Summary
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.
Introduction
Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), sont largement exploités dans la médecine régénérative ainsi que la modélisation expérimentale de l'organogenèse normaux et malades en raison de leur potentiel de différenciation en lignées cellulaires de tous trois couches de germe 1,2. Les destins de différenciation des hPSCs sont très sensibles à des facteurs environnementaux locaux qui peuvent moduler les processus de mécanotransduction autocrine ou de signalisation 1 paracrines ainsi que médiées par des indices physiques 3-5. Cellule micromodelage englobe un ensemble de techniques qui ont été développées pour organiser spatialement la géométrie et l' emplacement d'une population de cellules comme un moyen de contrôler le microenvironnement cellulaire local, tels que les interactions cellule-cellule 6 et interactions cellule-matrice 3. Dans le contexte de hPSCs, micromodelage cellulaire a été utilisé pour acquérir des connaissances importantes sur la façon dont niche dépendentsignalisation autocrine ent modulant CSEh décisions pluripotence-différenciation 7 et de l' organisation dans des schémas de différenciation embryonnaires 6. 2D et 3D hPSCs microélectrodes ont été utilisées pour contrôler la taille des colonies multicellulaires de motifs, ce qui a influencé les décisions de différenciation dans les trois couches de germe 8,9. Nous avons employé micropatterns HPSC multicellulaires pour moduler l'ampleur de la cellule-cellule et les interactions cellule-matrice au sein d' une colonie HPSC pour sonder la façon intégrine E-cadhérine diaphotie peut donner lieu à devenir cellulaire hétérogène 10. Les démonstrations des rapports ci - dessus ouvrent de nouvelles avenues vers l'application de micropatterns multicellulaires de hPSCs comme modèles expérimentaux pour le dépistage de la toxicité des médicaments pour les maladies de développement 11, pour étudier l'effet des facteurs de croissance et des hormones pendant les tissus ou le développement des organes, et à démêler la formation de des motifs de tissus.
Une myriade de micropatter cellulairetechniques ning ont été développés comme examinés par Falconnet et. al. , 12 mais seulement une poignée, comme les micro-impression par contact 7,8,13, la culture de micropuits 14,15, photopatterning 6 et microstencils 16 ont été mises en œuvre avec succès avec hPSCs. Le défi avec hPSCs de micromodelage réside dans leur vulnérabilité et une exigence stricte des matrices spécifiques extracellulaires (ECM) et des conditions de croissance pour la fixation et la survie cellulaire. Pour les modèles 2D HPSC, l' impression micro-contact est l' une des méthodes les plus courantes pour générer micropatterns HPSC sur culture de tissus et de verre substrats 13. La méthode peut être utilisée pour modèle ECM commun utilisé dans la culture HPSC, y compris la laminine et la membrane basale matrices, comme Matrigel. Cependant, elle nécessite généralement un procédé de revêtement en deux étapes aidé par Poly-D-Lysine, et a besoin de conditions atmosphériques et d' humidité inertes spécifiques pour rendre micropatterns ECM stables pour hPSCs pour fixer sur 6,13. La première considération de chaque méthode de micromodelage est de savoir si le régime de modification de surface peut générer des motifs d'ECM HPSC-adhésives à la résolution géométrique souhaitée, tout en minimisant l'attachement des cellules non spécifiques aux zones environnantes.
Nous rapportons ici l'utilisation du pochoir micromodelage comme une méthode simple pour générer micropatterns HPSC sans étapes de modification de surface supplémentaires avant la génération de modèles ECM adhésifs pour hPSCs pour fixer sur. Le pochoir de cellules se compose d'une membrane mince, par exemple, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) en feuilles, avec micron au millimètre taille des trous traversants fermés sur un substrat de culture de cellules pour contenir physiquement les revêtements de l' ECM et hPSCs ensuite ensemencés. Pochoir comme motif fonctionne en empêchant physiquement l'endroit où HPSC peut accéder et fixer directement sur le substrat enduit sous-jacent ECM, cette méthode est compatible avec différents substrats qui peuvent supporter des cultures HPSC. Les seuls requirement est que le choix du matériau de pochoir peut former un joint réversible avec le substrat. Ces substrats comprennent le polystyrène classique de culture tissulaire (EPTC) 17, des substrats conjugués ligand 18, ainsi que des substrats élastomères avec une rigidité réglable (par ex., Le PDMS) 19. Cette méthode permet également le revêtement d'ECM différents, tels que la vitronectine (ou protéine VTN), la laminine et les matrices de la membrane basale (par exemple Matrigel et Geltrax) pour permettre la fixation et la différenciation des hPSCs appropriée. configurations ECM-substrat Par conséquent, nous pouvons transférer optimisés pour une ligne HPSC spécifique au pochoir micromodelage pour optimiser la cellule-matrice adhérence, la survie et la différenciation. Récemment, une méthode similaire a également été signalé pour diriger la différenciation hépatique par CSEh micromodelage utilisant le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) des réseaux de micro-pochoirs 16.
pochoirs cellulaires peuvent être fabriqués à partir de matériaux différents, y compris rempliesals 20,21, le poly (p-xylylène) les polymères 22,23, PMMA 16 et le plus souvent, le PDMS 24-28. Le silicium et le poly (p-xylylène) polymères pochoirs nécessitent la gravure directe des trous traversants avec des équipements spécialisés 20-23, ce qui limite leur accessibilité aux utilisateurs biologiques. PDMS pochoirs peuvent être fabriqués par différentes méthodes en fonction de la taille de la fonction requise, ce qui est généralement compris entre 3 um à 2000 um 11,26-29. Si de petites caractéristiques sont souhaitées, de minces feuilles de pochoir peuvent être produites par moulage à la presse PDMS de pré-polymère sur un gabarit de silicium micro - usiné comportant des reliefs de micromotifs 28. Pour connaître les caractéristiques> 1000 um, un cutter laser CO 2 offre une méthode simple et peu coûteux de réduire directement les motifs sur une feuille PDMS pré-coulé lors de pochoir fabrication. La recyclabilité des pochoirs PDMS rend également rentable de mener une série d'expériences avec une consistance suffisante.
10 hétérogénéité.
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Protocol
NOTE: Ce protocole décrit la fabrication de PDMS pochoir avec 1000 um modèles par découpe au laser et micromodelage de la ligne de CSEh, H9 utilisant le pochoir PDMS.
1. Conception et fabrication de PDMS Stencil pour micromodelage
- Concevoir la feuille de pochoir avec trous traversants de la géométrie désirée et la taille (par exemple, 1000 pm cercles) et le joint de pochoir à l' aide du logiciel conception assistée par ordinateur 10.
- Laser-coupé la feuille de pochoir et joint sur 120-150 um et 2 mm d' épaisseur polydiméthylsiloxane (PDMS) feuilles en utilisant respectivement un laser CO 2-coupe 10.
- Bond du joint PDMS avec la feuille stencil PDMS utilisant PDMS liquides non durcies et cuire au four à 60 ° C pendant 3-4 heures pour obtenir le pochoir de PDMS pour micromodelage.
- Stériliser le pochoir PDMS par autoclavage à 120 ° C pendant 30 min et séchage dans un four avant l'utilisation.
2. CSEh principaltenance
- Culture des lignées de CSEh dans un milieu d'entretien sans alimentation-sur 1 × matrice revêtu membrane basale des plaques de culture cellulaire de CSEh qualifié à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Passage des hESC quand ils sont d'environ 70% de confluence par 3 minutes d'incubation à 37 ° C avec le traitement et la dispase dissociant mécaniquement les colonies de hESC en touffes 100-200 um. Plate les touffes CSEh à une densité de 30-50 touffes par 9,6 cm 2 de surface de croissance sur la membrane basale matrice revêtue de culture tissulaire en polystyrène au rapport 1: 6 de fendage.
3. Stencil micromodelage des embryons humains Cellules souches
- Préparation avant la cellule de motif
- Sceller un pochoir de PDMS sur un plat de 60 mm de Pétri en distribuant 700 pi 70% d'éthanol de qualité analytique dans l'eau ultrapure dans la boîte de Pétri et placer le pochoir sur le dessus.
- Placez la boîte de Pétri à l'intérieur de la biosécurité armoire pendant la nuit pour laisser til éthanol sec.
- Vérifier aucune bulle existe sous le pochoir pour faire en sorte que le pochoir forme une bonne étanchéité avec la boîte de Pétri. Ceci permet d'éviter les fuites de solution de revêtement ECM. Sceller la boîte de Pétri et de stocker dans des conditions stériles jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'ensemencement des cellules.
- Préparer des aliquotes de la matrice de la membrane basale CSEh qualifié selon le certificat d'analyse. Veiller à ce que chaque aliquote rendements 1 x solution de CSEh qualifié membrane basale matrice lorsqu'il est dilué dans 25 ml de milieu de Eagle modifié Dulbecco: mélange nutritif F-12 (DMEM / F12) selon la fiche produit du fabricant.
- Préparer la solution de revêtement de l'ECM en ajoutant une aliquote de la matrice de la membrane basale CSEh qualifié dans 16,7 ml de DMEM / F12 pour faire 1,5 x solution de matrice membrane basale CSEh-qualifié. Gardez toute la solution de revêtement ECM sur la glace pour empêcher la gélification.
- Supplément milieu d'entretien de CSEh avec un inhibiteur de ROCK uM 10 (Y27632).
- Traiter la boîte de Pétri avec 100 WO 2 plasma pendant 90 secondes. Pour assurer la stérilité, seulement ouvrir le couvercle de la boîte de Pétri à l'intérieur de la chambre à plasma avant le traitement au plasma, et rapidement la couverture arrière de la boîte de Petri après la fin du traitement. Ceci facilite le mouillage de surface et empêche la formation de bulles d'air dans le micro motif de trous traversants au cours de l'addition d'une solution de revêtement ECM.
- Ajouter 450 ul de 1,5 x solution de matrice de la membrane basale CSEh-qualifié pour couvrir l'ensemble du pochoir. Sceller la boîte de Petri avec un film auto-soudable, par exemple du Parafilm, afin d'empêcher la solution de sécher, et incuber pendant 5 heures à 37 ° C avant utilisation.
- CSEh Semis sur le substrat stenciled
- Examiner les colonies de CSEh en plaque de 6 puits pour identifier les zones de cellules différenciées montrant la perte de la morphologie des CSEh typique (par exemple, la perte d'arrondi, bien Packed morphologie épithéliale, haut noyau rapport / cytoplasme avec des nucléoles proéminents). Retirer les régions différenciées en utilisant un aspirateur à vide.
- Laver deux fois avec 2 ml de DMEM / F12 par puits.
- Ajouter 1 ml d'enzymes digestives, telles que Accutase par puits d'une plaque à 6 puits et incuber à 37 ° C pendant 8 min. Appuyez doucement la plaque pour détacher toutes les colonies du substrat.
- Rincer chaque puits avec au moins 4 ml de DMEM / F12 par 1 ml d'enzymes digestives et récupérer la suspension cellulaire dans 15 ml de tube conique.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Aspirer pour éliminer le surnageant et ajouter 400 ul de milieu d'entretien de CSEh complété avec un inhibiteur de ROCK (Rocki) pour remettre en suspension les cellules. Introduire à la pipette la suspension de cellules vers le haut et vers le bas 3 fois doucement pour casser des touffes dans des cellules individuelles.
- Mélanger le seul puits de suspension de cellules et on dilue 10 pi d'échantillons de cellules dans 190 ul de DMEM / F12 (dilution 1:20). Utilisez un hemocytometer pour déterminer la densité des cellules dans la suspension cellulaire stock.
- Calculer la densité d'ensemencement des cellules requises pour un pochoir donné.
REMARQUE: par exemple, on a déterminé expérimentalement la densité d'ensemencement des cellules pour obtenir une monocouche confluente de cellules individuelles est d' environ 4.444 cellules / mm 2. Ainsi, un gabarit d'une surface de 450 mm 2 et du volume d'ensemencement de 400 ul nécessitera une suspension cellulaire à une densité de 2 millions de cellules / 400 ul. - Diluer la suspension cellulaire stock à la densité ensemencement nécessaire (voir étape 3.3.8 NOTE) avec un milieu de culture de CSEh complété par Rocki.
- Ajouter un volume désigné d'une suspension cellulaire contenant le nombre de cellules dans chaque pochoir et laisser la boîte de Petri non perturbé dans la hotte pendant 5 min à température ambiante pour permettre aux cellules de se déposer.
- Transférer la boîte de Petri dans l'incubateur et incuber pendant 1 heure pour permettre la fixation des cellules. Prenez soin de garder le niveau de boîte de Pétri pendant laProcédé transfert de telle sorte que les cellules restent en monocouche dans le pochoir.
- Retrait Stencil et de passivation du substrat sans motif
- Examinez la boîte de Pétri sous un microscope pour vérifier si les cellules sont correctement fixés sur le substrat sous-jacent.
- Aspirer à une distance de la suspension de cellules à partir du gabarit.
- Ajouter 2 ml / boîte de culture cellulaire de 0,5% de tensioactif non ionique compatible DMEM / F12 à la zone entourant le pochoir.
- Utilisez une paire de pinces autoclavées à peler délicatement le pochoir. Tourbillonner la solution d'agent tensio-actif non ionique dans le pochoir est enlevée pour empêcher les cellules de se dessécher. Visuellement observer les cellules microélectrodes dans la boîte de Pétri.
- Incuber les cellules microélectrodes en non-ionique solution tensio-DMEM / F12 0,5% pendant 10 min à 37 ° C.
- Aspirer loin la solution non-ionique / F12 surfactant-DMEM. Laver 3 fois avec 2 ml / plat de DMEM / F12.
- Ajouter 2 ml / plat de CSEhun milieu d'entretien complété par Rocki et incuber à 37 ° C pendant une nuit.
- Après incubation pendant une nuit, le milieu d'entretien aspirât hESC additionné de Rocki, laver une fois avec du DMEM / F12 et d'induire la différenciation des mesoendoderm par addition de 2 ml / boîte de milieu de différenciation supplémenté avec 100 ng / ml d'activine, 25 ng / ml de BMP4 et 10 ng / FGF2 ml .
- Évaluer micromotifs en utilisant l' imagerie par contraste de phase et calculer les profils d'intensité moyenne Brachyury (T) pour chaque motif 8 , comme décrit précédemment.
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Representative Results
Dans cet article, nous décrivons la fabrication d'un pochoir de cellule en utilisant un cutter laser pour générer 1000 um caractéristiques. Le pochoir est composé de 2 parties: une feuille de pochoir mince (environ 100-200 um d'épaisseur) contenant le Microdétail trous traversants, et un joint de PDMS pour contenir la solution de revêtement ECM ou d'une suspension cellulaire. Ici, 127 um et 2 mm d'épaisseur des feuilles PDMS disponibles dans le commerce ont été utilisés comme la feuille de stencil et le joint respectivement. D'autres procédés pour la préparation de feuilles de PDMS d'épaisseur contrôlable, comme spin-coating, peuvent également être utilisés pour fabriquer des pièces. Les deux composants ont été liés ensemble à l'aide du mélange prépolymère d'agent de réticulation liquide non durci PDMS comme le collage ou le plasma, et on les cuit à 60 ° C pendant 3-4 h (Fig. 1).
Le matériau pour la feuille de stencil a été sélectionné en fonction du choix de la culture cellulaire deubstrate. Lors de l' utilisation du polystyrène de culture tissulaire classique (TCPS) comme substrat de culture, pochoirs PDMS peuvent être utilisés puisque le respect de la feuille de stencil PDMS formera une bonne étanchéité à l'EPTC rigide (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). Dans les modèles expérimentaux où l' on souhaite étudier l' hétérogénéité spatiale du destin des cellules souches sur plus douces substrats de culture cellulaire, tels que PDMS élastomères substrats avec une gamme de rigidité accordable de 5 kPa à 2 MPa 30, les matériaux de pochoir plus rigides peuvent être utilisés. A titre d'exemple, nous avons démontré l'utilisation d'un polyéthylène téréphtalate (PET) stencil (E ~ 2 GPa) pour produire des colonies de 1 mm HPSC microélectrodes sur un substrat PDMS plus mou ayant une rigidité de ~ 5 kPa (Fig. 2B). Le pochoir PET a été fabriqué par collage d' un joint d'PDMS sur une feuille de stencil en films PET disponibles dans le commerce (Fig. 2B, encart). Nous notons que le temps de fixation cellulaire nécessaire au cours de la micromodelageprocessus a été plus longue (~ 3 h) sur le PDMS doux substrat de raideur ~ 5 kPa par rapport à des substrats EPTC classiques.
Nous avons utilisé stencil microélectrodes colonies de CSEh pour démontrer que l'hétérogénéité spatiale d'adhérence cellulaire à médiation forces mécaniques pourrait de différenciation mesoendoderm début du motif. Nous avons précédemment montré que H9 hESC à la périphérie de la colonie a connu plus élevées adhérences intégrine que les cellules à l'intérieur des colonies qui ont abouti à leur différenciation préférentielle dans Brachyury (T) , les cellules mesoendoderm -positif lorsque induite par l' activine, la BMP4 et FGF2 31 (Fig. 3A ). Lorsque les cellules ont été modelés dans des géométries différentes (cercle, carré, rectangle et arc semi-circulaire) dans une zone de colonie constante, anisotropie géométrique aux angles des carrés, des rectangles et des courbures convexes conduit à une concentration locale des forces de traction intégrine-médiation et a abouti à une augmentation mesoendla différenciation oderm 32,33. En effet, par cartographie d' intensité T d'expression à différents endroits au sein d' une colonie unique, on a trouvé que le degré de mesoendoderm induction était plus élevée dans les angles aigus de colonies carrées et rectangulaires (Fig. 3B) et à courbure convexe d'un arc semi-circulaire (fig . 3C), ce qui correspond à des régions de contraintes élevées rapportées intégrine à médiation dans une géométrie anisotrope 32,33. Par conséquent, micromodelage peut être utilisé pour moduler la répartition spatiale de l'adhésion cellulaire à médiation par des forces mécaniques à l'intérieur d'une colonie HPSC intacte en tant que moyen pour contrôler le processus de différenciation qui suit.
Figure 1. Génération de PDMS pochoir pour micromodelage. (A) Schéma représentant les étapes critiques dans la fabrication pochoir. Une feuille de 127 um d'épaisseur de PDMS était lacoupé ser pour produire les modèles conçus, et un autre de 2 mm d'épaisseur feuille de PDMS a été découpé au laser pour produire le joint. Ces deux éléments ont été liés ensemble avec PDMS non durcies pour assembler le pochoir. (B) Images montrant l' assemblage des composants pour former un pochoir de PDMS avec 1 mm circulaire à travers les trous. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. colonies microélectrodes CSEh (1000 um cercles) sur différents substrats de culture. Les images microscopiques de CSEh colonie Microdétail immédiatement après le retrait de (A) PDMS pochoirs (médaillon) utilisés pour générer micropatterns de CSEh sur des substrats rigides, par exemple, EPTC de raideur ~ 2 GPa, et (B) pochoirs PET (encart) Utilisé pour générer micropatterns sur des substrats plus doux, par exemple, PDMS de raideur ~ 5 kPa. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Effet de micropatterns CSEh de différentes formes géométriques sur leur différenciation mesoendoderm 8. (A) micropatterns hESC de différentes formes géométriques , mais même zone de la colonie ont été générés en utilisant PDMS pochoirs. Images de phase (panneau supérieur) et des cartes d'intensité de T expression (panneau inférieur) après 24 heures de la différenciation des mesoendoderm. (B) profils d'intensité de T moyenne ( le long des lignes pointillées blanches (A)) dans les colonies circulaires isométriques ou carré anisométrique et colonies rectangulaires . Toutes les colonies avaient la même zone ex cept le cercle 50%, ce qui était la moitié de la surface de la colonie. (C) , des profils d'intensité moyenne T de la partie concave ou les bords convexes vers l'intérieur de la colonie dans un arc semi-circulaire, comme indiqué par les lignes pointillées blanches (A). Chaque profil d'intensité (BC) est une moyenne des profils d'intensité 16 obtenu à partir de 4 colonies. Les images sont réimprimés avec la permission de Toh et. al., 8. Barre d' échelle = 200 pm et RFU est l' unité de fluorescence relative. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Représentation schématique du flux de travail Microdétail colonies de CSEh et induire la différenciation. Les étapes clés pour la production réussie de micropatterns CSEh sont mis en évidence dans des boîtes grises..com / fichiers / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Fabrication de pochoirs micromodelage
micromodelage Stencil fournit une méthode idéale pour générer micropatterns HPSC pour enquêter sur niche médiée différenciation patterning. L'avantage principal du pochoir formation de motifs par rapport aux autres techniques de micromodelage, telles que l'impression par microcontact et photopatterning, est qu'il ne nécessite pas de modification de la surface et peut être mis en oeuvre sur des substrats EPTC classiques. Par conséquent, les milieux de culture optimisés et les revêtements d'ECM pour différentes lignes HPSC peuvent être facilement transférés au pochoir micromodelage.
Il existe un certain nombre d'étapes clés lors de la fabrication du pochoir de cellules qui contribuent à la production de bons micropatterns. La fidélité de reproduction des géométries conçues dans les micropatterns HPSC dépend de la qualité et de la cohérence de la fabrication à travers-trou dans la feuille de pochoir. Pour les études impliquant micropat multicellulairesterne de> 1 000 pm, les trous traversants peuvent être directement fabriqués par découpe au laser sur une feuille PDMS pré-coulé. La résolution de la découpe au laser dépend de la taille du spot du faisceau laser et la précision de la platine mécanique contrôlant la trajectoire du faisceau laser. Pour coupe CO 2 laser classiques, nous avons trouvé qu'il peut produire des caractéristiques circulaires ou courbes avec une bonne fidélité mais pas géométries avec des angles vifs (par exemple., Carré). Dans les applications où de petites ou tranchants caractéristiques sont souhaitées, les trous traversants dans la feuille de stencil peut être fabriqué par moulage sur un modèle de PDMS de silicium micro - usiné comportant des reliefs de micromotifs 28. Le défi de la méthode de moulage est de produire des micro-taille à travers des trous dans PDMS feuilles minces sans PDMS résiduels sur les reliefs du modèle de silicium. Plusieurs stratégies ont été développées pour résoudre ce problème , comme décrit par Li et al. al. 28
Que lors de lasemblée de la feuille de stencil et le joint pour produire le pochoir cellulaire, on doit veiller à ce que la feuille de pochoir est plat et exempt de poussière pendant le processus de liaison afin d'éviter toute fuite du pochoir. Gauchissement de la feuille de stencil pendant le processus de liaison peut compromettre l'étanchéité du pochoir sur le substrat de culture, ce qui provoque des solutions ECM et de cellules de fuite à partir du micro-motif des trous traversants. Le pochoir doit être stérilisé à l'autoclave (120 ° C, 30 min) et sécher à fond dans un four pour veiller à ce qu'il peut former une bonne étanchéité avec le substrat de culture.
Un autre facteur important est le choix du matériau de feuille de stencil. Le pochoir PDMS est idéal pour micromodelage hPSCs sur des substrats rigides de culture, tels que l'EPTC avec une raideur de ~ 2 GPa. Cependant, si l' on veut Microdétail hPSCs sur des substrats tendres, tels que le PDMS substrats couramment utilisés pour la rigidité du substrat de la cellule mise au point 34, la conformité d'un PDMSfeuille de pochoir, il sera difficile de décoller le pochoir après le processus d'ensemencement des cellules, détruisant ainsi les micropatterns HPSC. Dans ce cas, le choix du matériau pour la feuille de stencil du pochoir doit être choisi de telle sorte qu'il puisse former un joint étanche avec le substrat de culture, mais peut être pelé facilement.
Micropatterns Generating HPSC
Le protocole de micromodelage H9 CSEh sur des substrats EPTC en utilisant un pochoir de PDMS présentée ici a été optimisée pour obtenir une colonie de confluentes avec une bonne viabilité des cellules et de motifs fidélité. Il est essentiel que les hPSCs forment des interactions cellule-cellule et cellule-matrice appropriées dans le confinement spatial d'une géométrie particulière définie par les micropatterns de telle sorte que l'on peut étudier comment les facteurs de géométrie dépendant influent sorts différenciation. Nous avons identifié quelques étapes essentielles pour générer avec succès micropatterns HPSC (Fig. 4)et ils sont décrits de la manière suivante.
Tout d'abord, la qualité de la culture HPSC compte. Il est important de récolter les colonies HPSC à 70-80% de confluence, avec la majorité des colonies présentant une morphologie indifférenciée HPSC tout en éliminant les zones différenciées. -Dessus des cultures confluentes HPSC provoquent habituellement une différenciation spontanée et si les zones différenciées ne sont pas éliminées avant l'ensemencement des cellules, les cellules différenciées perturbent la formation du motif de la différenciation normale.
Deuxièmement, lors de la récolte des colonies HPSC à la suspension cellulaire unique, en évitant un sur-traitement avec des enzymes digestives est critique parce que cela se traduit souvent par la mort cellulaire après une nuit d'incubation, même si les cellules peuvent se fixer d'abord. Nous avons constaté que 8 minutes de traitement enzymatique est optimale pour la ligne H9 CSEh cultivées dans notre laboratoire; bien que nous recommandons que le temps de traitement de détachement des cellules doit être optimisé séparément pour différentes lignées cellulaires.
Enfin, il existe un besoin pour passiver le substrat entourant les micropatterns HPSC avec des molécules d'adhérence cellulaire non dans le but de limiter la prolifération ou la différenciation des cellules à l'intérieur du micro-motif. Cela est essentiel pour maintenir la fidélité du motif fin HPSC, et à son tour, le gradient de l'environnement biochimique et mécanique pour des motifs de différenciation de se développer. Culture cellulaire tensio-actifs non ioniques compatibles, tels que Pluronic F-127 peuvent être utilisés comme agent de passivation. Quand passivant avec des agents tensioactifs, le temps de traitement et de concentration doivent être optimisées en raison de la cytotoxicité de l'agent tensio-actif à longue exposition. Comme nous l'avons vu plus haut, le protocole présenté fournit des directives détaillées à Microdétail hPSCs utilisant un pochoir de PDMS, mais l'optimisation de ce protocole, en particulier pour les étapes critiques ci-dessus, est encouragé à sugénérer ccessfully micropatterns HPSC.
Une limitation de pochoir micromodelage est qu'il est plus approprié pour générer des micromotifs plus grandes allant de 100-1,500 um. Pour générer de très petits éléments destinés à être motif d'une cellule unique, la fabrication de feuilles de marquage au pochoir avec des trous traversants <50 um est très difficile, comme mentionné précédemment. Par conséquent, nous nous attendons à ce que l'utilisation du pochoir hPSCs microélectrodes est bien adapté pour étudier multicellulaire formation de motif de tissu pendant les différents processus de développement (par exemple, pliage de neuroepithelium ou endoderme patterning).
En utilisant micromodelage pour confiner géométriquement une population de HPSC, nous pouvons établir d'adhésion cellulaire médiée mécaniques 10 et paracrine gradients de signalisation 6 pour contrôler et comprendre l'organisation spatiale des destins de différenciation résultants. Ces modèles HPSC microélectrodes avec differentiatio spatialement organisén peut à son tour être traduite dans des modèles de maladie ou de dépistage du tératogène humain spécifique 11 pour malformations congénitales.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par NUS Démarrez subvention (R-397-000-192-133) et le Fonds Gap LPTE (R-397-000-198-592). GS est un érudit NUS Research. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jiangwa Xing pour son soutien technique sur micromodelage cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
