Summary
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.
Introduction
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son ampliamente explotados en la medicina regenerativa, así como el modelado experimental de la organogénesis normal y enfermo debido a su potencial de diferenciación en linajes celulares de todos tres capas germinales 1,2. El destino de diferenciación de hPSCs son muy sensibles a factores ambientales locales que pueden modular procesos mechanotransduction autocrinos o paracrinos de señalización 1, así como mediadas por señales físicas 3-5. Micropatterning célula abarca un conjunto de técnicas que se han desarrollado para organizar espacialmente la geometría y la localización de una población de células como un medio para controlar el microambiente celular local, tales como las interacciones célula-célula 6 y de las interacciones célula-matriz 3. En el contexto de hPSCs, micropatterning celular se ha empleado para obtener una mejor aproximación a la forma depende de nichola señalización autocrina ent modula células madre decisiones pluripotencia de diferenciación-7 y organización en los primeros patrones de diferenciación de embriones 6. 2D y 3D hPSCs micropatterned se han utilizado para controlar el tamaño de las colonias de los patrones multicelulares, que a su vez influyeron en las decisiones de diferenciación en las tres capas germinales 8,9. Hemos empleado micropatrones HPSC multicelulares para modular el grado de célula-célula y las interacciones célula-matriz en una colonia de HPSC para investigar cómo la diafonía integrina-E-cadherina puede dar lugar a la heterogeneidad del destino celular 10. Las manifestaciones de los informes anteriores nuevas vías abiertas hacia la aplicación de micropatterns multicelulares de hPSCs como modelos experimentales para la detección de toxicidad de los medicamentos para enfermedades del desarrollo 11, para estudiar el efecto de los factores de crecimiento y hormonas durante el tejido o el desarrollo de órganos, y para desentrañar la formación de los patrones de tejido.
Una miríada de micropatter celulartécnicas Ning se han desarrollado como revisado por Falconnet et. al., 12 pero sólo un puñado, tales como micro-impresión de contacto 7,8,13, 14,15 cultura microplaca, photopatterning 6 y 16 microstencils se han aplicado con éxito con hPSCs. El reto con hPSCs micropatterning radica en su vulnerabilidad y un requisito estricto de matrices específicas extracelular (ECM) y condiciones de crecimiento para la fijación celular y la supervivencia. Para los patrones 2D HPSC, la impresión por microcontacto es uno de los métodos más comunes para generar micropatterns HPSC en cultivo de tejidos y de sustratos de vidrio 13. El método se puede utilizar para patrón ECM común utilizado en la cultura HPSC, incluyendo laminina y la membrana basal, tales como matrices de Matrigel. Sin embargo, se requiere típicamente un procedimiento de revestimiento de dos etapas con la ayuda de poli-D-lisina, y necesita condiciones atmosféricas inertes y humedad específicas para hacer micropatrones ECM estables para hPSCs para fijar en 6,13. La consideración más importante de cada método micropatterning es si el régimen de modificación de la superficie puede generar patrones de ECM HPSC-adhesivas en una resolución geométrica deseada al tiempo que minimiza la unión celular no específica a las zonas circundantes.
Aquí, se presenta el uso de la plantilla micropatterning como un método simple para generar micropatterns HPSC sin etapas adicionales de modificación de la superficie antes de la generación de patrones de ECM adhesivas para hPSCs para unir sucesivamente. La plantilla de célula comprende una membrana delgada, hoja por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), con micras a milímetro tamaño orificios pasantes selladas sobre un sustrato de cultivo de células para contener físicamente recubrimientos ECM y hPSCs posteriormente sembradas. Como patrón de la plantilla funciona restringiendo físicamente el lugar donde HPSC puede acceder y conectar directamente al sustrato ECM subyacente recubierto, este método es compatible con varios sustratos que pueden apoyar las culturas HPSC. Los únicos requirement es que la elección del material de la plantilla puede formar un cierre reversible con el sustrato. Estos sustratos incluyen poliestireno convencional de cultivo de tejidos (TCPS) 17, los sustratos conjugados de ligando 18, así como sustratos elastoméricos con rigidez sintonizable (por ejemplo., PDMS) 19. Este método también permite recubrimiento de diferentes ECM, tales como vitronectina (o proteína VTN), laminina y matrices de membrana basal (por ejemplo, Matrigel y Geltrax) para permitir la unión y la diferenciación de hPSCs adecuada. configuraciones ECM-sustrato, por lo tanto, podemos transferir optimizados para una línea específica para HPSC stencil Micropatterning para una óptima adhesión célula-matriz, la supervivencia y la diferenciación. Recientemente, también se ha informado de un método similar para dirigir la diferenciación hepática por hESCs Micropatterning utilizando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) matrices de micro-stencil 16.
stencils celulares pueden ser fabricados de diferentes materiales, incluyendo reunieronALS 20,21, poli (p-xilileno) polímeros 22,23, PMMA 16 y más comúnmente, PDMS 24-28. El silicio y el poli (p-xilileno) polímeros plantillas requieren el grabado directo de los orificios pasantes con equipo especializado 20 a 23, lo que limita su accesibilidad para los usuarios biológicos. PDMS plantillas pueden ser fabricados por diferentes métodos dependiendo del tamaño característica requerida, que varía típicamente de 3 micras a 2000 micras 11,26-29. Si se desean características pequeñas, hojas de estarcir delgadas se pueden producir mediante moldeo por prensado PDMS pre-polímero en una plantilla de silicio microfabricado que contiene relieves de los micropatrones 28. Para las funciones de> 1.000 micras, un cortador láser de CO 2 proporciona un método fácil y de bajo costo para reducir directamente los patrones en una hoja de PDMS pre-fundido durante la fabricación de la plantilla. El reciclado de las plantillas de PDMS también los hace rentable para llevar a cabo una serie de experimentos con suficiente consistencia.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Este protocolo describe la fabricación de PDMS plantilla con 1.000 micras patrones de corte por láser y micropatterning de la línea de células madre, H9 usando la plantilla de PDMS.
1. Diseño y fabricación de PDMS de la plantilla para Micropatterning
- El diseño de la hoja de colocación de letreros de agujeros pasantes de la geometría y el tamaño deseados (por ejemplo, 1.000 micras círculos) y la junta de la plantilla utilizando el software de diseño asistido por ordenador 10.
- Laser-cortar la hoja de colocación de letreros y la junta en 120-150 micras y 2 mm de espesor polidimetilsiloxano (PDMS) hojas, respectivamente, utilizando un láser de CO2-fresa 10.
- Unir la junta de PDMS con la hoja de la plantilla PDMS utilizando PDMS sin curar líquidos y horno a 60 ° C durante 3-4 h para obtener la plantilla de PDMS micropatterning.
- Esterilizar la plantilla PDMS en autoclave a 120 ° C durante 30 min y secado en un horno antes de su uso.
2. CMEh Principalmantenimiento
- Cultura de las líneas de células madre en un medio de mantenimiento sin alimentador de 1 × placas de cultivo celular recubierto de matriz de la membrana basal de células madre cualificado a 37 ° C y 5% de CO2.
- Pasaje la hESCs cuando son aproximadamente el 70% de confluencia en un 3 minutos de incubación a 37 ° C con dispasa tratamiento y disociar mecánicamente las colonias de células madre en 100-200 micras grumos. Placa de los grupos hESCs a una densidad de 30-50 grupos por 9,6 cm 2 de área de crecimiento en la membrana basal de la matriz recubierta de poliestireno de cultivo de tejido en relación de 1: 6 de división.
3. Plantilla Micropatterning de células estaminales embrionarias humanas
- Preparación previa a la celda patrón
- Sellar una plantilla de PDMS en una placa de Petri de 60 mm mediante la supresión de 700 l 70% de etanol grado analítico en agua ultrapura en la placa de Petri y la colocación de la plantilla en la parte superior.
- Coloque la placa de Petri en el interior de cabinas de seguridad durante la noche para permitir que tél etanol seco.
- Verificar existe ninguna burbuja debajo de la plantilla para asegurar que la plantilla se forma un buen sello con la placa de Petri. Esto evita las fugas de solución de recubrimiento ECM. Sellar la placa de Petri y almacenar bajo condiciones estériles hasta que esté listo para la siembra de células.
- Preparar alícuotas de matriz de membrana basal células madre cualificado de acuerdo con el certificado de análisis. Asegúrese de que cada uno de los rendimientos alícuota de 1 × solución matriz de la membrana basal células madre cualificado cuando se diluye en 25 ml de de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12) de acuerdo con la hoja de producto del fabricante.
- Preparar la solución de recubrimiento ECM mediante la adición de una alícuota de la matriz de la membrana basal células madre cualificado en 16,7 ml de DMEM / F12 para hacer 1,5 x solución matriz de la membrana basal células madre cualificado. Mantener toda la solución de revestimiento de ECM en hielo para evitar la gelificación.
- Suplemento medio de mantenimiento de células madre con 10 mM inhibidor ROCA (Y27632).
- El tratamiento de la placa de Petri con 100 WO 2 plasma durante 90 segundos. Para garantizar la esterilidad, sólo se abra la tapa de placa de Petri en el interior de la cámara de plasma antes del tratamiento de plasma, de forma rápida y cubrir de nuevo la placa de Petri después de la finalización del tratamiento. Esto facilita la humectación de la superficie y previene la formación de burbujas de aire en el micropatrón orificios pasantes durante la adición de solución de recubrimiento ECM.
- Añadir 450 l de solución de matriz de membrana basal células madre cualificado 1,5 × para cubrir la totalidad de la plantilla. Sellar la placa de Petri con una película auto-sellable, tal como Parafilm, para evitar que la solución se seque, y se incuba durante 5 horas a 37 ° C antes de su uso.
- CMEh de siembra sobre el sustrato estarcido
- Examine las colonias de células madre en la placa de 6 pocillos para identificar las áreas de células diferenciadas que muestra la pérdida de la morfología típica de células madre (por ejemplo, pérdida de redondeada, bien packed morfología epitelial, relación / citoplasma alta núcleo con nucléolos prominentes). Eliminar regiones diferenciadas utilizando un aspirador de vacío.
- Lavar dos veces con 2 ml de DMEM / F12 por pocillo.
- Añadir 1 ml de las enzimas digestivas, tales como Accutase, por pocillo de placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante 8 min. Golpear suavemente la placa para separar todas las colonias del sustrato.
- Enjuague cada pocillo con al menos 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de las enzimas digestivas y recoger la suspensión de células en 15 ml de tubo cónico.
- Centrifugar la suspensión celular a 200 g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Aspirar para eliminar el sobrenadante y añadir 400 l de medio de mantenimiento suplementado con células madre inhibidor ROCA (Rocki) para volver a suspender las células. Pipetear la suspensión de células arriba y abajo 3 veces con cuidado para romper grumos en células individuales.
- Mezclar el bien suspensión de células individuales y se diluye 10 l de muestras de células en 190 l de DMEM / F12 (1:20 dilución). Use un hemocytometer para determinar la densidad celular en la suspensión celular stock.
- Calcular la densidad de la siembra de células necesaria para una plantilla dada.
NOTA: Por ejemplo, se ha determinado experimentalmente la densidad de la siembra de células para obtener una monocapa confluente de células individuales es de aproximadamente 4.444 células / mm 2. Por lo tanto, una plantilla con una superficie de 450 mm 2 y el volumen de siembra de 400 l se requiere una suspensión de células a ser a una densidad de 2 millones de células / 400 l. - Se diluye la suspensión de células de valores para la densidad de siembra requerido (véase el paso 3.3.8 NOTA) con medio de cultivo suplementado con células madre Rocki.
- Añadir un volumen designado de suspensión de células que contiene el número requerido de células en cada plantilla y dejar la placa de Petri sin problemas en campana durante 5 min a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten.
- La transferencia de la placa de Petri en la incubadora y se incuba durante 1 hora para permitir para la fijación celular. Tenga cuidado de mantener el nivel de placa de Petri durante eltransferir proceso para que las células se mantienen como una monocapa en la plantilla.
- La eliminación de la plantilla y la pasivación del sustrato sin patrón
- Examinar la placa de Petri bajo un microscopio para verificar si las células están bien fijados en el sustrato subyacente.
- Aspirar distancia suspensión de células de la plantilla.
- Añadir 2 ml / placa de cultivo de células de 0,5% de tensioactivo no iónico compatible en DMEM / F12 a la zona que rodea a la plantilla.
- Use un par de pinzas tratadas en autoclave para pelar suavemente de la plantilla. Agitar la solución de tensioactivo no iónico como alrededor de la plantilla se despega para evitar que las células se sequen. observar visualmente las células micropatterned en la placa de Petri.
- Se incuban las células en solución micropatterned tensioactivo no iónico-DMEM / F12 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
- Aspirar la solución de distancia / F12 tensioactivo-DMEM no iónico. Lavar 3 veces con 2 ml / plato de DMEM / F12.
- Añadir 2 ml / placa de células madremedio de mantenimiento suplementado con Rocki e incubar a 37 ° C durante la noche.
- Después de la incubación durante la noche, aspirado hESC medio de mantenimiento suplementado con Rocki, lavar una vez con DMEM / F12 y inducir la diferenciación mesoendoderm añadiendo 2 ml / placa de medio de diferenciación suplementado con 100 ng / ml de activina, 25 ng / ml BMP4 y 10 ng / FGF2 ml .
- Evaluar los micropatterns utilizando imágenes de contraste de fase y calcular los perfiles promedio Brachyury (T) de intensidad para cada patrón como se describe anteriormente 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este trabajo se describe la fabricación de una plantilla de células mediante el uso de un cortador láser para generar 1.000 micras características. La plantilla se compone de 2 partes: una lámina delgada de letreros (aproximadamente 100-200 m de espesor) que contiene la microestructura agujeros pasantes, y una junta de PDMS para contener la solución de recubrimiento ECM o suspensión celular. Aquí, las hojas gruesas de PDMS comercialmente disponibles 127 micras y 2 mm se usaron como la hoja de estarcir y la junta respectivamente. Otros métodos para la preparación de hojas de PDMS de espesor controlable, tales como recubrimiento por rotación, también se pueden usar para fabricar las piezas. Los dos componentes se unen entre sí mediante el uso de mezcla de prepolímero-reticulante PDMS sin curar líquida como una unión adhesiva o de plasma, y al horno a 60 ° C durante 3-4 h (Fig. 1).
Se seleccionó el material para la hoja de estarcir sobre la base de la elección del cultivo celular substrate. Cuando se utiliza poliestireno de cultivo tisular convencional (TCPS) como el sustrato de cultivo, las plantillas de PDMS se pueden utilizar ya que el cumplimiento de la hoja de estarcir PDMS se forma un buen sello con el TCPS rígido (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). En los diseños experimentales en los que se desea investigar la heterogeneidad espacial de destino de las células madre en sustratos de cultivo celular más suaves, tales como PDMS sustratos elastoméricos con una gama sintonizable rigidez de 5 kPa a 2 MPa 30, se pueden emplear materiales más rígidos estarcen. A modo de ejemplo, hemos demostrado el uso de una plantilla de tereftalato de polietileno (PET) (E ~ 2 GPa) para generar de 1 mm de colonias HPSC micropatterned sobre sustrato PDMS más suave que tiene una rigidez de ~ 5 kPa (Fig. 2B). La plantilla de PET se fabrica pegando una junta de PDMS en una hoja de letreros hechos de películas de PET disponibles comercialmente (Fig. 2B, recuadro). Observamos que el tiempo de la unión celular requerida durante el micropatterningproceso fue más largo (~ 3 h) en el PDMS más suaves sustrato de rigidez ~ 5 kPa, en comparación con sustratos convencionales TCPS.
Nos hicieron uso de la plantilla micropatterned colonias de células madre para demostrar que la heterogeneidad espacial en la adhesión celular mediada por fuerzas mecánicas podrían patrón de diferenciación temprana mesoendoderm. Hemos demostrado previamente que H9 hESCs en la periferia colonia experimentó mayores adhesiones integrina que las células en el interior de colonias, lo que resultó en su diferenciación preferencial en Brachyury (T) -positivos células mesoendoderm cuando se induce con la activina, BMP4 y FGF2 31 (Fig. 3A ). Cuando las células fueron modeladas en diferentes geometrías (círculo, cuadrado, rectángulo y de arco de medio punto) a un área de la colonia constante, la anisotropía geométrica en las esquinas de los cuadrados, rectángulos y curvaturas convexas llevado a una concentración local de las fuerzas de tracción integrina mediada y dio lugar a un aumento de mesoendla diferenciación oderm 32,33. De hecho, por mapeo de intensidad expresión T en diferentes localidades dentro de una sola colonia, se encontró que la medida de la inducción mesoendoderm fue mayor en las esquinas agudas de colonias cuadrados y rectangulares (Fig. 3b) y en las curvaturas convexas de un arco semicircular (Fig . 3C), lo que correspondía a las regiones de estrés integrina mediada alto reportados en una geometría anisotrópica 32,33. Por lo tanto, micropatterning se puede utilizar para modular la distribución espacial de la adhesión celular mediada por fuerzas mecánicas dentro de una colonia HPSC intacto como un medio para controlar el proceso de diferenciación subsiguiente.
Figura 1. Generación de PDMS plantilla para micropatterning. (A) Esquema que representa los pasos críticos en la fabricación de la plantilla. Una hoja de 127 micras de espesor PDMS era laSer-cortó para producir los patrones diseñados, y otro 2 mm de espesor de hoja de PDMS fue cortada en láser para producir la junta. Estos dos componentes se unen entre sí con PDMS no curadas para montar la plantilla. (B) Las imágenes que muestra el montaje de los componentes para formar una plantilla de PDMS con 1 mm de circular a través de los agujeros. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. colonias de células madre micropatterned (1.000 m círculos) en diferentes sustratos de cultivo. Las imágenes microscópicas de células madre colonia micropattern inmediatamente después de la eliminación de PDMS (A) plantillas (recuadro) utilizados para generar células madre micropatterns sobre sustratos rígidos, por ejemplo, de la rigidez TCPS ~ 2 GPa, y (b) las plantillas de PET (recuadro) Que se utiliza para generar micropatterns sobre sustratos más blandos, por ejemplo, PDMS de la rigidez ~ 5 kPa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Efecto de micropatterns de células madre de diferentes formas geométricas en su diferenciación mesoendoderm 8. (A) micropatterns de células madre de diferentes formas geométricas, sino misma área de la colonia se generaron utilizando PDMS plantillas. Las imágenes de fase (panel superior) y mapas de intensidad de la expresión T (panel inferior) después de 24 horas de diferenciación mesoendoderm. (B) perfiles de intensidad media T (a lo largo de las líneas de puntos blancos en (A)) en colonias circulares isométricos o cuadrada anisométrico y colonias rectangulares . Todas las colonias tenían la misma zona ex CEPT el círculo 50%, que tenía un medio de la área de la colonia. (C) perfiles de intensidad media de T de la parte cóncava o bordes convexos hacia el interior de colonias en un arco semi-circular, como se indica por líneas de puntos blancos en (A). Cada perfil de intensidad en (BC) es un promedio de 16 perfiles de intensidad obtenida a partir de 4 colonias. Las imágenes se imprimen de nuevo con el permiso de Toh et. al., 8. Barra de escala = 200 micras y RFU es la unidad relativa de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Representación esquemática del flujo de trabajo para micropattern colonias de células madre e inducir la diferenciación. Los pasos clave para la generación exitosa de micropatterns de células madre se destacan en recuadros de color gris..com / archivos / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La fabricación de plantillas Micropatterning
micropatterning de la plantilla proporciona un método ideal para generar micropatterns HPSC para la investigación de nicho mediada por los patrones de diferenciación. La principal ventaja de los patrones de la plantilla sobre otras técnicas micropatterning, tales como impresión por microcontacto y photopatterning, es que no requiere modificación de la superficie y puede ser implementado sobre sustratos TCPS convencionales. Por lo tanto, los medios de cultivo optimizados y recubrimientos de ECM para diferentes líneas HPSC se pueden transferir fácilmente a stencil micropatterning.
Hay una serie de pasos clave durante la fabricación de la plantilla de células que contribuyen a la generación de buenas micropatrones. La fidelidad de la reproducción de las geometrías diseñadas en los micropatterns HPSC depende de la calidad y consistencia de la fabricación a través de hoyos en la hoja de colocación de letreros. Para estudios que envuelve micropat multicelularcharranes de> 1.000 micras, los orificios pasantes pueden ser fabricados directamente por corte con láser en una hoja de PDMS pre-fundido. La resolución de corte por láser depende de el tamaño del punto del rayo láser y la precisión de la etapa mecánica el control de la trayectoria del haz de láser. Para los cortadores de CO2 láser convencionales, encontramos que puede producir rasgos circulares o curvas con buena fidelidad pero no geometrías con esquinas agudas (por ejemplo., Cuadrado). En aplicaciones donde se desean pequeñas características o afilados, los orificios pasantes en la hoja de estarcir pueden ser fabricados por moldeo de PDMS en una plantilla de silicio microfabricado que contiene relieves de los micropatrones 28. El reto del método de moldeo es producir micro-tamaño-a través de agujeros en hojas delgadas de PDMS sin PDMS residuales sobre los relieves de la plantilla de silicio. Varias estrategias se han desarrollado para hacer frente a este problema como se describe por Li et. al. 28
Durante el comoblea de la hoja de colocación de letreros y la junta para producir la plantilla de células, uno debe asegurarse de que la hoja de estarcir es plana y libre de polvo durante el proceso de unión con el fin de evitar fugas de la plantilla. El pandeo de la hoja de estarcir durante el proceso de unión puede comprometer el sellado de la plantilla para el sustrato de cultivo, causando soluciones de ECM y de la célula a fugas de la microestructura a través de agujeros pasantes. La plantilla debe ser esterilizado en autoclave (120 ° C, 30 min) y se secó a fondo en un horno para asegurarse de que puede formar un buen sello con el sustrato de cultivo.
Otro factor importante es la selección del material de lámina estarcir. La plantilla de PDMS es ideal para hPSCs micropatterning sobre sustratos de cultivo rígidos, tales como TCPS con una rigidez de ~ 2 GPa. Sin embargo, si se desea micropattern hPSCs sobre sustratos más blandos, tales como el PDMS sustratos comúnmente utilizados para la rigidez del sustrato celular sintonizar 34, el cumplimiento de un PDMShoja de estarcir hará que sea más difícil de pelar la plantilla después de que el proceso de la siembra de células, por lo tanto, la destrucción de los micropatterns HPSC. En este caso, la elección de material para la hoja de estarcir de la plantilla se debe seleccionar de manera que puede formar un sello con el sustrato de cultivo, pero se puede desprender con facilidad.
Micropatterns generadora HPSC
El protocolo para micropatterning H9 hESCs sobre sustratos TCPS usando una plantilla PDMS que aquí se presenta ha sido optimizado para lograr una colonia confluente con buena viabilidad celular y la fidelidad de patrones. Es esencial que los hPSCs forman interacciones célula-célula y célula-matriz adecuados dentro del confinamiento espacial de una geometría particular, definido por los micropatterns para que se pueda investigar cómo los factores dependientes de la geometría influyen destino de diferenciación. Hemos identificado algunos pasos críticos para generar con éxito micropatterns HPSC (Fig. 4)y que se discuten como sigue.
En primer lugar, la calidad de la cultura HPSC importa. Es importante para cosechar las colonias HPSC a 70-80% de confluencia, con la mayoría de las colonias que muestran la morfología de HPSC indiferenciada mientras que la eliminación de las áreas diferenciadas. Over-confluente culturas HPSC suelen causar diferenciación espontánea, y si las áreas diferenciadas no se eliminan antes de la siembra de células, las células diferenciadas se interrumpen la formación normal de patrón de diferenciación.
En segundo lugar, cuando la cosecha colonias HPSC a la suspensión de una sola célula, evitando el exceso de tratamiento con enzimas digestivas es fundamental porque esto a menudo resulta en la muerte celular después de la incubación durante la noche, incluso si las células pueden adherirse al principio. Se encontró que 8 minutos de tratamiento enzimático es óptimo para la línea H9 células madre cultivadas en el laboratorio; aunque se recomienda que el tiempo de tratamiento desprendimiento de las células debe ser optimizado por separado para diferentes líneas celulares.
Por último, existe una necesidad de pasivar el sustrato que rodea a los micropatrones HPSC con moléculas adhesivas no de células con el fin de limitar la proliferación o diferenciación de las células dentro de la microestructura. Esto es esencial para mantener la fidelidad de la microestructura HPSC, ya su vez, el gradiente ambiental bioquímica y mecánica de patrones de diferenciación se desarrolle. Cultivo de células tensioactivos no iónicos compatibles, tales como Pluronic F-127 se pueden utilizar como un agente de pasivación. Cuando la pasivación con tensioactivos, el tiempo de tratamiento y la concentración debe ser optimizado debido a la citotoxicidad del agente tensioactivo en una larga exposición. Como hemos comentado anteriormente, el protocolo presentado proporciona una guía detallada para micropattern hPSCs utilizando una plantilla de PDMS, pero la optimización de este protocolo, especialmente para los pasos críticos anteriores, se le anima a successfully generar micropatterns HPSC.
Una limitación de micropatterning plantilla es que es más adecuado para la generación de micropatrones más grandes que van desde 100-1,500 micras. Para generar muy pequeñas características previstas para el patrón de una sola célula, la fabricación de láminas de letreros con agujeros a través de <-50 micras es muy difícil como se mencionó anteriormente. Por lo tanto, esperamos que el uso del stencil hPSCs micropatterned es muy adecuado para investigar la formación de patrones de tejidos multicelulares durante los diferentes procesos de desarrollo (por ejemplo, plegables o neuroepitelio de modelado endodermo).
Mediante el uso de micropatterning para confinar geométricamente una población HPSC, podemos establecer la adhesión celular mediada 10 y paracrinos gradientes de señalización mecánica 6 para controlar y entender la organización espacial de los destinos de diferenciación resultantes. Estos modelos micropatterned HPSC con differentiatio espacialmente organizadan puede a su vez se traduce en modelos humanos específicos de la enfermedad o de detección teratógeno 11 para defectos congénitos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por NUS Puesta en marcha de subvención (R-397-000-192-133) y el Fondo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS es un erudito NUS Investigación. Los autores desean agradecer a la Dra Jiangwa Xing por su apoyo técnico en micropatterning celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
