células mediadas por forças mecânicas dentro de uma colónia HPSC intacta como um meio para controlar o processo de diferenciação que se seguiu.
Figura 1. Geração de PDMS estêncil para micropatterning. (A) Esquema representando as etapas críticas na fabricação de stencil. Uma folha de 127 mm de espessura PDMS foi laSer-cortada para produzir os padrões concebidos, e outros 2 mm de espessura de folha de PDMS foi cortado a laser para produzir a junta. Estes dois componentes foram colados em conjunto com PDMS não curado para montar o stencil. (B) imagens que mostram a montagem dos componentes para formar um estêncil PDMS com um milímetro circular através de buracos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. colônias micropadronadas hESC (1.000 mm círculos) em diferentes substratos cultura. As imagens microscópicas de células estaminais embrionárias humanas colónia micropadrão imediatamente após a remoção de PDMS (A) stencils (inserção) utilizados para gerar micropadrões hESC em substratos rígidos, por exemplo, TCPS da rigidez ~ 2 GPa, e (b) stencils PET (inserção) Usado para gerar micropadrões em substratos mais macios, por exemplo, PDMS da rigidez ~ 5 kPa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Efeito da micropadrões hESC de diferentes formas geométricas na sua mesoendoderm diferenciação 8. (A) micropadrões hESC de diferentes formas geométricas, mas mesma área colónia foram gerados utilizando PDMS stencils. Imagens de fase (painel superior) e mapas de intensidade de expressão T (painel inferior) após 24 horas de diferenciação mesoendoderm. (B) perfis de intensidade média T (ao longo das linhas pontilhadas brancas no (A)) em colônias circulares isométricos ou quadrado anisometric e colônias retangulares . Todas as colónias tinham a mesma área de ex CEPT o círculo de 50%, que tinha metade da área da colónia. (C) Os perfis de intensidade média T do côncava ou bordas convexas para o interior colónia em um arco semi-circular, como indicado por linhas pontilhadas brancas em (A). Cada perfil de intensidade em (BC) é uma média de 16 perfis de intensidade obtido a partir de 4 colónias. As imagens são re-impressa com a permissão de Toh et. al., 8. Barra de escala = 200 mm e RFU é unidade de fluorescência relativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Representação esquemática do fluxo de trabalho para micropadrão colônias CTEh e induzir a diferenciação. Os passos fundamentais para a geração bem-sucedida de micropadrões hESC são destacadas em caixas cinzentas..com / files / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Fabricação de stencils micropatterning
micropatterning estêncil fornece um método ideal para gerar micropadrões HPSC para investigar mediada por nicho de padronização diferenciação. A principal vantagem de estêncil sobre outras técnicas de modelação micropatterning, tais como a impressão e microcontact photopatterning, é que ele não necessita de modificação da superfície, e podem ser aplicadas em substratos convencionais TCPS. Portanto, os meios de cultura optimizadas e revestimentos de ECM para diferentes linhas HPSC pode ser facilmente transferido para estêncil micropatterning.
Há um número de passos principais durante o fabrico da matriz de células que contribuem para a produção de boas micropadrões. A fidelidade de reproduzir as geometrias projetadas nas micropadrões HPSC depende da qualidade e consistência da fabricação através de orifícios na folha de stencil. Para estudos envolvendo micropat multicelularnhece de> 1000 uM, os orifícios podem ser directamente fabricadas por corte a laser numa folha de PDMS pré-fundido. A resolução de corte a laser é dependente do tamanho do ponto do feixe de laser e a precisão da fase mecânica controlar o percurso do feixe de laser. Para cortadores de CO 2 a laser convencionais, descobrimos que ele pode produzir características circulares ou curvas com boa fidelidade, mas não geometrias com cantos afiados (por exemplo., Quadrado). Em aplicações onde pequenas ou cortantes características são desejados, os orifícios na folha de stencil pode ser fabricado por moldagem de PDMS em um modelo de silício microfabricado contendo relevos dos micropadrões 28. O desafio do método de moldagem é a produção de micro-orifícios de passagem tamanho em folhas finas PDMS sem PDMS residuais ao longo dos relevos molde de silício. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para lidar com este problema, tal como descrito por Li et. ai. 28
Durante o quantotagem da folha de stencil e junta para produzir o estêncil de células, deve-se garantir que a folha é prependicular plana e livre de poeira durante o processo de ligação, a fim de evitar fugas do estêncil. Flambagem da folha de stencil durante o processo de ligação pode comprometer a vedação da matriz para o substrato de cultura, fazendo com que células de ECM e soluções de vazar do micropadrão furos de passagem. A matriz deve ser esterilizado por tratamento em autoclave (120 ° C, 30 min) e cuidadosamente secos num forno para assegurar que ele pode formar uma boa vedação com o substrato de cultura.
Outro factor importante é a escolha do material de folha de stencil. A matriz de PDMS é ideal para hPSCs micropatterning sobre substratos rígidos de cultura, tais como TCPS com uma rigidez de ~ 2 GPa. No entanto, se alguém deseja micropadrão hPSCs sobre substratos mais macios, como em PDMS substratos comumente usados para rigidez substrato celular melodia 34, a conformidade de um PDMSfolha de stencil tornará difícil de descascar o estêncil após o processo de semeadura de células, portanto, destruindo as micropadrões HPSC. Neste caso, a escolha do material para a folha de stencil da matriz deve ser seleccionado de tal modo que ela pode formar uma vedação com o substrato de cultura, mas pode ser removida com facilidade.
Micropadrões geradora HPSC
O protocolo para micropatterning H9 hESCs em substratos PFC usando um estêncil PDMS aqui apresentado foi otimizado para alcançar uma colônia confluente com boa viabilidade celular e fidelidade padronização. É essencial que os hPSCs formar interacções célula-célula e célula-matriz apropriados dentro do confinamento espacial de uma geometria particular definido pelas micropadrões modo que se pode investigar a forma como factores dependentes da geometria influenciar destino de diferenciação. Nós identificamos alguns passos críticos para gerar sucesso micropadrões HPSC (Fig. 4)e são discutidos como se segue.
Em primeiro lugar, a qualidade da cultura HPSC importa. É importante para colher as colónias HPSC a 70-80% de confluência, com a maioria das colónias que mostram a morfologia HPSC indiferenciado enquanto removendo as zonas diferenciadas. Sobre-confluentes culturas HPSC geralmente causar diferenciação espontânea, e se as áreas diferenciadas não são removidas antes da sementeira de células, as células diferenciadas irá perturbar a formação normal padrão de diferenciação.
Em segundo lugar, quando a colheita colônias HPSC a suspensão única célula, evitando o excesso de tratamento com enzimas digestivas é fundamental, porque isso muitas vezes resulta em morte celular após incubação durante a noite, mesmo que as células podem anexar inicialmente. Nós descobrimos que 8 minutos de tratamento enzimático é ideal para a linha H9 hESC cultivadas em nosso laboratório; embora seja recomendável que o tempo de tratamento de descolamento de células devem ser otimizados separadamente para diferentes linhas celulares.
Por último, existe uma necessidade para passivar o substrato circundante os micropadrões HPSC com moléculas adesivas não-célula, a fim de restringir proliferação ou diferenciação de células para dentro da micropadrão. Isto é essencial para manter a fidelidade da micropadrão HPSC, e, por sua vez, o gradiente ambiental bioquímica e mecânica para padrões de diferenciação para se desenvolver. Cultura celular compatíveis tensioactivos não-iónicos, tais como Pluronic F-127 pode ser usado como um agente passivador. Quando passivating com surfactantes, o tempo de tratamento e concentração deve ser otimizado devido à citotoxicidade do surfactante na exposição longa. Como discutimos acima, o protocolo apresentado fornece um guia detalhado para micropadrão hPSCs usando um estêncil PDMS, mas otimização deste protocolo, especialmente para as etapas críticas acima, é encorajado a successfully gerar micropadrões HPSC.
Uma limitação de micropatterning estêncil é que é mais adequada para a geração de micropadrões maiores que variam de 100-1,500 uM. Para gerar características muito pequenos destinados a padronização de células individuais, a fabricação de folhas de stencil com <50 uM furos de passagem é muito desafiante, como mencionado anteriormente. Assim, espera-se que o uso de estêncil hPSCs micropatterned é bem adequado para investigar multicelular formação de padrões de tecido em diferentes processos de desenvolvimento (por exemplo, dobrando neuroepithelium ou padronização endoderme).
Usando micropatterning para confinar geometricamente uma população HPSC, podemos estabelecer de adesão celular mediada mecânicas 10 e parácrinos gradientes de sinalização 6 de controlar e compreender a organização espacial dos destinos de diferenciação resultantes. Estes modelos HPSC micropatterned com differentiatio organizados espacialmenten sua vez pode ser traduzido em doenças ou de triagem teratogen modelos específicos de humanos 11 para defeitos de nascimento congénitas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por NUS Inicie concessão (R-397-000-192-133) e Fundo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS é um estudioso NUS Research. Autores gostariam de agradecer ao Dr. Jiangwa Xing por seu apoio técnico sobre micropatterning celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
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