Summary
Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) har den iboende evne til å differensiere og selvtillit organisere inn i forskjellige vev mønstre; selv om dette krever presentasjon av romlige miljø gradienter. Vi presenterer sjablong micropatterning som en enkel og robust metode for å generere biokjemiske og mekaniske gradienter for å styre hPSC differensieringsmønster.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), allment utnyttes i regenerativ medisin samt eksperimentelle modellering av normal og sykelig organogenese på grunn av deres differensiering potensial inn i cellen linjer av alle tre bakterie lag 1,2. Differensieringen skjebne hPSCs er svært følsomme for lokale miljøfaktorer som kan modulerer autokrine eller parakrine signaliserer en samt mechanotransduction prosesser mediert av fysiske signaler 3-5. Cell micropatterning omfatter et sett av teknikker som er utviklet for å romlig organisere geometri og plassering av en cellepopulasjon som et middel for å kontrollere den lokale mobilmikromiljøet, slik som celle-celle interaksjoner 6 og celle-matriks interaksjoner 3. I sammenheng med hPSCs har celle micropatterning vært ansatt for å oppnå betydelige innsikt i hvordan nisje-avhengigeent autokrint signale modulerer hESC pluripotency-differensiering beslutninger 7 og organisasjon i tidlig embryonale differensieringsmønster 6. 2D og 3D micropatterned hPSCs har blitt brukt til å styre kolonien størrelsen på flercellede mønstre, som i sin tur påvirket differensiering beslutninger i de tre bakterie lag 8,9. Vi har anvendt flercellede hPSC micropatterns å modulere den grad av celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger innenfor et hPSC koloni å undersøke hvordan integrin-E-cadherin krysstale kan gi opphav til celle skjebne heterogenitet 10. Demonstrasjonene fra de ovennevnte rapporter åpne nye veier mot anvendelsen av flercellede micropatterns av hPSCs som eksperimentelle modeller for narkotika toksisitet screening for utviklings sykdommer 11, for å studere effekten av vekstfaktorer og hormoner i løpet av vev eller organ utvikling, og å rakne dannelsen av vev mønstre.
En myriade av celle micropatterNing teknikker har blitt utviklet som anmeldt av Falconnet et. al. 12, men bare en håndfull, for eksempel mikro-kontakt utskrift 7,8,13, mikrokultur 14,15, photopatterning 6 og microstencils 16 har blitt implementert med hPSCs. Utfordringen med micropatterning hPSCs ligger i deres sårbarhet og strenge krav om konkrete ekstracellulære matriser (ECM) og vekstvilkår for cellebinding og overlevelse. For 2D hPSC mønstre, er mikro-kontakt utskrift en av de vanligste metodene for å generere hPSC micropatterns på vev kultur og glass underlag 13. Fremgangsmåten kan brukes til å påføre mønster felles ECM som brukes i hPSC kultur, inkludert laminin og basalmembran matriser, slik som Matrigel. Imidlertid, er det vanligvis krever en totrinns belegningsprosess hjulpet av poly-D-lysin, og trenger spesielle inerte atmosfæriske og fuktighetsforhold for å lage stabile ECM micropatterns for hPSCs å feste på 6,13. Den fremste hensyn til hver micropatterning metode er om overflaten ombygging regime kan generere hPSC-lim ECM mønstre på ønsket geometrisk oppløsning mens uspesifikke cellebinding minimere til de omkringliggende områdene.
Her rapporterer vi bruk av sjablongen micropatterning som en enkel metode for å generere hPSC micropatterns uten ytterligere overflatemodifikasjonstrinn før generering av selvklebende ECM mønstre for hPSCs å feste på. Cellen sjablongen består av en tynn membran, for eksempel polydimetylsiloksan (PDMS) ark, med mikron til millimeter størrelse, gjennomgående hull forseglet på en cellekultur substrat for fysisk å inneholde ECM belegg og deretter sådd hPSCs. Som sjablong mønster virker ved fysisk tilbakeholdende det sted hvor hPSC kan få tilgang til og festes direkte på den underliggende ECM belagte substrat, er denne metode som er kompatibel med forskjellige substrater som kan støtte hPSC kulturer. De eneste requirement er at valg av sjablongen materiale kan danne en reversibel tetning med substratet. Disse substrater inkluderer konvensjonelle vevskulturpolystyren (TCPS) 17, ligand-konjugerte substrater 18, samt elastomere substrater med avstembar stivhet (f.eks., PDMS) 19. Denne metoden gir også belegg av forskjellig ECM, som vitronectin (eller VTN protein), laminin og basalmembran matriser (f.eks Matrigel og Geltrax) for å få riktig feste og differensiering av hPSCs. Derfor kan vi overføre optimalisert ECM-substrat konfigurasjoner for en bestemt hPSC linje til sjablong micropatterning for optimal celle-matrix adhesjon, overlevelse og differensiering. Nylig har en lignende metode også blitt rapportert til å dirigere hepatisk differensiering av micropatterning hESCs ved hjelp av poly (metylmetakrylat) (PMMA) mikro sjablong matriser 16.
Celle sjablonger kan fremstilles av forskjellige materialer, inkludert møttals 20,21, poly (p-xylylen) polymerer 22,23, PMMA 16 og mest, PDMS 24-28. Silisium og poly (p-xylylen) polymerer sjabloner krever direkte etsning av de gjennomgående hullene med spesialutstyr 20-23, noe som begrenser deres biologiske tilgjengelighet til brukerne. PDMS sjabloner kan fremstilles ved forskjellige metoder, avhengig av trekkstørrelse nødvendig, noe som er typisk i området fra 3 mikrometer til 2000 mikrometer 11,26-29. Hvis små funksjoner er ønskelig, kan tynne spraye plater produseres ved trykk molding PDMS pre-polymer på en microfabricated silisium mal som inneholder relieffer av de micropatterns 28. For funksjoner> 1000 mikrometer, gir et CO 2 laser cutter en enkel og rimelig metode for å direkte kutte mønstrene på en pre-støpt PDMS ark under sjablongen fabrikasjon. Den resirkulering av PDMS sjablonger gjør dem også kostnadseffektivt å gjennomføre en rekke eksperimenter med tilstrekkelig konsistens.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen beskriver fabrikasjon av PDMS sjablong med 1000 mikrometer mønstre av laserskjæring og micropatterning av hESC linje, H9 bruke PDMS sjablong.
1. Design og fabrikasjon av PDMS Stencil for Micropatterning
- Design spraye arket med gjennomgående hull med ønsket geometri og størrelse (f.eks 1000 mikrometer sirkler) og sjablongen pakning bruker dataassistert design software 10.
- Laser-kutt spraye arket og pakning på 120-150 nm og 2 mm tykk polydimetylsiloksan (PDMS) ark henholdsvis ved hjelp av en CO 2 laser-cutter 10.
- Binde PDMS pakning med PDMS stensilarket ved hjelp av flytende uherdet PDMS og stek ved 60 ° C i 3-4 timer for å oppnå den PDMS sjablongen for micropatterning.
- Steriliser PDMS stensilen ved autoklavering ved 120 ° C i 30 minutter og tørking i en ovn før anvendelse.
2. hESCs Hovedvedlikehold
- Kultur de hESC linjer i en mater fritt vedlikehold medium på 1 × hESC kvalifiserte basalmembranmatrise belagt cellekulturplater ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Passasje de hESCs når de er omtrent 70% sammenflytende etter 3 minutters inkubering ved 37 ° C med dispase behandling og mekanisk dissosiering de hESC koloniene til 100-200 um klumper. Plate hESCs klumper med en tetthet på 30-50 klumper per 9,6 cm2 vekstområde på basalmembran matriks-belagt vevskulturpolystyren ved 1: 6 spalteforholdet.
3. Stencil Micropatterning av humane embryonale stamceller
- Forberedelse før celle mønster
- Forsegle en PDMS sjablong på en 60 mm petriskål ved å dispensere 700 mL 70% analytisk kvalitet etanol i ultrarent vann i petriskål og plassere sjablongen på toppen.
- Sett petriskål inne biosikkerhet skap over natten for å la than etanol tørr.
- Sjekk ingen boble finnes under sjablongen for å sikre at sjablongen danner en god tetning med petriskål. Dette hindrer lekkasjer av ECM belegg løsning. Tett petriskål og butikk under sterile forhold før den er klar for celle seeding.
- Forbered prøver av hESC kvalifiserte basalmembran matrix ifølge analysesertifikat. Sørg for at hver prøve gir 1 × hESC kvalifiserte basalmembran matrix løsning når fortynnet i 25 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Blanding F-12 (DMEM / F12) i henhold til produsentens produktarket.
- Klargjør ECM belegg løsning ved å legge til en delmengde av hESC kvalifiserte basalmembran matrix til 16,7 ml DMEM / F12 for å lage 1,5 × hESC kvalifiserte basalmembran matrix løsning. Hold alle ECM belegg løsning på is for å hindre gelering.
- Supplement hESC vedlikehold medium med 10 mm ROCK hemmer (Y27632).
- Unn petriskål med 100 WO to plasma for 90 sek. For å sikre sterilitet, bare åpne petriskål deksel inne i plasmakammeret før plasmabehandling, og raskt dekke tilbake petriskålen etter avslutningen av behandlingen. Dette letter overflatefuktende og hindrer at luftbobledannelse i den micropattern gjennomgående hull under tilsetningen av ECM beleggoppløsning.
- Legg 450 mL av 1,5 × hESC kvalifiserte basalmembran matrix løsning for å dekke hele sjablongen. Tett petriskål med selv-forseglbar film, slik som Parafilm, for å hindre at oppløsningen tørker ut, og inkuberes i 5 timer ved 37 ° C før bruk.
- Seeding hESCs ut mot stensilert underlaget
- Undersøk hESC kolonier i seks-brønns plate for å identifisere de differensierte celleområder som viser tap av typiske hESC morfologi (f.eks tap av avrundet, tett packed epitelial morfologi, høy kjerne / cytoplasma ratio med fremtredende nucleoli). Fjern differensierte områder ved hjelp av et vakuum aspirator.
- Vask to ganger med 2 ml DMEM / F12 per brønn.
- Tilsett 1 ml av fordøyelsesenzymer, slik som Accutase, per brønn av seks-brønners plate og inkuberes ved 37 ° C i 8 min. Trykk platen forsiktig for å løsne alle kolonier fra underlaget.
- Skylle hver brønn med minst 4 ml DMEM / F12 per 1 ml av fordøyelsesenzymer og samle opp cellesuspensjonen inn i 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer for å fjerne supernatanten og tilsett 400 ul av hESC opprettholdelsesmedium supplert med ROCK inhibitor (Rocki) for å resuspendere cellene. Pipetter cellesuspensjonen opp og ned 3 ganger forsiktig å bryte klumper i enkeltceller.
- Bland enkeltcellesuspensjonen godt og fortynne 10 pl av celleprøver inn i 190 ul DMEM / F12 (1:20 fortynning). Bruk en hemocytometer for å bestemme celletetthet på lager cellesuspensjonen.
- Beregne den nødvendige celle seeding tetthet for en gitt sjablong.
MERK: For eksempel har vi eksperimentelt bestemte cellen seeding tetthet for å oppnå en konfluent monolag av enkeltceller er ca 4.444 celler / mm 2. Således vil en stensil med et areal på 450 mm2 og seeding volum på 400 pl krever en cellesuspensjon for å være ved en tetthet på 2 millioner celler / 400 ul. - Fortynn aksjen cellesuspensjon til ønsket seeding tetthet (se trinn 3.3.8 NB) med hESC kultur medium supplert med Rocki.
- Legg til en bestemt volum av cellesuspensjon inneholdende det nødvendige antall celler i hver sjablong og la petriskål uforstyrret i hetten i 5 minutter ved romtemperatur for å tillate cellene å slå seg.
- Overfør petriskål inn i inkubator og inkuberes i 1 time for å muliggjøre cellefesting. Vær nøye med å holde petriskål nivå underoverføre prosessen slik at cellene forblir som et monolag i sjablongen.
- Stencil fjerning og passivisering av unpatterned substrat
- Undersøk petriskål under et mikroskop for å se om cellene er skikkelig festet til det underliggende substrat.
- Aspirer bort cellesuspensjon fra sjablongen.
- Tilsett 2 ml / skål av 0,5% cellekultur kompatibelt ikke-ionisk overflateaktivt middel i DMEM / F12 til området rundt sjablongen.
- Bruk et par autoklaveres pinsett for å forsiktig skrelle av sjablongen. Virvle ikke-ioniske overflateaktive løsning rundt som sjablongen er skrellet av for å hindre cellene i å tørke ut. Visuelt observere micropatterned-celler i petriskål.
- Inkuber micropatterned-celler i 0,5% ikke-ionisk overflateaktivt middel-DMEM / F12-løsning i 10 min ved 37 ° C.
- Aspirer bort det ikke-ioniske overflateaktive middel-DMEM / F12 løsning. Vask 3 ganger med 2 ml / skål av DMEM / F12.
- Tilsett 2 ml / skål av hESCopprettholdelsesmedium supplert med Rocki og inkuber ved 37 ° C over natten.
- Etter inkubering over natten, aspirere hESC opprettholdelsesmedium supplert med Rocki, vaskes en gang med DMEM / F12 og induserer mesoendoderm differensiering ved å tilsette 2 ml / skål av differensieringsmedium supplert med 100 ng / ml aktivin, 25 ng / ml BMP4 og 10 ng / ml FGF2 .
- Vurdere micropatterns bruker fasekontrast bildebehandling og beregne gjennomsnitts Brachyury (T) belastningsprofiler for hvert mønster som beskrevet tidligere åtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen beskriver vi fabrikasjon av en celle sjablong ved hjelp av en laser cutter å generere 1000 mikrometer funksjoner. Sjablongen var sammensatt av 2 deler: en tynn spraye ark (ca. 100-200 mikrometer tykk) inneholdende micropattern gjennomgående hull, og et PDMS pakning for å inneholde den ECM beleggløsningen eller cellesuspensjon. Her ble 127 mikrometer og 2 mm tykke kommersielt tilgjengelige PDMS ark anvendes som spraye ark og pakning henholdsvis. Andre fremgangsmåter for fremstilling av PDMS ark med kontrollerbar tykkelse, såsom spinnbelegging, kan også brukes til å fremstille delene. De to komponenter ble bundet sammen ved hjelp av flytende uherdet PDMS prepolymer-tverrbindingsblanding som et klebemiddel eller plasma binding, og bakt ved 60 ° C i 3-4 timer (fig. 1).
Materialet for spraye arket ble valgt basert på valg av cellekulturen substrate. Ved bruk av konvensjonelle vevskulturpolystyren (TCPS) som dyrkingssubstratet kan PDMS sjabloner brukes siden den overholdelse av PDMS spraye arket vil danne en god tetning med det stive TCPS (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). I eksperimentelle design hvor man ønsker å undersøke romlig heterogenitet av stamcelle skjebne på mykere cellekultur substrater, slik som elastomere PDMS substrater med en fleksibel stivhet område på 5 kPa til 2 MPa 30 kan stivere spraye materialer anvendes. Som et eksempel, demonstrerte vi bruken av en polyetylentereftalat (PET) sjablong (E ~ 2 GPa) for å generere 1 mm micropatterned hPSC kolonier på mykere PDMS substrat som har en stivhet på ~ 5 kPa (Fig. 2B). PET sjablong ble fabrikkert ved å lime en PDMS pakningen på en spraye ark laget av kommersielt tilgjengelige PET film (Fig. 2B, innfelt). Vi merker oss at den nødvendige cellebinding tid under micropatterningProsessen var lengre (~ 3 timer) på den mykere PDMS substratet av stivhet ~ 5 kPa i forhold til konvensjonelle TCPS substrater.
Vi utnyttet sjablong micropatterned hESC kolonier å vise at romlig heterogenitet i celle-adhesjon mediert mekaniske krefter kunne mønster tidlig mesoendoderm differensiering. Vi har tidligere vist at H9 hESCs på kolonien periferien opplevde høyere integrin voksninger enn celler i kolonien interiør, noe som resulterte i sin fortrinnsrett differensiering i Brachyury (T) -positive mesoendoderm celler når indusert med activin, BMP4 og FGF2 31 (Fig. 3A ). Når cellene ble mønstret i forskjellige geometrier (sirkel, kvadrat, rektangel og halvsirkelformet bue) ved konstant koloni område, geometriske anisotropi i hjørnene av kvadrater, rektangler og konvekse krumninger førte til en lokal konsentrasjon av integrin-medierte trekkrefter og resulterte i økt mesoendoderm differensiering 32,33. Faktisk, ved å kartlegge T ekspresjon intensitet på forskjellige steder innenfor et enkelt koloni, har vi funnet at omfanget av mesoendoderm induksjon var høyere i skarpe hjørner av kvadratiske og rektangulære kolonier (fig. 3B) og ved konvekse krumninger av en semi-sirkulær bue (fig . 3C), som tilsvarte rapporterte høye integrin-mediert stresset regioner i en anisotropisk geometri 32,33. Derfor kan micropatterning brukes til å modulere den romlige fordelingen av celle adhesjon mediert mekaniske krefter innenfor en intakt hPSC koloni som et middel til å kontrollere den etterfølgende differensieringsprosessen.
Figur 1. Generering av PDMS sjablong for micropatterning. (A) Skjematisk representerer kritiske trinn i sjablongen fabrikasjon. En 127 mikrometer tykke PDMS arket var laSer-kuttet for å fremstille de utformede mønstre, og en annen 2 mm tykk plate PDMS ble laserskåret for å produsere pakningen. Disse to komponentene ble bundet sammen med uherdet PDMS å montere sjablongen. (B) viser montering av komponenter til en PDMS sjablong med 1 mm sirkulært gjennom hullene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Micropatterned hESC kolonier (1000 mikrometer sirkler) på ulike kultur underlag. Mikroskopiske bilder av hESC micropattern koloni umiddelbart etter fjerning av (A) PDMS sjablonger (innfelt) som brukes til å generere hESC micropatterns på stive underlag, for eksempel, TCPS av stivhet ~ 2 GPa, og (B) PET sjablonger (innfelt) Som brukes til å generere micropatterns på mykere underlag, for eksempel, PDMS av stivhet ~ 5 kPa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Effekt av hESC micropatterns av ulike geometriske figurer på sin mesoendoderm differensiering 8. (A) hESC micropatterns av forskjellige geometriske former, men samme koloni området ble generert ved hjelp av PDMS sjablonger. Fase bilder (topp panel) og intensitet kart over T uttrykk (nedre panel) etter 24 timers of mesoendoderm differensiering. (B) Gjennomsnittlig T belastningsprofiler (langs hvite stiplede linjer i (A)) i isometriske sirkulære kolonier eller anisometric kvadratiske og rektangulære kolonier . Alle kolonier hadde samme område ex CEPT 50% sirkel, som hadde halvparten av kolonien området. (C) Gjennomsnittlig T belastningsprofiler fra den konkave eller konvekse kanter inn i det indre koloni i en semi-sirkulær bue, som indikert med hvite stiplede linjer i (A). Hver intensitetsprofil (BC) er et gjennomsnitt av 16 belastningsprofiler oppnådd fra 4 kolonier. Bildene er gjen trykt med tillatelse fra Toh et. al., 8. Scale bar = 200 mikrometer og RFU er relativ fluorescens enhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten til micropattern hESC kolonier og indusere differensiering. Viktige skritt for vellykket generasjon av hESC micropatterns er uthevet i grå ruter..com / filer / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fabrikasjon av micropatterning sjablonger
Stencil micropatterning gir en ideell metode for å generere hPSC micropatterns for å undersøke nisje-mediert differensiering mønster. Den viktigste fordelen med sjablongen mønster i forhold til andre micropatterning teknikker, slik som mikrokontakttrykking og photopatterning, er at den ikke krever overflatemodifisering og kan implementeres på konvensjonelle TCPS substrater. Derfor kan optimaliserte dyrkningsmedier og ECM belegg for ulike hPSC linjer lett overføres til sjablong micropatterning.
Det finnes en rekke viktige trinn under fremstillingen av cellen sjablong som bidrar til genereringen av gode micropatterns. Troskap gjengi de utformede geometrier i hPSC micropatterns er avhengig av kvaliteten og konsistensen av gjennomgående hull fabrikasjon i spraye arket. For studier med flercellet micropatterner av> 1000 mikrometer, det gjennomgående hull kan være direkte fabrikkert av laserskjæring på en pre-støpt PDMS ark. Oppløsningen av laserskjæring er avhengig av punktstørrelsen av laserstrålen og presisjonen av den mekaniske trinnet som styrer banen til laserstrålen. For konvensjonelle CO 2 laser cutters, fant vi at det kan produsere runde eller buede funksjoner med god troskap, men ikke geometrier med skarpe hjørner (f.eks., Firkant). I anvendelser hvor små eller skarpe egenskaper er ønsket, de gjennomgående hullene i spraye arket kan fremstilles ved å støpe PDMS på en microfabricated silisium templat inneholdende relieffer av de micropatterns 28. Utfordringen av støpemetode er å produsere mikrostørrelse gjennomgående hull i tynne PDMS ark uten rest PDMS over silisium mal relieffer. Flere strategier er blitt utviklet for å løse dette problemet, som beskrevet av Li et. al. 28
Under somgrammeringsgrensesnittet av spraye platen og pakningen for å produsere celle sjablongen, bør man sørge for at spraye arket er flatt og fritt for støv under bindingsprosessen for å hindre lekkasjer fra sjablongen. Knekking av den spraye arket under bindingsprosessen kan kompromittere tetningen av sjablongen for å dyrkingssubstratet, forårsaker ECM og celle løsninger for å lekke fra micropattern gjennomgående hullene. Sjablongen bør steriliseres ved autoklavering (120 ° C, 30 min) og grundig tørket i en ovn for å sikre at den kan danne en god tetning med kulturen substratet.
En annen viktig faktor er valget av spraye platemateriale. PDMS sjablong er ideell for micropatterning hPSCs ut mot stive kultur underlag, som TCPS med en stivhet på ~ 2 GPa. Men hvis man ønsker å micropattern hPSCs bort på mykere underlag, for eksempel på PDMS underlag som vanligvis brukes til å tune celle underlaget stivhet 34, overholdelse av en PDMSspraye arket vil gjøre det vanskelig å skrelle av sjablongen etter celle seeding prosessen, derfor ødelegge hPSC micropatterns. I dette tilfellet må det materialvalg for spraye ark av sjablongen velges slik at det kan danne en tetning med dyrkingssubstratet men kan skrelles av med letthet.
Generering hPSC micropatterns
Protokollen for micropatterning H9 hESCs på TCPS underlag ved hjelp av en PDMS sjablong som presenteres her er optimalisert for å oppnå en konfluent koloni med god celle levedyktighet og mønster troskap. Det er vesentlig at hPSCs danner riktige celle-celle og celle-matriks-interaksjoner i den romlige begrensningen av en spesiell geometri definert ved micropatterns, slik at man kan undersøke hvordan geometri avhengige faktorer som påvirker differensiering skjebner. Vi har identifisert noen viktige skritt for å lykkes generere hPSC micropatterns (Fig. 4)og de er omtalt som følger.
Først kvaliteten på hPSC kultur teller. Det er viktig å høste hPSC koloniene ved 70-80% konfluens, med flertall av kolonier som viser udifferensiert hPSC morfologi under fjerning av de differensierte områdene. Over-konfluent hPSC kulturer vanligvis føre til spontan differensiering, og hvis de differensierte områder som ikke blir fjernet før celle seeding, vil de differensierte celler forstyrre normal differensiering mønster formasjon.
For det andre, når høsting hPSC kolonier til enkeltcellesuspensjon, og unngå overbehandling med fordøyelsesenzymer er kritisk fordi dette ofte resulterer i celledød etter inkubering over natten, selv om cellene kan feste i utgangspunktet. Vi fant at 8 minutter av enzymatisk behandling er optimalt for H9 hESC linje dyrket i vårt laboratorium; men vi anbefaler at cellen avløsning behandlingstiden skal være optimalisert separat for ulike cellelinjer.
Endelig er det et behov for å passivere substratet som omgir hPSC micropatterns med ikke-celle-adhesive molekyler for å begrense former eller differensiering av celler til innenfor micropattern. Dette er viktig for å opprettholde kvaliteten til den hPSC micropattern, og i sin tur, for å utvikle den biokjemiske og mekaniske miljø gradient for differensieringsmønster. Cellekultur kompatible ikke-ioniske overflateaktive midler, slik som Pluronic F-127 kan anvendes som et passiveringsmiddel. Når passive med overflateaktive midler, bør behandlingstiden og konsentrasjonen være optimalisert på grunn av overflateaktivt middel er cytotoksisitet ved lang eksponering. Som vi snakket om ovenfor, gir det fremlagte protokollen en detaljert veiledning for å micropattern hPSCs ved hjelp av en PDMS sjablong, men optimalisering av denne protokollen, spesielt for de ovennevnte kritiske trinn, oppfordres til successfully generere hPSC micropatterns.
En begrensning av sjablongen micropatterning er at det er mer egnet for å generere større micropatterns som strekker seg fra 100-1,500 um. For å generere svært små funksjoner beregnet for enkelt celle mønster, fabrikasjon av spraye ark med <50 mikrometer gjennom-hull er svært utfordrende som nevnt tidligere. Derfor forventer vi at bruk av sjablong micropatterned hPSCs er godt egnet til å undersøke flercellet vevet mønster formasjon under ulike utviklingsprosessene (f.eks neuroepithelium folding eller endoderm mønster).
Ved å bruke micropatterning til geometrisk begrense en hPSC befolkning, kan vi slå fast celle-adhesjon mediert mekaniske 10 og parakrine signal gradienter 6 for å styre og forstå den romlige organiseringen av de resulterende differensierings skjebner. Disse micropatterned hPSC modeller med romlig organisert differentiation kan i sin tur bli oversatt til menneske spesifikk sykdom eller teratogen screening modeller 11 for medfødte misdannelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NUS Oppstart stipend (R-397-000-192-133) og ETPL Gap fondet (R-397-000-198-592). GS er en NUS Forskning lærd. Forfatterne ønsker å takke dr Jiangwa Xing for henne teknisk support på celle micropatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
