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Developmental Biology

भेदभाव भाग्य के स्थानिक संगठन जांच के लिए मानव स्टेम कोशिकाओं के स्टैंसिल micropatterning

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54097
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) को अलग करने के लिए और विशिष्ट ऊतक पैटर्न में स्वयं को व्यवस्थित आंतरिक क्षमता है; हालांकि इस स्थानिक पर्यावरण ढ़ाल की प्रस्तुति की आवश्यकता है। हम hPSC भेदभाव पैटर्न को नियंत्रित करने के लिए जैव रासायनिक और यांत्रिक ढ़ाल उत्पन्न करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि के रूप में स्टैंसिल micropatterning प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs), भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) सहित व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य और रोगग्रस्त जीवोत्पत्ति की प्रयोगात्मक मॉडलिंग के रूप में उनके भेदभाव की क्षमता की वजह से सभी की सेल प्रजातियों में शोषण कर रहे हैं तीन रोगाणु परतों 1,2। HPSCs के भेदभाव भाग्य अत्यधिक स्थानीय पर्यावरणीय कारकों है कि ऑटोक्राइन या पैराक्राइन 1 संकेत के साथ ही mechanotransduction प्रक्रियाओं शारीरिक संकेतों 3-5 से मध्यस्थता कर सकते हैं मिलाना के प्रति संवेदनशील हैं। सेल micropatterning तकनीक है कि इस तरह के स्थानिक सेल सेल बातचीत 6 और सेल मैट्रिक्स बातचीत 3 के रूप में, स्थानीय सेलुलर microenvironment नियंत्रित करने के लिए एक मतलब के रूप में ज्यामिति और एक सेल की आबादी के स्थान व्यवस्थित करने के लिए विकसित किया गया है का एक सेट शामिल हैं। hPSCs के संदर्भ में, सेल micropatterning कैसे आला-निर्भर में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए नियोजित किया गया हैईएनटी ऑटोक्राइन सिगनल जल्दी भ्रूण भेदभाव पैटर्न 6 में hESC pluripotency-भेदभाव फैसलों 7 और संगठन modulates। 2 डी और 3 डी micropatterned hPSCs बहुकोशिकीय पैटर्न, जो बारी में तीन रोगाणु परतों 8,9 में भेदभाव निर्णयों को प्रभावित की कॉलोनी आकार को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम एक hPSC कॉलोनी के भीतर सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत की हद मिलाना की जांच के लिए कैसे इंटीग्रिन-ई cadherin crosstalk सेल भाग्य विविधता 10 को जन्म दे सकते हैं बहुकोशिकीय hPSC micropatterns कार्यरत है। विकास रोगों 11, ऊतक या अंग विकास के दौरान वृद्धि कारक है और हार्मोन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दवा विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में hPSCs की बहुकोशिकीय micropatterns के आवेदन की दिशा ऊपर की रिपोर्ट के खुले नए रास्ते से प्रदर्शनों, और के गठन को जानने के लिए ऊतक पैटर्न।

सेल micropatter के असंख्यनिंग तकनीक के रूप में Falconnet एट द्वारा समीक्षा विकसित किया गया है। अल। 12 लेकिन इस तरह के सूक्ष्म संपर्क मुद्रण 7,8,13 के रूप में केवल एक मुट्ठी, microwell संस्कृति 14,15, photopatterning 6 और microstencils 16 सफलतापूर्वक hPSCs के साथ लागू किया गया है। micropatterning hPSCs के साथ चुनौती अपने जोखिम और सेल लगाव और अस्तित्व के लिए विशिष्ट कोशिकी matrices (ईसीएम) और विकास की स्थिति की एक कड़े आवश्यकता में निहित है। 2 डी hPSC पैटर्न के लिए, सूक्ष्म संपर्क मुद्रण सबसे आम तरीकों में टिशू कल्चर और ग्लास substrates 13 पर hPSC micropatterns उत्पन्न करने के लिए में से एक है। विधि पैटर्न आम ऐसे Matrigel के रूप में laminin और तहखाने झिल्ली matrices, सहित hPSC संस्कृति में इस्तेमाल किया ईसीएम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह आम तौर पर एक दो कदम कोटिंग प्रक्रिया पाली-D-लाइसिन द्वारा सहायता प्राप्त की आवश्यकता है, और विशिष्ट अक्रिय वायुमंडलीय और आर्द्रता की स्थिति की जरूरत स्थिर ईसीएम micropatterns बनाने के लिए hPSCs 6,13 पर संलग्न करने के लिए। प्रत्येक micropatterning विधि के अग्रणी विचार सतह संशोधन शासन वांछित ज्यामितीय संकल्प पर hPSC चिपकने वाला ईसीएम पैटर्न उत्पन्न जबकि आसपास के क्षेत्रों के लिए unspecific सेल लगाव को कम कर सकते हैं कि क्या है।

यहाँ, हम एक सरल विधि के रूप में स्टैंसिल micropatterning के उपयोग की रिपोर्ट hPSCs पर संलग्न करने के लिए अतिरिक्त कदम सतह संशोधन चिपकने वाला ईसीएम पैटर्न की पीढ़ी के लिए पहले बिना hPSC micropatterns उत्पन्न करते हैं। सेल स्टैंसिल के माध्यम से छेद एक सेल संस्कृति सब्सट्रेट शारीरिक रूप से ईसीएम कोटिंग्स और बाद में वरीयता प्राप्त hPSCs को रोकने के लिए पर सील आकार मिलीमीटर, एक पतली झिल्ली, जैसे, polydimethylsiloxane (PDMS) शीट के शामिल हैं माइक्रोन के साथ। स्टैंसिल patterning शारीरिक रूप से स्थान जहां hPSC अंतर्निहित ईसीएम लेपित सब्सट्रेट करने के लिए उपयोग और संलग्न कर सकते हैं सीधे निरोधक द्वारा काम करता है, इस विधि विभिन्न substrates कि hPSC संस्कृतियों का समर्थन कर सकते हैं के साथ संगत है। केवल requiremenटी कि स्टैंसिल सामग्री का चुनाव सब्सट्रेट के साथ एक प्रतिवर्ती मुहर फार्म कर सकते है। इन substrates पारंपरिक टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) 17, ligand संयुग्मित substrates 18, साथ ही ट्यून करने योग्य कठोरता के साथ elastomeric substrates शामिल हैं (उदाहरण के लिए।, PDMS) 19। इस विधि को भी अलग ईसीएम की कोटिंग, ऐसे vitronectin (या VTN प्रोटीन), laminin और तहखाने झिल्ली matrices (जैसे, Matrigel और Geltrax) के रूप में उचित लगाव और hPSCs के भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देता है। एक विशिष्ट hPSC लाइन के लिए इसलिए, हम अनुकूलित हस्तांतरण कर सकते हैं ईसीएम सब्सट्रेट विन्यास इष्टतम सेल मैट्रिक्स आसंजन, अस्तित्व और भेदभाव के लिए micropatterning स्टैंसिल करने के लिए। हाल ही में, एक समान विधि भी पाली (मिथाइल methacrylate) का उपयोग micropatterning hESCs (PMMA) सूक्ष्म स्टैंसिल सरणियों 16 से यकृत भेदभाव को निर्देशित करने के लिए सूचित कर दिया गया है।

सेल स्टेंसिल, विभिन्न सामग्रियों से गढ़े जा सकता मुलाकात सहितए एल एस 20,21, पाली (पी-xylylene) पॉलिमर 22,23, PMMA 16 और सबसे अधिक, PDMS 24-28। सिलिकॉन और पाली (पी-xylylene) पॉलिमर स्टेंसिल विशेष उपकरणों 20-23, जो जैविक उपयोगकर्ताओं के लिए उनकी पहुंच को सीमित करता है के साथ के माध्यम से छेद के प्रत्यक्ष नक़्क़ाशी की आवश्यकता होती है। PDMS स्टेंसिल सुविधा आकार की आवश्यकता है, जो आमतौर पर 3 माइक्रोन के लिए 2,000 माइक्रोन 11,26-29 से पर्वतमाला के आधार पर अलग अलग तरीकों से गढ़े जा सकता है। छोटे सुविधाओं वांछित हैं, पतली शीट stenciling प्रेस मोल्डिंग PDMS micropatterns 28 की राहतें युक्त एक microfabricated सिलिकॉन टेम्पलेट पर पूर्व बहुलक द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। विशेषताएं> 1,000 माइक्रोन के लिए, एक सीओ 2 लेजर कटर एक आसान और कम लागत विधि सीधे स्टैंसिल निर्माण के दौरान एक पूर्व casted PDMS शीट पर पैटर्न में कटौती करने के लिए प्रदान करता है। PDMS स्टेंसिल की recyclability भी पर्याप्त स्थिरता के साथ प्रयोगों की एक श्रृंखला का संचालन करने के लिए उन्हें लागत प्रभावी बनाता है।

10 में हुई।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल 1,000 माइक्रोन पैटर्न लेजर काटने और hESC लाइन के micropatterning, H9 PDMS स्टैंसिल का उपयोग करके साथ PDMS स्टैंसिल के निर्माण का वर्णन है।

1. डिजाइन और micropatterning के लिए PDMS स्टैंसिल का निर्माण

  1. डिजाइन वांछित ज्यामिति और आकार (जैसे, 1000 माइक्रोन हलकों) और स्टैंसिल गैसकेट कंप्यूटर एडेड डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के 10 के माध्यम से छेद के साथ stenciling चादर।
  2. Stenciling चादर और 120-150 माइक्रोन और 2 मिमी मोटी polydimethylsiloxane (PDMS) शीट्स क्रमश: सीओ 2 लेजर कटर 10 के प्रयोग पर गैसकेट लेजर कट।
  3. micropatterning के लिए PDMS स्टैंसिल प्राप्त करने के लिए 3-4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर PDMS स्टैंसिल तरल uncured PDMS और सेंकना का उपयोग कर चादर के साथ PDMS गैसकेट बांड।
  4. 30 मिनट के लिए और उपयोग करने से पहले एक ओवन में सुखाने के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा PDMS स्टैंसिल जीवाणुरहित।

2. hESCs मुख्यरखरखाव

  1. संस्कृति hESC 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 × hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित सेल संस्कृति प्लेटों पर एक फीडर से मुक्त रखरखाव माध्यम में लाइनों और 5% सीओ 2।
  2. पारित होने hESCs जब वे लगभग Dispase उपचार के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट ऊष्मायन से 70% मिला हुआ है और यंत्रवत् 100-200 माइक्रोन झुरमुटों में hESC कालोनियों अलग कर रहे हैं। 6 बंटवारे अनुपात: एक 1 पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित टिशू कल्चर polystyrene पर प्रति विकास क्षेत्र की 9.6 सेमी 2 30-50 झुरमुटों के घनत्व पर थाली hESCs झुरमुटों।

3. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के स्टैंसिल micropatterning

  1. तैयारी patterning सेल से पहले
    1. पेट्री डिश में ultrapure पानी में 700 μl 70% विश्लेषणात्मक ग्रेड इथेनॉल वितरण और शीर्ष पर स्टैंसिल रखकर एक 60 मिमी पेट्री डिश पर एक PDMS स्टैंसिल सील।
    2. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पेट्री डिश की जगह रात भर जाने के लिए टीवह सूखी इथेनॉल।
    3. चेक कोई बुलबुला स्टैंसिल के नीचे मौजूद है कि यह सुनिश्चित करने स्टैंसिल पेट्री डिश के साथ एक अच्छा मुहर रूपों। इस ईसीएम कोटिंग समाधान के लीकेज से बचाता है। बाँझ शर्तों के तहत पेट्री डिश और दुकान सील जब तक यह सेल बोने के लिए तैयार है।
    4. विश्लेषण के प्रमाण पत्र के अनुसार hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की aliquots तैयार करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक विभाज्य पैदावार 1 × hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान जब Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के 25 मिलीलीटर में पतला: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM / F12) निर्माता के उत्पाद शीट के अनुसार।
    5. DMEM / F12 के 16.7 मिलीलीटर में hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से एक विभाज्य जोड़ने 1.5 × hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान बनाने के द्वारा ईसीएम कोटिंग समाधान तैयार है। जमाना रोकने के लिए बर्फ पर सभी ईसीएम कोटिंग समाधान रखें।
    6. 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला (Y27632) के साथ अनुपूरक hESC रखरखाव मध्यम।
  2. stenciled सब्सट्रेट पर ईसीएम कोटिंग
    1. 90 सेकंड के लिए 100 WO 2 प्लाज्मा के साथ पेट्री डिश समझो। बाँझपन को सुनिश्चित करने के लिए, केवल प्लाज्मा इलाज के लिए पहले प्लाज्मा कक्ष के अंदर पेट्री डिश कवर खुला, और जल्दी उपचार के पूरा होने के बाद पेट्री डिश वापस कवर। इस सतह गीला की सुविधा और ईसीएम कोटिंग समाधान के अलावा दौरान माध्यम से छेद micropattern में हवा बुलबुला गठन से बचाता है।
    2. पूरे स्टैंसिल कवर करने के लिए 1.5 × hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 450 μl जोड़ें। ऐसे Parafilm के रूप में स्वयं sealable फिल्म, साथ पेट्री डिश सील, बाहर सुखाने से समाधान को रोकने के लिए, और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. Stenciled सब्सट्रेट पर सीडिंग hESCs
    1. गोल, कसकर packe की (जैसे, हानि 6 अच्छी तरह से थाली में hESC कालोनियों की जांच करने ठेठ hESC आकृति विज्ञान के नुकसान दिखा भेदभाव सेल क्षेत्रों की पहचान करनेडी उपकला आकृति विज्ञान, प्रमुख nucleoli के साथ उच्च नाभिक / कोशिका द्रव्य अनुपात)। एक वैक्यूम Aspirator का उपयोग कर अलग-अलग क्षेत्रों निकालें।
    2. 2 मिलीलीटर DMEM / अच्छी तरह से प्रति F12 के साथ दो बार धोएं।
    3. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से, इस तरह के Accutase के रूप में पाचन एंजाइमों, के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सब्सट्रेट से सभी कालोनियों को अलग करने के लिए धीरे थाली नल।
    4. पाचन एंजाइमों के 1 मिलीलीटर प्रति DMEM / F12 के कम से कम 4 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन इकट्ठा।
    5. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 200 × छ पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला हटाने और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के hESC रखरखाव मध्यम रॉक अवरोध करनेवाला (Rocki) के साथ पूरक के 400 μl जोड़ने के लिए। सेल निलंबन पिपेट और नीचे 3 गुना धीरे एकल कक्षों में झुरमुटों तोड़ने के लिए।
    7. एकल कक्ष निलंबन अच्छी तरह मिक्स और DMEM / F12 (1:20 कमजोर पड़ने) के 190 μl में सेल के नमूने के 10 μl पतला। एक hemocytome का प्रयोग करेंआतंकवाद शेयर सेल निलंबन में सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए।
    8. एक दिया स्टैंसिल के लिए आवश्यक सेल बोने घनत्व की गणना।
      नोट: उदाहरण के लिए, हम प्रयोगात्मक सेल बोने घनत्व निर्धारित किया है प्राप्त करने के लिए एकल कक्षों का एक मिला हुआ monolayer लगभग 4444 कोशिकाओं / 2 मिमी है। इस प्रकार, 450 मिमी 2 के एक क्षेत्र है और 400 μl के बोने की मात्रा के साथ एक स्टैंसिल एक सेल निलंबन की आवश्यकता होती है 2 मिलियन कोशिकाओं / 400 μl के घनत्व पर हो जाएगा।
    9. आवश्यक बोने घनत्व (देखें कदम 3.3.8 नोट) hESC संस्कृति के माध्यम Rocki के साथ पूरक के साथ करने के लिए शेयर सेल निलंबन पतला।
    10. प्रत्येक स्टैंसिल में कोशिकाओं के लिए आवश्यक संख्या युक्त सेल निलंबन के एक नामित मात्रा में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए हुड में undisturbed कोशिकाओं व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए पेट्री डिश छोड़ दें।
    11. इनक्यूबेटर में पेट्री डिश स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए सेते सेल लगाव के लिए अनुमति देने के लिए। दौरान पेट्री डिश स्तर पर रखने के लिए ध्यान रखनाप्रक्रिया हस्तांतरण ताकि कोशिकाओं स्टैंसिल में एक monolayer के रूप में रहते हैं।
  4. स्टैंसिल हटाने और unpatterned सब्सट्रेट के passivation
    1. यदि कोशिकाओं को ठीक अंतर्निहित सब्सट्रेट पर जुड़े होते हैं जाँच करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे पेट्री डिश जांच करते हैं।
    2. स्टैंसिल से सेल निलंबन दूर aspirate।
    3. DMEM / F12 में 0.5% सेल संस्कृति संगत गैर ईओण surfactant के 2 मिलीलीटर / पकवान स्टैंसिल आसपास के क्षेत्र में जोड़े।
    4. धीरे स्टैंसिल छील करने के लिए autoclaved संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। गैर ईओण surfactant समाधान चारों ओर चक्कर आने के रूप में स्टैंसिल से खुली है बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए। दिखने में पेट्री डिश में micropatterned कोशिकाओं निरीक्षण करते हैं।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.5% गैर ईओण surfactant-DMEM / F12 समाधान में micropatterned-कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. महाप्राण दूर गैर ईओण surfactant-DMEM / F12 समाधान। 2 मिलीग्राम / DMEM / F12 के पकवान के साथ 3 बार धोएं।
    7. hESC के 2 मिलीलीटर / पकवान जोड़ेरखरखाव मध्यम Rocki के साथ पूरक और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. रात ऊष्मायन के बाद, महाप्राण hESC रखरखाव मध्यम Rocki के साथ पूरक, DMEM / F12 के साथ एक बार धोने और 2 मिलीग्राम / 100 एनजी / एमएल Activin, 25 एनजी / एमएल BMP4 और 10 एनजी / एमएल FGF2 के साथ पूरक भेदभाव माध्यम के पकवान जोड़कर mesoendoderm भेदभाव प्रेरित ।
    9. चरण विपरीत इमेजिंग का उपयोग micropatterns मूल्यांकन करें और के रूप में पहले 8 वर्णित प्रत्येक पैटर्न के लिए औसत Brachyury (टी) तीव्रता प्रोफाइल की गणना।

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Representative Results

इस पत्र में, हम एक लेजर कटर का उपयोग कर 1,000 माइक्रोन सुविधाओं उत्पन्न करने के लिए एक सेल स्टैंसिल के निर्माण का वर्णन है। स्टैंसिल 2 भागों से बना था: एक पतली चादर stenciling (लगभग 100-200 माइक्रोन मोटी) के माध्यम से छेद micropattern युक्त, और एक PDMS गैसकेट ईसीएम कोटिंग समाधान या सेल निलंबन को रोकने के लिए। इधर, 127 माइक्रोन और 2 मिमी मोटी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PDMS शीट stenciling चादर और पाल बांधने की रस्सी के रूप में क्रमश: इस्तेमाल किया गया। इस तरह के स्पिन कोटिंग के रूप में चलाया हुआ मोटाई के PDMS चादरें, तैयारी के लिए अन्य तरीकों, यह भी भागों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दोनों घटकों के एक चिपकने वाला या प्लाज्मा संबंध के रूप में तरल uncured PDMS prepolymer-crosslinker मिश्रण का उपयोग करके एक साथ बंधुआ, और 3-4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (छवि। 1) में पके हुए थे।

stenciling शीट के लिए सामग्री सेल संस्कृति एस की पसंद के आधार पर चयनित किया गया थाubstrate। संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में पारंपरिक टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) का उपयोग करते हैं, PDMS PDMS स्टेंसिल stenciling चादर के अनुपालन के बाद से इस्तेमाल किया जा सकता कठोर TCPS (ई ~ 3 GPA) (छवि। 2A) के साथ एक अच्छा मुहर बनेगी। प्रयोगात्मक डिजाइन ऐसे ही एक के 5 किलो पास्कल 2 एमपीए से 30, stiffer stenciling सामग्री नियोजित किया जा सकता है कि एक ट्यून करने योग्य कठोरता श्रृंखला के साथ elastomeric PDMS substrates के रूप में नरम सेल संस्कृति substrates, पर स्टेम सेल भाग्य के स्थानिक विविधता की जांच करने के लिए जहां इच्छाओं में। एक उदाहरण के रूप में, हम ~ 5 किलो पास्कल (छवि। 2 बी) के एक कठोरता वाले एक पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) स्टैंसिल (ई ~ 2 GPA) के उपयोग के 1 मिमी नरम PDMS सब्सट्रेट पर micropatterned hPSC कालोनियों उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन किया। पीईटी स्टैंसिल एक stenciling (छवि। 2 बी, इनसेट) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पालतू फिल्मों से बना शीट पर एक PDMS गैसकेट gluing द्वारा निर्मित किया गया था। हम ध्यान दें कि micropatterning के दौरान आवश्यक सेल लगाव समयप्रक्रिया रह गया था (~ 3 घंटा) कठोरता ~ 5 किलो पास्कल के नरम PDMS सब्सट्रेट पर पारंपरिक TCPS substrates की तुलना में।

हम सेल आसंजन मध्यस्थता यांत्रिक बलों सकता है पैटर्न जल्दी mesoendoderm भेदभाव में है कि स्थानिक विविधता को प्रदर्शित करने के स्टैंसिल micropatterned hESC कालोनियों का उपयोग किया। हम पहले से पता चला है कि H9 hESCs कॉलोनी परिधि में कॉलोनी के इंटीरियर पर कोशिकाओं, जब Activin, BMP4 और FGF2 31 (छवि के साथ प्रेरित Brachyury (टी) पॉजिटिव mesoendoderm कोशिकाओं में उनकी तरजीही भेदभाव में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में अधिक इंटीग्रिन adhesions का अनुभव किया। 3A )। कोशिकाओं एक निरंतर कॉलोनी क्षेत्र में अलग-अलग geometries (वृत्त, वर्ग, आयत और अर्द्ध परिपत्र चाप) में नमूनों रहे थे, इंटीग्रिन की मध्यस्थता कर्षण बलों की एक स्थानीय एकाग्रता का नेतृत्व करने के चौराहों, आयत, और उत्तल curvatures के कोनों पर ज्यामितीय anisotropy और वृद्धि की mesoend में हुईoderm भेदभाव 32,33। दरअसल, एक भी कॉलोनी के भीतर अलग-अलग इलाकों में मानचित्रण टी अभिव्यक्ति तीव्रता से, हमने पाया कि mesoendoderm प्रेरण की हद छवि वर्ग और आयताकार कालोनियों (छवि। 3 बी) की तेज कोनों में और एक अर्द्ध परिपत्र चाप के उत्तल curvatures पर (अधिक था । -3 सी) है, जो एक anisotropic ज्यामिति 32,33 में रिपोर्ट उच्च इंटीग्रिन की मध्यस्थता तनाव क्षेत्रों के लिए पत्राचार किया। इसलिए, micropatterning आगामी भेदभाव प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए एक साधन के रूप में एक अक्षुण्ण hPSC कॉलोनी के भीतर कोशिका आसंजन मध्यस्थता यांत्रिक बलों के स्थानिक वितरण मिलाना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. micropatterning के लिए PDMS स्टैंसिल की पीढ़ी। (ए) स्टैंसिल निर्माण में महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध। एक 127 माइक्रोन मोटी चादर PDMS La थाडिजाइन पैटर्न का उत्पादन करने के लिए सेवा-काट, और एक और 2 मिमी मोटी PDMS चादर गैसकेट उत्पादन करने के लिए लेजर कट गया था। इन दोनों घटकों uncured PDMS स्टैंसिल इकट्ठा करने के साथ एक साथ बंधुआ रहे थे। (बी) छवियाँ घटकों के विधानसभा दिखा छेद के माध्यम से 1 मिमी परिपत्र के साथ एक PDMS स्टैंसिल बनाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. micropatterned hESC अलग संस्कृति substrates पर कालोनियों (1000 माइक्रोन हलकों)। HESC micropattern कॉलोनी के सूक्ष्म छवियों तुरंत (ए) PDMS स्टेंसिल (इनसेट) कठोर substrates, पर hESC micropatterns उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है को हटाने के बाद जैसे, कठोरता के TCPS ~ 2 GPa, और (बी) पीईटी स्टेंसिल (इनसेट) नरम substrates, जैसे पर micropatterns उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया, कठोरता ~ 5 किलो पास्कल के PDMS। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. उनकी mesoendoderm भेदभाव 8 के आधार पर अलग अलग ज्यामितीय आकार के hESC micropatterns का प्रभाव। (ए) अलग अलग ज्यामितीय आकार, लेकिन एक ही कॉलोनी क्षेत्र PDMS स्टेंसिल का उपयोग कर उत्पन्न किया गया की hESC micropatterns। चरण छवियों (शीर्ष पैनल) और तीव्रता नक्शे टी अभिव्यक्ति (नीचे पैनल) की mesoendoderm भेदभाव के 24 घंटे के बाद। (बी) औसत टी तीव्रता प्रोफाइल (सफेद बिंदीदार लाइनों के साथ में (ए)) सममितीय परिपत्र कालोनियों या anisometric वर्ग और आयताकार कालोनियों में । सभी कालोनियों एक ही क्षेत्र पूर्व की थी 50% चक्र है, जो कॉलोनी क्षेत्र के आधा था। (सी) अवतल या एक अर्द्ध परिपत्र चाप में कॉलोनी इंटीरियर में उत्तल किनारों से औसत टी तीव्रता प्रोफाइल, के रूप में सफेद बिंदीदार रेखा (ए) ने संकेत दिया घूमने के अलावा। में प्रत्येक तीव्रता प्रोफ़ाइल (बीसी) 4 कालोनियों से प्राप्त 16 तीव्रता प्रोफाइल के एक औसत है। छवियाँ Toh एट से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित कर रहे हैं। अल।, 8। स्केल बार = 200 माइक्रोन और RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. कार्यप्रवाह hESC कालोनियों micropattern और भेदभाव के लिए प्रेरित करने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। HESC micropatterns के सफल उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण कदम ग्रे बक्से में डाला जाता है।.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Micropatterning स्टेंसिल का निर्माण

स्टैंसिल micropatterning आला मध्यस्थता भेदभाव patterning की जांच के लिए hPSC micropatterns उत्पन्न करने के लिए एक आदर्श तरीका प्रदान करता है। ऐसे microcontact मुद्रण और photopatterning के रूप में अन्य micropatterning तकनीक, पर स्टैंसिल patterning के प्रमुख लाभ यह है कि यह सतह संशोधन की आवश्यकता नहीं है और पारंपरिक TCPS substrates पर लागू किया जा सकता है। इसलिए, अनुकूलित संस्कृति मीडिया और विभिन्न hPSC लाइनों के लिए ईसीएम कोटिंग्स आसानी से micropatterning स्टैंसिल को हस्तांतरित किया जा सकता है।

सेल स्टैंसिल कि अच्छा micropatterns के उत्पादन में योगदान के निर्माण के दौरान महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। hPSC micropatterns में बनाया गया geometries reproducing की निष्ठा गुणवत्ता और stenciling चादर में छेद के माध्यम से निर्माण की स्थिरता पर निर्भर करता है। बहुकोशिकीय micropat शामिल अध्ययन के लिए> 1,000 माइक्रोन के terns, के माध्यम से छेद सीधे एक पूर्व casted PDMS शीट पर लेजर काटने से गढ़े जा सकता है। लेजर काटने का संकल्प और लेजर बीम के स्थान आकार यांत्रिक स्टेज लेजर बीम के रास्ते को नियंत्रित करने की शुद्धता पर निर्भर है। पारंपरिक सीओ 2 लेजर कटर के लिए, हमने पाया है कि यह नहीं बल्कि अच्छा निष्ठा के साथ परिपत्र या घुमावदार सुविधाओं तेज कोनों के साथ geometries (जैसे।, वर्ग) का उत्पादन कर सकते हैं। आवेदन कहाँ छोटे या तेज सुविधाओं वांछित कर रहे हैं, के माध्यम से छेद stenciling शीट में micropatterns 28 की राहतें युक्त एक microfabricated सिलिकॉन टेम्पलेट पर PDMS मोल्डिंग द्वारा गढ़े जा सकता है। मोल्डिंग विधि की चुनौती के माध्यम से छेद सिलिकॉन टेम्पलेट राहतें पर कोई अवशिष्ट PDMS के साथ पतली PDMS शीट में सूक्ष्म आकार का उत्पादन होता है। कई रणनीतियों के रूप में ली एट द्वारा वर्णित इस समस्या का समाधान करने के लिए विकसित किया गया है। अल। 28

के रूप में के दौरानstenciling चादर और गैसकेट सेल स्टैंसिल का उत्पादन करने की विधानसभा, एक सुनिश्चित करना चाहिए कि stenciling चादर आदेश स्टैंसिल से लीकेज को रोकने के लिए संबंध प्रक्रिया के दौरान फ्लैट और धूल से मुक्त है। संबंध प्रक्रिया के दौरान stenciling चादर की Buckling संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए स्टैंसिल की सील समझौता हो सकता है, ईसीएम और सेल समाधान के माध्यम से छेद micropattern से रिसाव के कारण। स्टैंसिल autoclaving (120 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट) द्वारा निष्फल होना चाहिए और अच्छी तरह से एक ओवन में सूख जाना सुनिश्चित करने के लिए कि यह संस्कृति सब्सट्रेट के साथ एक अच्छा मुहर फार्म कर सकते हैं।

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक stenciling चादर सामग्री का चयन है। PDMS स्टैंसिल ऐसे TCPS के रूप में कठोर संस्कृति substrates, ~ 2 GPa की कठोरता के साथ पर micropatterning hPSCs के लिए आदर्श है। हालांकि, ऐसे ही एक PDMS substrates सामान्यतः धुन सेल सब्सट्रेट कठोरता 34, एक PDMS का अनुपालन करने के लिए इस्तेमाल के रूप में नरम substrates पर hPSCs, micropattern चाहती हैstenciling चादर यह मुश्किल बंद सेल बोने की प्रक्रिया के बाद स्टैंसिल छील करने के लिए है, इसलिए hPSC micropatterns को नष्ट कर देगा। इस मामले में, स्टैंसिल की stenciling शीट के लिए सामग्री पसंद इस तरह का चयन किया जाना चाहिए कि यह संस्कृति सब्सट्रेट के साथ एक सील फार्म कर सकते हैं, लेकिन आसानी के साथ बंद खुली किया जा सकता है।

जनरेटिंग hPSC micropatterns

यहाँ प्रस्तुत एक PDMS स्टैंसिल का उपयोग कर TCPS substrates पर H9 hESCs micropatterning के लिए प्रोटोकॉल अच्छा सेल व्यवहार्यता और patterning निष्ठा के साथ मिला हुआ कॉलोनी प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है। ऐसा नहीं है कि hPSCs एक विशेष ज्यामिति micropatterns द्वारा परिभाषित किया गया है, ताकि एक जांच सकते हैं कि कैसे ज्यामिति पर निर्भर कारकों भेदभाव भाग्य को प्रभावित के स्थानिक कारावास के भीतर उचित सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत के लिए फार्म आवश्यक है। हम कुछ महत्वपूर्ण कदम सफलतापूर्वक hPSC micropatterns उत्पन्न करने के लिए की पहचान की है (छवि। 4)और वे इस प्रकार के रूप में चर्चा कर रहे हैं।

सबसे पहले, hPSC संस्कृति की गुणवत्ता मायने रखती है। यह 70-80% संगम पर hPSC कालोनियों फसल के लिए, undifferentiated hPSC आकृति विज्ञान दिखा, जबकि अलग-अलग क्षेत्रों को हटाने कालोनियों के बहुमत के साथ महत्वपूर्ण है। से अधिक मिला हुआ hPSC संस्कृतियों आमतौर पर सहज भेदभाव का कारण है, और अगर अलग-अलग क्षेत्रों सेल बोने से पहले नहीं हटा रहे हैं, विभेदित कोशिकाओं सामान्य भेदभाव पैटर्न गठन को बाधित करेगा।

दूसरा, जब एकल कक्ष निलंबन के लिए hPSC कालोनियों कटाई, पाचक एंजाइम के साथ खत्म उपचार से बचने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अक्सर रात ऊष्मायन भले ही कोशिकाओं शुरू संलग्न कर सकते हैं के बाद सेल मौत में परिणाम है। हमने पाया है कि enzymatic उपचार के 8 मिनट हमारी प्रयोगशाला में संवर्धित H9 hESC लाइन के लिए इष्टतम है; हालांकि हम अनुशंसा करते हैं कि सेल टुकड़ी उपचार समय अलग सेल लाइनों के लिए अलग से अनुकूलित किया जाना चाहिए।

अन्त में, वहाँ आदेश proliferating या micropattern भीतर करने के लिए कोशिकाओं फर्क विवश करने के लिए गैर-सेल चिपकने वाला अणुओं के साथ hPSC micropatterns आसपास सब्सट्रेट passivate करने की जरूरत है। इस hPSC micropattern की निष्ठा बनाए रखने के लिए आवश्यक है, और बदले में, भेदभाव पैटर्न के लिए जैव रासायनिक और यांत्रिक पर्यावरण ढाल विकसित करने के लिए। सेल संस्कृति संगत गैर ईओण ऐसे Pluronic एफ 127 के रूप में surfactants, एक passivating एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जब surfactants के साथ passivating, उपचार समय और एकाग्रता लंबे समय जोखिम में surfactant के cytotoxicity के कारण अनुकूलित किया जाना चाहिए। जैसा कि हम ऊपर चर्चा की, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक PDMS स्टैंसिल का उपयोग कर hPSCs micropattern के लिए एक विस्तृत दिशानिर्देश प्रदान करता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल, विशेष रूप से ऊपर महत्वपूर्ण कदम के लिए, के अनुकूलन सु करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता हैccessfully hPSC micropatterns उत्पन्न करते हैं।

स्टैंसिल micropatterning की एक सीमा है कि यह बड़ा 100-1,500 माइक्रोन से लेकर micropatterns पैदा करने के लिए अधिक उपयुक्त है। एकल कक्ष patterning के लिए इरादा बहुत छोटी सुविधाओं, <50 माइक्रोन के माध्यम से छेद के साथ stenciling शीट के निर्माण उत्पन्न करने के लिए बहुत ही चुनौतीपूर्ण पहले उल्लेख के रूप में है। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि स्टैंसिल micropatterned hPSCs के उपयोग के विभिन्न विकास प्रक्रियाओं (जैसे, neuroepithelium तह या एण्डोडर्म patterning) के दौरान बहुकोशिकीय ऊतक पैटर्न गठन जांच करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

Micropatterning का उपयोग कर ज्यामितीय एक hPSC आबादी को सीमित करने के द्वारा, हम स्थापित कर सकते हैं कोशिका आसंजन मध्यस्थता मैकेनिकल 10 और पैराक्राइन सिगनल ढ़ाल 6 को नियंत्रित करने और उसके एवज में भेदभाव भाग्य के स्थानिक संगठन को समझते हैं। स्थानिक का आयोजन differentiatio के साथ ये micropatterned hPSC मॉडलn बदले में जन्मजात जन्म दोष के लिए मानव विशिष्ट रोग या teratogen स्क्रीनिंग मॉडल 11 में अनुवाद किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस काम एनयूएस के द्वारा समर्थित है अनुदान शुरू (आर-397-000-192-133) और ETPL गैप फंड (आर-397-000-198-592)। जीएस एक एनयूएस रिसर्च स्कॉलर है। लेखक सेल micropatterning पर उसे तकनीकी सहायता के लिए डॉ Jiangwa जिंग को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 2 mm thick PDMS sheet Specialty Silicone Products Inc., USA SSPM823-.005 Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet Specialty Silicone Products Inc., USA SSPM823-.040 Used to form stencil 
60 mm Petri dish Nunc Nunclon Delta 150326 Substrate for micropatterning
Accutase Accutase, Merck Millipore, Singapore SCR005 Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin   R&D Systems, Singapore 338-AC-010 Growth factor for H9 differentiation
BMP4  R&D Systems, Singapore 338-BP-010 Growth factor for H9 differentiation
Plasma system  Femto Science, Korea CUTE-MP For plasma oxidation of stencil
Dispase StemCell™ Technologies, Singapore 7923 Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12 GIBCO, USA 11330032 Basal medium for H9 cells
FGF2 R&D Systems, Singapore 233–FB–025 Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line WiCell Research Institute, Inc., USA WA09 Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix Matrigel, BD Biosciences, Singapore 354277 Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope Leica Microsystems, Singapore DMi1 For capturing bright-field images
Laser cutter Epilog Helix 24 Laser System Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium  StemCell™ Technologies, Singapore 5850 Maintainence medium for H9 cells
PDMS  SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA 3097358-1004 Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632 Calbiochem, Merck Millipore, Singapore 688000 Maintains H9 cells as single cells 
STEMdiff™ APEL™ medium  StemCell™ Technologies, Singapore 5210 Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film SureMark Singapore SQ-6633 Used to form stencil 
Cell culture compatible non-ionic surfactant Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore P2443 Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates

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विकास जीवविज्ञान अंक 112 मानव स्टेम कोशिकाओं सेल micropatterning स्टैंसिल भेदभाव भाग्य स्थानिक संगठन ऊतक patterning भ्रूण विकास
भेदभाव भाग्य के स्थानिक संगठन जांच के लिए मानव स्टेम कोशिकाओं के स्टैंसिल micropatterning
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Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates. J. Vis. Exp. (112), e54097, doi:10.3791/54097 (2016).

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