Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54097
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديهم القدرة الذاتية للتمييز وتنظيم الذات في أنماط النسيج متميزة. على الرغم من أن هذا يتطلب عرض التدرجات البيئية المكانية. نقدم الاستنسل micropatterning كوسيلة من وسائل بسيطة وقوية لتوليد التدرجات الكيميائية الحيوية والميكانيكية للسيطرة على أنماط التمايز hPSC.

Introduction

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، وتستغل على نطاق واسع في الطب التجديدي، وكذلك نماذج تجريبية من توالد الطبيعي والمريضة بسبب إمكانية المفاضلة الخاصة بهم في الأنساب خلية من كل ثلاث طبقات جرثومية 1،2. مصير التفريق بين hPSCs شديدة الحساسية للعوامل البيئية المحلية التي يمكن أن تعدل عمليات mechanotransduction autocrine أو نظير الصماوي يشير 1 وكذلك بوساطة الإشارات الجسدية 3-5. يشمل micropatterning خلية مجموعة من التقنيات التي تم تطويرها لتنظيم مكانيا هندسة والمكان من السكان خلية كوسيلة للسيطرة على المكروية الخلوية المحلية، مثل التفاعلات خلية خلية 6 والتفاعلات خلية مصفوفة 3. في سياق hPSCs، واستخدمت micropatterning خلية للحصول على أفكار هامة في كيفية محراب تعتمدوالأنف والحنجرة إشارات autocrine ينظم HESC القرارات تعدد القدرات تمايز 7 والتنظيم في وقت مبكر أنماط التمايز الجنينية 6. وقد استخدمت 2D و 3D hPSCs micropatterned للتحكم في حجم مستعمرة من أنماط متعددة الخلايا، والتي بدورها أثرت على قرارات التمايز في الطبقات الجرثومية الثلاث 8،9. لقد استخدمنا micropatterns hPSC متعددة الخلايا لتعديل حجم خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة داخل مستعمرة hPSC لمعرفة كيف يمكن للإنتغرين-E-كادهيرين الحديث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى مصير خلية التجانس 10. المظاهرات من التقارير المذكورة تفتح مجالات جديدة نحو تطبيق micropatterns متعددة الخلايا من hPSCs كنماذج تجريبية لفحص سمية الدواء للأمراض التنموية 11، لدراسة تأثير عوامل النمو والهرمونات خلال الأنسجة أو تطوير الجهاز، ولكشف تشكيل أنماط النسيج.

عدد لا يحصى من micropatter خليةوقد تم تطوير تقنيات نينغ على النحو الذي استعرضه Falconnet وآخرون. آل 12 ولكن فقط حفنة، مثل الصغرى الاتصال الطباعة 7،8،13، ثقافة microwell 14،15، photopatterning تم تنفيذ 6 وmicrostencils 16 بنجاح مع hPSCs. التحدي مع hPSCs micropatterning يكمن في ضعفها والمتطلبات الصارمة للمصفوفات معينة خارج الخلية (ECM) وظروف النمو لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة. لأنماط 2D hPSC والطباعة الاتصال الصغرى هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتوليد micropatterns hPSC على زراعة الأنسجة والزجاج ركائز 13. ويمكن استخدام هذه الطريقة لECM المشترك نمط المستخدمة في الثقافة hPSC، بما في ذلك laminin والغشاء القاعدي المصفوفات، مثل Matrigel. ومع ذلك، فإنه عادة ما يتطلب عملية طلاء خطوتين بمساعدة بولي-D-ليسين، ويحتاج الظروف الجوية والرطوبة الخاملة محددة لجعل micropatterns ECM مستقر لhPSCs لنعلق على 6،13. النظر قبل كل شيء من كل طريقة micropatterning هو ما إذا كان نظام تعديل السطح يمكن أن تولد أنماط ECM hPSC لاصقة في القرار الهندسي المطلوب، مع التقليل من مرفق الخلية غير محددة إلى المناطق المحيطة بها.

هنا، ونحن التقرير استخدام micropatterning الاستنسل كوسيلة من وسائل بسيطة لتوليد micropatterns hPSC دون خطوات تعديل سطح إضافية قبل جيل من أنماط ECM لاصقة لhPSCs إرفاق جرا. ويضم الاستنسل الخلية من غشاء رقيق، ورقة على سبيل المثال، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، مع ميكرون إلى ملليمتر حجم من خلال ثقوب مختومة على ركيزة الثقافة الخلية لاحتواء جسديا الطلاءات ECM وhPSCs المصنف في وقت لاحق. كما تعمل الاستنسل الزخرفة بإعاقة جسدية الموقع حيث يمكن hPSC الوصول وإرفاق مباشرة إلى الركيزة ECM الأساسي المغلفة، وهذا الأسلوب هو متوافق مع مختلف ركائز التي يمكن أن تدعم الثقافات hPSC. والاحتياج فقطتي هو أن اختيار المواد الاستنسل يمكن ان تشكل ختم عكسها مع الركيزة. وتشمل هذه الركائز التقليدية البوليسترين زراعة الأنسجة (برنامج التعاون الفني) 17، ركائز مترافق يجند 18، وكذلك ركائز المرنة مع صلابة الانضباطي (على سبيل المثال، PDMS) 19. كما يسمح هذا الأسلوب طلاء ECM مختلفة، مثل vitronectin (أو البروتين VTN)، laminin والمصفوفات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، Matrigel وGeltrax) للسماح لمرفق السليم والتفريق بين hPSCs. ولذلك، فإننا يمكن نقل الأمثل تكوينات ECM-الركيزة للحصول على خط hPSC محددة لالاستنسل micropatterning الأمثل لخلية مصفوفة التصاق والبقاء والتمايز. في الآونة الأخيرة، كما تم الإبلاغ عن طريقة مماثلة لتوجيه التمايز كبدي من hESCs micropatterning باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) صفائف الاستنسل الدقيقة 16.

الإستنسل خلية يمكن أن تكون ملفقة من مواد مختلفة، بما في ذلك التقى المرض 20،21، بولي (ف xylylene) البوليمرات 22،23، PMMA 16 و الأكثر شيوعا، PDMS 24-28. السيليكون وبولي (ف xylylene) البوليمرات الإستنسل تتطلب الحفر المباشر للمن خلال ثقوب مع المعدات المتخصصة 20-23، الأمر الذي يحد من إمكانية الوصول إليها للمستخدمين البيولوجي. PDMS الإستنسل يمكن أن تكون ملفقة من قبل وسائل مختلفة اعتمادا على حجم الميزة المطلوبة، والتي تتراوح عادة من 3 ميكرون إلى 2000 ميكرومتر 11،26-29. وإذا رغبت الميزات الصغيرة، وصحائف بالستينسيل رقيقة يمكن أن تنتج من قبل الصحافة صب PDMS قبل البوليمر على قالب السيليكون microfabricated تحتوي على نقوش من micropatterns 28. لميزات> 1000 ميكرون، ويوفر قاطع ليزر CO 2 وسيلة سهلة ومنخفضة التكاليف لخفض مباشرة أنماط على ورقة PDMS محمل مسبقا خلال تلفيق الاستنسل. وإعادة التدوير من الإستنسل PDMS أيضا يجعلها فعالة من حيث التكلفة لإجراء سلسلة من التجارب بما يكفي من الاتساق.

الحمار = "jove_content"> هنا، نقدم منهجية مفصلة لصنع الاستنسل PDMS مع 1000 ميكرون الميزات بواسطة القطع بالليزر وتوليد micropatterns HESC. واستخدمت هذه micropatterns HESC لتعديل مدى إنتغرين وE-كادهيرين بوساطة التصاقات داخل مستعمرة HESC متماسكة وذلك لمعرفة كيف أدى الاستقطاب المكاني للالتصاق الخلايا في خلية مصير التجانس 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تلفيق PDMS الاستنسل مع 1000 ميكرون أنماط بواسطة الليزر لعدة قطاعات وmicropatterning خط HESC، H9 باستخدام الاستنسل PDMS.

1. تصميم وتصنيع PDMS استنسل لMicropatterning

  1. تصميم ورقة بالستينسيل مع الثقوب عن طريق للهندسة والحجم المطلوبين (على سبيل المثال، 1000 ميكرون الدوائر) وحشية الاستنسل باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر برنامج 10.
  2. الليزر قطع ورقة بالستينسيل وحشية على 120-150 ميكرون و 2 ملم ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان سميكة (PDMS) ورقة على التوالي يستخدم CO 2 الليزر القاطع 10.
  3. السندات طوقا PDMS مع ورقة الاستنسل PDMS باستخدام PDMS غير مخمر السائلة وتخبز في 60 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة للحصول على الاستنسل PDMS لmicropatterning.
  4. تعقيم الاستنسل PDMS قبل التعقيم عند 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة والتجفيف في الفرن قبل استعماله.

2. hESCs الرئيسيةtenance

  1. ثقافة خطوط HESC في وسط صيانة مجانية المغذية في 1 × الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة لوحات زراعة الخلايا HESC المؤهلين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. تمرير hESCs عندما يكونون حوالي 70٪ متموجة قبل 3 دقائق الحضانة عند 37 درجة مئوية مع dispase العلاج وعدم الربط ميكانيكيا المستعمرات HESC إلى 100-200 ميكرون كتل. لوحة كتل hESCs في مناطق ذات كثافة من 30-50 كتل في 9.6 سم 2 من مساحة النمو على الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة الأنسجة البوليسترين الثقافة في نسبة 1: 6 تقسيم.

3. استنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

  1. قبل إعداد الخلية الزخرفة
    1. ختم استنسل PDMS على 60 مم طبق بيتري من قبل الاستغناء عن 700 ميكرولتر 70٪ من الإيثانول الصف التحليلي في الماء عالى النقاء في طبق بتري ووضع الاستنسل على القمة.
    2. وضع طبق بتري داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية بين عشية وضحاها للسماح رانه الايثانول الجاف.
    3. تحقق أي فقاعة موجودة تحت الاستنسل لضمان الاستنسل يشكل ختم جيدة مع طبق بيتري. هذا يمنع تسرب ECM حل الطلاء. ختم طبق بيتري وتخزينها تحت ظروف معقمة حتى انها مستعدة للتلقيح الخلية.
    4. إعداد aliquots من-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي المصفوفة وفقا لشهادة التحليل. تأكد من أن كل قسامة عوائد 1 ×-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي حل مصفوفة عندما تضعف في 25 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F12) وفقا لصحيفة المنتجات المصنعة.
    5. إعداد الحل ECM الطلاء عن طريق إضافة قسامة واحدة من بين HESC المؤهلين الغشاء القاعدي المصفوفة إلى 16.7 مل من DMEM / F12 لجعل 1.5 ×-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي حل المصفوفة. الحفاظ على كل ما الحل ECM طلاء على الجليد لمنع دبق.
    6. تكملة HESC المتوسطة الصيانة مع 10 ميكرومتر ROCK المانع (Y27632).
  2. طلاء ECM على الركيزة رسمت
    1. علاج طبق بيتري مع 100 WO 2 البلازما لمدة 90 ثانية. لضمان العقم، فقط فتح غطاء طبق بتري داخل غرفة البلازما قبل العلاج البلازما، وبسرعة الغطاء الخلفي طبق بيتري بعد الانتهاء من العلاج. هذا يسهل ترطيب سطح ويمنع تشكيل فقاعة الهواء في micropattern من خلال ثقوب خلال إضافة ECM حل الطلاء.
    2. إضافة 450 ميكرولتر من 1.5 × حل الغشاء القاعدي مصفوفة HESC المؤهلين لتغطية الاستنسل كله. ختم طبق بيتري مع فيلم قابل للغلق النفس، مثل بارافيلم، لمنع الحل من الجفاف، واحتضان لمدة 5 ساعة على 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. hESCs بذر على الركيزة رسمت
    1. دراسة المستعمرات HESC في لوحة 6 جيدا لتحديد مجالات خلية متمايزة تبين فقدان التشكل HESC نموذجي (على سبيل المثال، وفقدان مدورة، بإحكام Packe ود التشكل الظهارية، وارتفاع نسبة نواة / السيتوبلازم مع نويات بارزة). إزالة مناطق متباينة باستخدام الشافطة فراغ.
    2. يغسل مرتين مع 2 مل DMEM / F12 لكل بئر.
    3. إضافة 1 مل من الانزيمات الهاضمة، مثل Accutase، لكل بئر من لوحة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. اضغط على لوحة بلطف لفصل جميع المستعمرات من الركيزة.
    4. شطف كل جيدا مع لا يقل عن 4 مل من DMEM / F12 لكل 1 مل من الانزيمات الهاضمة وجمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
    5. الطرد المركزي تعليق خلية في 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. نضح لإزالة طاف وإضافة 400 ميكرولتر من المتوسطة صيانة HESC تستكمل مع ROCK المانع (ROCKi) لاعادة تعليق الخلايا. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا 3 مرات بلطف لكسر كتل داخل الخلايا واحدة.
    7. مزيج واحد كذلك التعليق الخلية وتمييع 10 ميكرولتر من عينات الخلايا في 190 ميكرولتر من DMEM / F12 (01:20 تمييع). استخدام hemocytomeثالثا لتحديد كثافة الخلايا في تعليق خلية الأسهم.
    8. حساب كثافة الخلية البذر اللازمة لاستنسل معين.
      ملاحظة: على سبيل المثال، قمنا تجريبيا كثافة الخلية البذر للحصول على أحادي الطبقة متموجة من الخلايا وحيدة هي حوالي 4444 خلية / ملم 2. وبالتالي، فإن الاستنسل بمساحة 450 مم 2 وحجم البذر من 400 ميكرولتر تتطلب تعليق الخلية لتكون في مناطق ذات كثافة من 2 مليون خلية / 400 ميكرولتر.
    9. تمييع تعليق خلية الأسهم إلى كثافة بذر المطلوبة (راجع الخطوة 3.3.8 ملاحظة) مع مستنبت HESC تستكمل مع ROCKi.
    10. إضافة حجم معين من تعليق الخلية التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا في كل الاستنسل وترك طبق بيتري دون عائق في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا ليستقر.
    11. نقل طبق بيتري في الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح لمرفق الخلية. العناية للحفاظ على مستوى طبق بتري خلالنقل عملية بحيث تبقى الخلايا كما أحادي الطبقة في الاستنسل.
  4. إزالة الاستنسل والتخميل من الركيزة unpatterned
    1. دراسة طبق بيتري تحت المجهر لمعرفة ما اذا كان يتم إرفاق الخلايا بشكل صحيح على الركيزة الأساسية.
    2. نضح بعيدا تعليق خلية من الاستنسل.
    3. إضافة 2 مل / طبق من 0.5٪ ثقافة الخلية متوافق السطحي غير الأيونية في DMEM / F12 إلى المنطقة المحيطة الاستنسل.
    4. استخدام زوج من ملقط تعقيمها لتقشر بلطف الاستنسل. دوامة الحل السطحي غير الأيونية حول ما هو مقشر الاستنسل قبالة لمنع الخلايا من الجفاف. بصريا مراقبة خلايا micropatterned في طبق بيتري.
    5. احتضان خلايا micropatterned في 0.5٪ غير الأيونية حل السطحي-DMEM / F12 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. نضح بعيدا غير الأيونية بالسطح-DMEM / F12 الحل. يغسل 3 مرات مع 2 مل / طبق من DMEM / F12.
    7. إضافة 2 مل / طبق من HESCمتوسطة صيانة تستكمل مع ROCKi واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    8. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، نضح HESC المتوسطة صيانة تستكمل مع ROCKi، ويغسل مرة واحدة مع DMEM / F12 وحمل mesoendoderm التمايز بإضافة 2 مل / طبق من متوسطة التمايز تستكمل مع 100 نانوغرام / مل Activin، 25 نانوغرام / مل BMP4 و 10 نانوغرام / FGF2 مل .
    9. تقييم micropatterns باستخدام النقيض من المرحلة التصوير وحساب متوسط ​​ملامح كثافة براتشيوري (T) لكل نمط كما هو موضح سابقا 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الورقة، ونحن تصف تصنيع استنسل خلية باستخدام الليزر القاطع لتوليد 1000 ميكرون الميزات. وتألفت الاستنسل من 2 أجزاء: ورقة بالستينسيل رقيقة (حوالي 100-200 ميكرون سميكة) تحتوي على micropattern من خلال الثقوب، وطوقا PDMS لاحتواء حل ECM طلاء أو تعليق خلية. هنا، تم استخدام 127 ميكرون و 2 مم صحائف PDMS المتاحة تجاريا باسم ورقة بالستينسيل وحشية على التوالي. طرق أخرى لإعداد ورقة PDMS من سماكة يمكن السيطرة عليها، مثل تدور طلاء، ويمكن أيضا أن تستخدم لتصنيع الأجزاء. ارتبطت العنصرين معا باستخدام السائل غير مخمر PDMS prepolymer-crosslinker خليط كمادة لاصقة أو البلازما الترابط، ويخبز في 60 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة (الشكل 1).

وقد تم اختيار المواد لورقة بالستينسيل بناء على اختيار خلية ثقافة الصورةubstrate. عند استخدام التقليدية البوليسترين زراعة الأنسجة (برنامج التعاون الفني) والركيزة ثقافة، الإستنسل PDMS يمكن استخدامها منذ امتثال ورقة بالستينسيل PDMS ستشكل ختم جيدة مع برنامج التعاون الفني جامدة (E ~ 3 جيد جدا) (الشكل 2A). في تصاميم تجريبية حيث أحد يرغب في تحقيق التنوع المكاني من مصير الخلايا الجذعية على ليونة ركائز ثقافة الخلية، مثل PDMS ركائز المرنة مع مجموعة صلابة الانضباطي من 5 كيلو باسكال إلى 2 ميجا باسكال 30، يمكن استخدام المواد بالستينسيل أكثر صرامة. وكمثال على ذلك، أثبتنا استخدام البولي اثيلين البولي (PET) الاستنسل (E ~ 2 جيد جدا) لتوليد 1 مم micropatterned المستعمرات hPSC على ليونة PDMS الركيزة وجود تصلب ~ 5 كيلو باسكال (الشكل 2B). كانت ملفقة الاستنسل PET من قبل الإلتصاق طوقا PDMS على ورقة بالستينسيل مصنوعة من الأفلام PET المتاحة تجاريا (الشكل 2B، أقحم). ونلاحظ أن تتطلب وقتا مرفق الخلية خلال micropatterningوكانت عملية أطول (~ 3 ساعة) على الركيزة PDMS ليونة من صلابة ~ 5 كيلو باسكال بالمقارنة مع ركائز برامج التعاون الفني التقليدية.

نحن تستخدم الاستنسل micropatterned المستعمرات HESC لإثبات أن التنوع المكاني في خلية التصاق القوى الميكانيكية بوساطة يمكن نمط mesoendoderm في وقت مبكر التمايز. لقد أظهرنا سابقا أن H9 hESCs في محيط مستعمرة شهدت التصاقات إنتغرين أعلى من الخلايا في الداخل مستعمرة، مما أدى إلى تمايز على التفضيلي إلى براتشيوري (T) خلايا mesoendoderm -positive عندما الناجم مع Activin، BMP4 وFGF2 31 (الشكل 3A ). عندما تم نمط الخلايا في هندستها مختلفة (دائرة، مربع، مستطيل وقوس نصف دائري) في منطقة مستعمرة ثابتة، تباين الهندسي في زوايا المربعات والمستطيلات، وتقوسات محدبة أدى إلى تركيز المحلي للقوات الجر بوساطة إنتغرين ونتج عن ذلك زيادة mesoendoderm التمايز 32،33. في الواقع، من خلال رسم الخرائط كثافة تي التعبير في مواقع مختلفة داخل مستعمرة واحدة، وجدنا أن حجم تحريض mesoendoderm كان أعلى في زوايا حادة من المستعمرات مربع ومستطيل (الشكل 3B) وفي تقوسات محدبة من قوس نصف دائري (الشكل . 3C)، وهو ما يعادل إلى مناطق التوتر بوساطة إنتغرين عالية ذكرت في الهندسة متباين الخواص 32،33. لذلك، micropatterning يمكن استخدامها لتعديل التوزيع المكاني للالتصاق الخلية القوى الميكانيكية بوساطة داخل مستعمرة hPSC سليمة كوسيلة للتحكم في عملية التمايز التي تلت ذلك.

شكل 1
الشكل 1. جيل من PDMS الاستنسل لmicropatterning. (A) تخطيطي تمثل خطوات حاسمة في تصنيع الاستنسل. وكانت ورقة 127 ميكرون PDMS سميكة LAقطع سر لإنتاج أنماط تصميم، و 2 مم آخر ورقة PDMS سميكة تم قطع الليزر لإنتاج حشية. ارتبطت هذه المكونات معا مع PDMS غير مخمر لتجميع الاستنسل. (ب) الصور تظهر تجميع المكونات لتشكيل الاستنسل PDMS مع التعميم 1 ملم من خلال الثقوب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. المستعمرات Micropatterned HESC (1000 ميكرون الدوائر) على ركائز ثقافة مختلفة. صور مجهرية من HESC مستعمرة micropattern مباشرة بعد إزالة (A) PDMS الإستنسل (أقحم) المستخدمة لتوليد micropatterns HESC على ركائز قوية، على سبيل المثال، برامج التعاون الفني من صلابة ~ 2 جيغا، و (ب) الإستنسل PET (أقحم) المستخدمة لتوليد micropatterns على ركائز ليونة، على سبيل المثال، PDMS من صلابة ~ 5 كيلو باسكال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تأثير micropatterns HESC من الأشكال الهندسية المختلفة على mesoendoderm التمايز 8 بهم. (A) micropatterns HESC من أشكال هندسية مختلفة ولكن تم إنشاء منطقة مستعمرة نفسها باستخدام PDMS الإستنسل. صور المرحلة (أعلى لوحة) وخرائط شدة تي التعبير (اللوحة السفلية) بعد 24 ساعة من التمايز mesoendoderm. (ب) لمحات من متوسط ​​تي شدة (على طول الخطوط المنقطة البيضاء في الفقرة (أ)) في مستعمرات دائرية متساوي القياس أو مربع anisometric والمستعمرات مستطيلة . وقال إن جميع المستعمرات نفس المنطقة السابقة باستثناء النقل الدائرة 50٪، والذي كان نصف مساحة مستعمرة. (C) لمحات من متوسط ​​تي كثافة من مقعرة أو محدبة الحواف إلى الداخل مستعمرة في شكل قوس نصف دائري، كما هو مبين من قبل الخطوط المنقطة البيضاء في الفقرة (أ). كل ملف كثافة في (قبل الميلاد) في المتوسط ​​16 لمحات كثافة تم الحصول عليها من 4 مستعمرات. يتم إعادة طبع الصور بإذن من توه وآخرون. آل، 8. مقياس شريط = 200 ميكرون وRFU هو وحدة مضان النسبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
ويسلط الضوء على الشكل 4. التمثيل التخطيطي لسير العمل لmicropattern المستعمرات HESC ولحث على تمايز. الخطوات الرئيسية للجيل ناجح من micropatterns HESC في مربعات رمادية.كوم / ملفات / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصنيع الإستنسل micropatterning

يوفر micropatterning الاستنسل الأسلوب الأمثل لتوليد micropatterns hPSC للتحقيق بوساطة المتخصصة التمايز الزخرفة. إن الميزة الأساسية لتنميط الاستنسل على تقنيات micropatterning أخرى، مثل microcontact الطباعة وphotopatterning، هو أنه لا يتطلب تعديل السطح ويمكن تنفيذها على ركائز برامج التعاون الفني التقليدية. لذلك، وسائل الإعلام ثقافة الأمثل والطلاء ECM لخطوط hPSC مختلفة يمكن نقلها بسهولة إلى مرسام micropatterning.

وهناك عدد من الخطوات الرئيسية خلال تلفيق الاستنسل الخلايا التي تساهم في توليد micropatterns جيد. الاخلاص استنساخ هندستها صممت في micropatterns hPSC تعتمد على الجودة والاتساق من تلفيق من خلال ثقب في ورقة بالستينسيل. لدراسات شملت micropat متعددة الخلاياخطاف البحر من> 1000 ميكرون، ومن خلال ثقوب يمكن أن تكون ملفقة مباشرة بواسطة القطع بالليزر على ورقة PDMS محمل مسبقا. حل القطع بالليزر تعتمد على حجم البقعة من شعاع الليزر ودقة المرحلة الميكانيكية السيطرة على مسار شعاع الليزر. لقاطعي CO 2 الليزر التقليدية، وجدنا أنه يمكن أن تنتج ملامح دائرية أو منحنية مع الإخلاص جيدة ولكن هندستها مع زوايا حادة لا (على سبيل المثال، مربع). في التطبيقات حيث المطلوب الميزات الصغيرة أو حادة، ومن خلال ثقوب في الورقة بالستينسيل يمكن أن تكون ملفقة من قبل صب PDMS على قالب السيليكون microfabricated تحتوي على نقوش من micropatterns 28. التحدي المتمثل في طريقة صب لإنتاج حجم الصغيرة من خلال ثقوب في ورقة PDMS رقيقة مع أي PDMS المتبقية خلال النقوش قالب السيليكون. وقد وضعت عدة استراتيجيات لمعالجة هذه المشكلة كما وصفها لي وآخرون. آل 28

أثناء كماsembly من ورقة بالستينسيل وحشية لإنتاج الاستنسل خلية، ينبغي للمرء التأكد من أن ورقة بالستينسيل مسطحة وخالية من الغبار أثناء عملية الربط لمنع التسرب من الاستنسل. التواء من ورقة بالستينسيل خلال عملية الربط قد تؤثر سلبا على الختم من الاستنسل إلى الركيزة ثقافة، مما تسبب في ECM وخلية حلول للتسرب من micropattern من خلال الثقوب. يجب تعقيم الاستنسل قبل التعقيم (120 درجة مئوية و 30 دقيقة)، ويتم تجفيفه جيدا في الفرن للتأكد من أنه يمكن تشكيل ختم جيدة مع الركيزة الثقافة.

عامل آخر مهم هو اختيار المواد ورقة بالستينسيل. الاستنسل PDMS مثالية لhPSCs micropatterning على ركائز ثقافة جامدة، مثل برامج التعاون الفني مع تصلب ~ 2 جيغا. ومع ذلك، إذا كان أحد يرغب في micropattern hPSCs على ركائز ليونة، مثل على ركائز PDMS تستخدم عادة لضبط خلية الركيزة صلابة 34، والامتثال لPDMSورقة بالستينسيل تجعل من الصعب تقشر الاستنسل بعد عملية الخلية البذر، وبالتالي تدمير micropatterns hPSC. في هذه الحالة، واختيار المواد لورقة بالستينسيل الاستنسل يجب اختيار النوع الذي يمكن شكل خاتم مع الركيزة ثقافة ولكن يمكن خلع بكل سهولة.

micropatterns توليد hPSC

وقد تم تحسين بروتوكول لmicropatterning H9 hESCs على ركائز برامج التعاون الفني باستخدام الاستنسل PDMS المعروضة هنا لتحقيق مستعمرة متموجة مع بقاء الخلية جيدة والإخلاص الزخرفة. ومن الضروري أن hPSCs تشكل خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات المناسبة داخل الحبس المكاني للهندسة معينة يحددها micropatterns بحيث يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية تأثير العوامل التي تعتمد على هندسة مصائر التمايز. لقد حددنا عدد قليل من الخطوات الحاسمة لتوليد بنجاح micropatterns hPSC (الشكل 4) وبعد مناقشتها على النحو التالي.

أولا، نوعية الثقافة hPSC المسائل. ومن المهم أن حصاد المستعمرات hPSC في التقاء 70-80٪، مع غالبية المستعمرات تظهر غير متمايز hPSC التشكل أثناء إزالة المناطق المتباينة. الإفراط في متموجة تسبب عادة الثقافات hPSC التمايز عفوية، وإذا لم يتم إزالة المناطق المتباينة قبل البذر الخلايا، وخلايا متباينة تعطيل تشكيل نمط التمايز الطبيعي.

ثانيا، عندما حصاد المستعمرات hPSC إلى تعليق خلية واحدة، وتجنب الإفراط في العلاج مع الانزيمات الهاضمة أمر بالغ الأهمية لأن هذا غالبا ما يؤدي إلى موت الخلايا بعد الحضانة بين عشية وضحاها حتى لو الخلايا يمكن أن نعلق في البداية. وجدنا أن 8 دقائق من العلاج الأنزيمية هو الأمثل للخط H9 HESC مثقف في المختبر. على الرغم من أننا نوصي بأن الوقت العلاج بالخلايا مفرزة يجب أن يكون الأمثل بشكل منفصل عن خطوط مختلفة من الخلايا.

الصورة = "jove_content"> ثالثا، كثافة الخلية البذر تلعب دورا حاسما في توليد أحادي الطبقة متموجة من الخلايا مع خلية خلية وخلية مصفوفة التصاقات محددة. يتم احتساب كثافة البذر الخلية على أساس متوسط ​​حجم الخلية، مساحة الاستنسل وخلية البذر حجم، ثم الأمثل تجريبيا. وانخفاض كثافة الخلية البذر غالبا ما يؤدي إلى ضعف الإخلاص الزخرفة. نظرا لطبيعتها الظهارية، hPSCs لديهم ميل قوي لتجميع وتنمو المستعمرات. لذلك، عندما تكون هناك خلايا كافية داخل micropattern، فإن الخلايا المرفقة تجميع مما أدى إلى "بقع صلعاء" داخل micropattern. على العكس من ذلك، فإن خلية كثافة عالية أكثر من اللازم البذر يسبب الإفراط في الازدحام من الخلايا في micropatterns. هذه النتائج في طبقات خلايا متعددة يجري تشكيلها، خصوصا في محيط micropattern. في هذه المناطق، التصاق الخلية القوى الميكانيكية بوساطة لم تعد تعرف بمجرد في الطائرة س ص التي micropatterns. وبالتالي، فإن الناتجة تختلفمصائر entiation أكثر عشوائية والتي لا يمكن ربطها العوامل الميكانيكية عن طريق التضمين في micropattern الخلية.

وأخيرا، هناك حاجة إلى إيقاف فاعلية الركيزة المحيطة micropatterns hPSC مع جزيئات غير خلية لاصقة من أجل كبح انتشارها أو تمييز الخلايا داخل micropattern. وهذا أمر ضروري للحفاظ على الإخلاص للmicropattern hPSC، وفي المقابل، فإن الانحدار البيئي والكيمياء الحيوية والميكانيكية لأنماط التمايز لتطوير. زراعة الخلايا متوافقة السطحي غير الأيونية، مثل Pluronic F-127 يمكن استخدامها كعامل تخميل. عندما تخميل مع السطحي، يجب أن يكون الأمثل للوقت العلاج والتركيز بسبب السمية الخلوية السطحي وعند التعرض الطويل. كما ناقشنا أعلاه، ينص البروتوكول قدم التوجيهي المفصل لmicropattern hPSCs باستخدام الاستنسل PDMS، ولكن يتم تشجيع الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول، وخاصة بالنسبة للخطوات الهامة المذكورة أعلاه، إلى suتوليد ccessfully micropatterns hPSC.

واحد الحد من micropatterning الاستنسل هو أنه أكثر ملاءمة لتوليد micropatterns أكبر تتراوح بين 100-1،500 ميكرون. لتوليد الميزات الصغيرة جدا مخصصة للالزخرفة خلية واحدة، وتصنيع صفائح بالستينسيل مع <50 ميكرومتر من خلال الثقوب هي صعبة للغاية كما ذكر سابقا. وبالتالي، فإننا نتوقع أن استخدام الاستنسل hPSCs micropatterned مناسب تماما للتحقيق في تشكيل نمط النسيج متعددة الخلايا خلال العمليات التنموية المختلفة (على سبيل المثال، للطي الظهارة العصبية أو الزخرفة الأديم الباطن).

باستخدام micropatterning لحصر هندسي يبلغ عدد سكانها hPSC، يمكننا إنشاء خلية التصاق بوساطة الميكانيكية 10 ونظير الصماوي التدرجات إشارات 6 التحكم في فهم التنظيم المكاني للمصائر التمايز الناتجة. هذه النماذج hPSC micropatterned مع التمايز نظمت مكانيايمكن بدورها أن تترجم ن إلى المرض أو فحص مشوه نماذج بشرية محددة 11 للعيوب الخلقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من قبل جامعة سنغافورة الوطنية بدء التشغيل منحة (R-397-000-192-133) وصندوق الفجوة ETPL (R-397-000-198-592). ع هو عالم أبحاث جامعة سنغافورة الوطنية. سيكون الكتاب أود أن أشكر الدكتور Jiangwa شينغ لها الدعم الفني على micropatterning الخلية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 2 mm thick PDMS sheet Specialty Silicone Products Inc., USA SSPM823-.005 Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet Specialty Silicone Products Inc., USA SSPM823-.040 Used to form stencil 
60 mm Petri dish Nunc Nunclon Delta 150326 Substrate for micropatterning
Accutase Accutase, Merck Millipore, Singapore SCR005 Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin   R&D Systems, Singapore 338-AC-010 Growth factor for H9 differentiation
BMP4  R&D Systems, Singapore 338-BP-010 Growth factor for H9 differentiation
Plasma system  Femto Science, Korea CUTE-MP For plasma oxidation of stencil
Dispase StemCell™ Technologies, Singapore 7923 Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12 GIBCO, USA 11330032 Basal medium for H9 cells
FGF2 R&D Systems, Singapore 233–FB–025 Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line WiCell Research Institute, Inc., USA WA09 Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix Matrigel, BD Biosciences, Singapore 354277 Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope Leica Microsystems, Singapore DMi1 For capturing bright-field images
Laser cutter Epilog Helix 24 Laser System Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium  StemCell™ Technologies, Singapore 5850 Maintainence medium for H9 cells
PDMS  SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA 3097358-1004 Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632 Calbiochem, Merck Millipore, Singapore 688000 Maintains H9 cells as single cells 
STEMdiff™ APEL™ medium  StemCell™ Technologies, Singapore 5210 Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film SureMark Singapore SQ-6633 Used to form stencil 
Cell culture compatible non-ionic surfactant Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore P2443 Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 112، الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان، micropatterning الخلية، الاستنسل، مصير التمايز، والتنظيم المكاني، الزخرفة الأنسجة، والتطور الجنيني
الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C.… More

Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates. J. Vis. Exp. (112), e54097, doi:10.3791/54097 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter